引用本文： 畢雪, 陳松, 林錦鏞, 王玉川. 不同途徑移植人臍帶間充質干細胞對糖尿病大鼠視網膜病變的影響. 中華眼底病雜志, 2014, 30(2): 166-170. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.02.012 復制
糖尿病視網膜病變(DR)是以視網膜脈管系統崩解和神經元功能紊亂為特征的致盲性眼底疾病[1, 2]。抗血管內皮生長因子(VEGF)藥物雖然能夠改善DR引起的血視網膜屏障損傷，但重復注射會造成視網膜神經細胞的毒性損害[3]。間充質干細胞(MSC)因其具有較強的自我更新能力和多向分化潛能而受到廣泛關注[4]。人臍帶MSC(hUCMSC)比骨髓源性MSC(BMSC)更易擴增、分化，其形態、免疫表型以及多分化潛能等多種生物學特性與BMSC極為相似，是同種異源中較好的MSC來源[5, 6]。目前國內外多數研究為同種異體眼內移植BMSC，對hUCMSC異種異體治療糖尿病(DM)模型鼠，僅對單一移植途徑進行觀察研究，而通過全身或局部兩種不同途徑治療DM模型鼠的對照觀察研究尚少。本研究旨在探討經全身途徑輸注hUCMSC對血糖的影響及全身或局部兩種不同途徑輸注hUCMSC對DR視網膜中腦源性神經營養因子(BDNF)的影響，為進一步研究hUCMSC治療DR的機制奠定理論基礎。
1 材料和方法
鏈脲佐菌素(STZ)、異硫氰酸熒光素(FITC-dextran)、焦碳酸二乙酯(DEPC)原液(美國Sigma公司)；1×106~1×107個hUCMSC(天津昂賽細胞生物有限公司提供)；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)免疫組織化學試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、兔抗鼠BDNF抗體(武漢博士德生物公司)；總RNA提取試劑Trizol、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、SYBR GreenⅠDNA結合染料、逆轉錄酶(美國Invitrogen公司)；引物合成[英濰捷基(上海)貿易有限公司]。眼科手術顯微鏡、手術顯微器械(天津市眼科研究所提供)；微量注射器(上海光正醫療儀器有限公司)；包埋機EG116、石蠟切片機(德國Leica公司)；Olympus BX51熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；高速冷凍離心機、Realplex2熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(德國Eppendorf公司)；9700型PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。
無菌條件下，將剖宮產新生兒臍帶從手術臺上取下，迅速轉移至實驗室進行分離、貼壁細胞培養。采用第4代細胞進行輸注，倒置顯微鏡觀察細胞形態，流式細胞儀測定細胞免疫表型CD13、CD29、CD31、CD34、CD38、CD44、CD45、CD73(SH3)、CD105(SH2)、CD166、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ。
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠45只，8~10周齡，體重200~220 g，清潔級，標準化飼養，天津醫科大學動物中心提供。建模前均行裂隙燈顯微鏡、直接檢眼鏡檢查排除影響結果的眼部疾病。完全隨機法分為正常對照組(A組)、DM組，分別為10、35只大鼠。DM組大鼠適應性飼養3 d后，按體重45 mg/kg一次性鼠尾靜脈注射2%的STZ(溶解于0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液, pH 4.0~4.4)，1周時血糖＞16.7 mmol/L者為糖尿病大鼠。成模時及成模后2、6、10周DM組大鼠血糖與A組大鼠血糖比較，差異均有統計學意義(t=-77.265、-66.438、-64.541、-36.314，P=0.000)。
10周時，A組、DM組分別隨機選取2只大鼠行視網膜血管鋪片。按體重3 ml/kg腹腔注射10％水合氯醛麻醉后，暴露心臟，左心室灌注配制好的FITC-dextran溶液(50 mg:1 ml蒸餾水)，灌注充分后，立刻摘除眼球，4%多聚甲醛固定30 min。眼科手術顯微鏡下制作鋪片，熒光顯微鏡下觀察視網膜血管形態。DM組剩余的33只大鼠隨機分為DR組(B組)、尾靜脈注射hUCMSC組(C組)、玻璃體腔注射hUCMSC組(D組)，各組均為11只大鼠。C組尾靜脈注射0.5 ml的1×106~1×107個hUCMSC，D組玻璃體腔注射2 μl的1×106~1×107個hUCMSC。8周時從B、C、D組分別隨機選取2只大鼠行視網膜血管鋪片。A、B組不行干預。剔除實驗過程中玻璃體積血、血糖恢復、死亡鼠，最終各組均為8只大鼠16只眼計入統計。
干預后2、4、6、8周為觀察處理時間點。連續3 d每次隨機選取2只大鼠進行隨機血糖測量。各處理時間點時，每組隨機選取2只大鼠處死，摘除眼球。2只眼經4%多聚甲醛固定、梯度酒精脫水、二甲苯透明，以與角膜和視盤連線的軸相平行方向進行連續切片，厚度4 μm。采用SP法進行免疫組織化學染色，依照說明書逐步操作。顯微鏡下觀察，以細胞漿出現棕黃色顆粒為BDNF陽性信號。2只眼在手術顯微鏡下剝離視網膜，置于-70 ℃液氮中保存，以備檢測視網膜BDNF mRNA相對表達量。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參基因，經Pubmed Genbank搜索目的基因及內參基因，按照Primer5.0軟件設計特異性引物。BDNF(NM_012513)上游引物：5′-CACTTT TGAGCACGTGATCGAA-3′，下游引物：5′-GAGGC TCCAAAGGCACTTGAC-3′。GAPDH(NM_017008)上游引物：5′-GGCAAGTTCAACGGCACA-3′，下游引物：5′-GACGCCAGTAGACTCCACGAC-3′。采用Trizol一步法提取視網膜總RNA，根據反轉錄說明書逐步操作逆轉錄合成cDNA，根據說明書在冰上配制SYBRgreenⅠ熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)混合液，Realplex2 PCR儀行PCR擴增，采用2-ΔΔCT方法計算BDNF基因的表達倍數。以相應時間點A組作為參照因子，2-ΔΔCT方法計算其他各組相對于A組的BDNF基因相對表達量。A組ΔΔCT=0，其變化倍數為1，即2-ΔΔCT=1。
SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析處理。數據以均數±標準差(
2 結果
干預后，不同處理時間點A、B、C、D組大鼠血糖比較，差異均有統計學意義(F=400.017、404.410、422.043、344.109，P=0.000)。不同處理時間點A組大鼠血糖與B、C、D組大鼠血糖比較，差異均有統計學意義(t=4.402、5.700、4.331、P＜0.01)；C組大鼠血糖下降幅度較B、D組大鼠血糖下降幅度大，但仍高于16.7 mmol/L，差異均有統計學意義(t=4.447、4.990，P＜0.01)。不同處理時間點組內血糖比較，僅C組差異有統計學意義(F=6.354，P=0.003)；C組組內各相鄰時間點血糖比較，僅2、4周差異有統計學意義(t=3.920，P=0.011)(圖 1)。
圖1
干預后各組大鼠不同處理時間血糖變化
視網膜血管鋪片結果顯示，A組大鼠視網膜血管管腔均勻、走行規則，毛細血管分為深淺兩層，未見熒光滲漏(圖 2A)。B組大鼠視網膜血管管腔節段性改變、走行紆曲、不規則擴張，可見靜脈串珠狀改變及熒光滲漏(圖 2B)。C、D組大鼠均可見視網膜血管管腔節段性改變、走行紆曲，靜脈串珠狀改變，C組大鼠同時可見熒光滲漏(圖 2C, 2D)。
圖2
視網膜血管鋪片熒光顯微鏡像。2A.A組。血管走行規則，未見熒光滲漏。2B.B組。血管走行紆曲，可見熒光滲漏(紅箭)。2C.C組。血管走行紆曲，可見熒光滲漏(紅箭)。2D.D組。血管走行紆曲，靜脈串珠狀改變
免疫組織化學染色結果顯示，A組BDNF表達呈陽性，陽性細胞邊界較清晰，主要位于視網膜神經節細胞(RGC)層，其余視網膜層內均有表達(圖 3A)。B組BDNF表達呈弱陽性，各層表達量明顯減少，陽性著色略淺(圖 3B)。C、D組BDNF表達增多，D組更為明顯，主要位于RGC層、神經纖維層、內叢狀層、視錐視桿層(圖 3C~3J)。
圖3
免疫組織化學染色像。3A.A組。BDNF蛋白呈陽性表達，細胞核棕黃深染，陽性著色主要位于RGC層(黑箭)，神經纖維層、內核層、視錐視桿層、內叢狀層、外核層也有表達SP ×200。3B.B組。BDNF蛋白弱陽性表達，陽性細胞染色淺，視網膜各層表達量顯著減少(黑箭) SP ×200。3C～3F.C組干預后2、4、6、8周。BDNF蛋白表達量較B組增多，且陽性細胞邊界隨時間進展而逐漸清晰，陽性細胞染色逐漸加深，陽性表達主要位于RGC層(黑箭)，神經纖維層、內叢狀層、視錐視桿層也有表達，少量位于內核層SP ×200。3G～3J.D組干預后2、4、6、8周。BDNF蛋白表達量較B組明顯增多，陽性細胞染色較深，數量隨時間延長遞增，邊界逐漸清晰，陽性表達主要位于RGC層(黑箭)，神經纖維層、內叢狀層、視錐視桿層，內核層也有表達SP ×200
RT-PCR檢測結果顯示，干預后2周，B、C、D組間視網膜BDNF mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義(F=1.567，P=0.241)；4、6、8周B、C、D組間視網膜BDNF mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(F=29.372、188.492、421.537，P=0.000)。4、6、8周時，C、D組視網膜BDNF mRNA相對表達量與B組比較，差異均有統計學意義(t=66.781、72.401、63.880、88.423、75.120、83.002，P＜0.01)；C組視網膜BDNF mRNA相對表達量與D組比較，4、6周時差異無統計學意義(t=8.409、12.344，P＞0.05)，8周時差異有統計學意義(t=127.321，P=0.005)(圖 4)。
圖4
BDNF mRNA相對表達量的倍數關系
干預后不同處理時間點，B、C、D組組內視網膜BDNF mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(F=28.255、9.016、15.180，P＜0.01)。B組視網膜BDNF mRNA相對表達量隨時間延長顯著下降，組內相鄰時間點視網膜BDNF mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(t=70.267、68.553、89.608，P＜0.01)。C、D組視網膜BDNF mRNA相對表達量隨時間延長逐漸增加，D組組內各相鄰時間點視網膜BDNF mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(t=69.453、24.794、25.012，P＜0.05)，C組僅4周與6周視網膜BDNF mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義(t=24.376，P=0.024)。
3 討論
hUCMSC是一種從臍帶的華頓膠質中分離培養獲得的成體干細胞，來源廣泛，不涉及倫理學問題，具有強大的分化能力，較低的免疫原性[7, 8]。本研究中，C組為hUCMSC經尾靜脈注射至大鼠體內，屬異種移植，且未給予任何免疫抑制劑，整個實驗過程未出現大鼠批量死亡的情況，因此尾靜脈輸注hUCMSC較為安全；血糖下降幅度較B、D組大，差異均有統計學意義，但仍高于16.7 mmol/L；C組組內相鄰時間點血糖比較，僅2周與4周比較差異有統計學意義。表明全身輸注hUCMSC在體內發揮降低血糖的作用時間為1~4周，而局部輸注hUCMSC對血糖無明顯調節作用。本研究為隨機對照實驗，首次進行尾靜脈及玻璃體腔兩種途徑輸注hUCMSC進行對比研究，采用相應的統計學方法進行分析，結果可信。有研究證實，hUCMSC能夠在體外分化為成熟的胰島樣細胞簇及胰島素分泌細胞，移植入DM模型鼠后，血內胰島素水平顯著提高，血糖水平顯著下降[9, 10]。經尾靜脈輸注hUCMSC后能夠降低血糖水平可能是因為其在胰腺組織處進行組織分化，發揮代償受損組織和分泌胰島素的作用。
hUCMSC對DR治療的可能機制為：(1) hUCMSC分化替代受損的視網膜血管周細胞和內皮細胞并抑制其凋亡，從而對視網膜血管進行修復，改善視網膜的缺血、缺氧情況[11]。在本研究中觀察了各組視網膜鋪片的血管形態，C、D組略有改善，且未見明顯排斥反應，即玻璃體腔輸注hUCMSC對視網膜血管有一定修復作用，安全性尚佳。(2)hUCMSC分化替代受損的視網膜神經細胞并抑制其凋亡，對視網膜神經功能進行代償[12]。(3)hUCMSC能夠分泌神經營養因子，營養受損視網膜[13]。BDNF作為神經營養因子家族的一員，調節神經元進化的諸多方面[14]，對視網膜RGC的存活數量也發揮著重要作用[14, 15]。本研究中，免疫組織化學染色發現，B組視網膜BDNF表達呈弱陽性，各層表達量明顯減少，視網膜BDNF mRNA相對表達量均隨著時間延長而逐漸降低，與A組比較，差異有統計學意義；C、D組BDNF在視網膜各層表達B組增多，其中D組視網膜BDNF mRNA相對表達量顯著增加，逐漸趨向正常水平。(4)hUCMSC對炎癥的免疫調節作用[16]。
本研究對DM模型鼠進行了不同途徑的干細胞治療，證實尾靜脈輸注hUCMSC具有一定的降低血糖作用；能夠提高大鼠視網膜中BDNF含量，其中玻璃體腔輸注效果更優，為進一步研究hUCMSC對DR的治療機制奠定基礎。但本研究由于條件限制樣本量較小，未進行BDNF陽性細胞計數的統計學分析以及hUCMSC多濃度及視網膜下腔注射的對照研究；未在注射后2周內進行多點觀察以發現更早期的視網膜變化。均有待今后的實驗中進一步完善。
糖尿病視網膜病變(DR)是以視網膜脈管系統崩解和神經元功能紊亂為特征的致盲性眼底疾病[1, 2]。抗血管內皮生長因子(VEGF)藥物雖然能夠改善DR引起的血視網膜屏障損傷，但重復注射會造成視網膜神經細胞的毒性損害[3]。間充質干細胞(MSC)因其具有較強的自我更新能力和多向分化潛能而受到廣泛關注[4]。人臍帶MSC(hUCMSC)比骨髓源性MSC(BMSC)更易擴增、分化，其形態、免疫表型以及多分化潛能等多種生物學特性與BMSC極為相似，是同種異源中較好的MSC來源[5, 6]。目前國內外多數研究為同種異體眼內移植BMSC，對hUCMSC異種異體治療糖尿病(DM)模型鼠，僅對單一移植途徑進行觀察研究，而通過全身或局部兩種不同途徑治療DM模型鼠的對照觀察研究尚少。本研究旨在探討經全身途徑輸注hUCMSC對血糖的影響及全身或局部兩種不同途徑輸注hUCMSC對DR視網膜中腦源性神經營養因子(BDNF)的影響，為進一步研究hUCMSC治療DR的機制奠定理論基礎。
1 材料和方法
鏈脲佐菌素(STZ)、異硫氰酸熒光素(FITC-dextran)、焦碳酸二乙酯(DEPC)原液(美國Sigma公司)；1×106~1×107個hUCMSC(天津昂賽細胞生物有限公司提供)；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)免疫組織化學試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、兔抗鼠BDNF抗體(武漢博士德生物公司)；總RNA提取試劑Trizol、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、SYBR GreenⅠDNA結合染料、逆轉錄酶(美國Invitrogen公司)；引物合成[英濰捷基(上海)貿易有限公司]。眼科手術顯微鏡、手術顯微器械(天津市眼科研究所提供)；微量注射器(上海光正醫療儀器有限公司)；包埋機EG116、石蠟切片機(德國Leica公司)；Olympus BX51熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；高速冷凍離心機、Realplex2熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(德國Eppendorf公司)；9700型PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。
無菌條件下，將剖宮產新生兒臍帶從手術臺上取下，迅速轉移至實驗室進行分離、貼壁細胞培養。采用第4代細胞進行輸注，倒置顯微鏡觀察細胞形態，流式細胞儀測定細胞免疫表型CD13、CD29、CD31、CD34、CD38、CD44、CD45、CD73(SH3)、CD105(SH2)、CD166、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ。
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠45只，8~10周齡，體重200~220 g，清潔級，標準化飼養，天津醫科大學動物中心提供。建模前均行裂隙燈顯微鏡、直接檢眼鏡檢查排除影響結果的眼部疾病。完全隨機法分為正常對照組(A組)、DM組，分別為10、35只大鼠。DM組大鼠適應性飼養3 d后，按體重45 mg/kg一次性鼠尾靜脈注射2%的STZ(溶解于0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液, pH 4.0~4.4)，1周時血糖＞16.7 mmol/L者為糖尿病大鼠。成模時及成模后2、6、10周DM組大鼠血糖與A組大鼠血糖比較，差異均有統計學意義(t=-77.265、-66.438、-64.541、-36.314，P=0.000)。
10周時，A組、DM組分別隨機選取2只大鼠行視網膜血管鋪片。按體重3 ml/kg腹腔注射10％水合氯醛麻醉后，暴露心臟，左心室灌注配制好的FITC-dextran溶液(50 mg:1 ml蒸餾水)，灌注充分后，立刻摘除眼球，4%多聚甲醛固定30 min。眼科手術顯微鏡下制作鋪片，熒光顯微鏡下觀察視網膜血管形態。DM組剩余的33只大鼠隨機分為DR組(B組)、尾靜脈注射hUCMSC組(C組)、玻璃體腔注射hUCMSC組(D組)，各組均為11只大鼠。C組尾靜脈注射0.5 ml的1×106~1×107個hUCMSC，D組玻璃體腔注射2 μl的1×106~1×107個hUCMSC。8周時從B、C、D組分別隨機選取2只大鼠行視網膜血管鋪片。A、B組不行干預。剔除實驗過程中玻璃體積血、血糖恢復、死亡鼠，最終各組均為8只大鼠16只眼計入統計。
干預后2、4、6、8周為觀察處理時間點。連續3 d每次隨機選取2只大鼠進行隨機血糖測量。各處理時間點時，每組隨機選取2只大鼠處死，摘除眼球。2只眼經4%多聚甲醛固定、梯度酒精脫水、二甲苯透明，以與角膜和視盤連線的軸相平行方向進行連續切片，厚度4 μm。采用SP法進行免疫組織化學染色，依照說明書逐步操作。顯微鏡下觀察，以細胞漿出現棕黃色顆粒為BDNF陽性信號。2只眼在手術顯微鏡下剝離視網膜，置于-70 ℃液氮中保存，以備檢測視網膜BDNF mRNA相對表達量。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參基因，經Pubmed Genbank搜索目的基因及內參基因，按照Primer5.0軟件設計特異性引物。BDNF(NM_012513)上游引物：5′-CACTTT TGAGCACGTGATCGAA-3′，下游引物：5′-GAGGC TCCAAAGGCACTTGAC-3′。GAPDH(NM_017008)上游引物：5′-GGCAAGTTCAACGGCACA-3′，下游引物：5′-GACGCCAGTAGACTCCACGAC-3′。采用Trizol一步法提取視網膜總RNA，根據反轉錄說明書逐步操作逆轉錄合成cDNA，根據說明書在冰上配制SYBRgreenⅠ熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)混合液，Realplex2 PCR儀行PCR擴增，采用2-ΔΔCT方法計算BDNF基因的表達倍數。以相應時間點A組作為參照因子，2-ΔΔCT方法計算其他各組相對于A組的BDNF基因相對表達量。A組ΔΔCT=0，其變化倍數為1，即2-ΔΔCT=1。
SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析處理。數據以均數±標準差(
2 結果
干預后，不同處理時間點A、B、C、D組大鼠血糖比較，差異均有統計學意義(F=400.017、404.410、422.043、344.109，P=0.000)。不同處理時間點A組大鼠血糖與B、C、D組大鼠血糖比較，差異均有統計學意義(t=4.402、5.700、4.331、P＜0.01)；C組大鼠血糖下降幅度較B、D組大鼠血糖下降幅度大，但仍高于16.7 mmol/L，差異均有統計學意義(t=4.447、4.990，P＜0.01)。不同處理時間點組內血糖比較，僅C組差異有統計學意義(F=6.354，P=0.003)；C組組內各相鄰時間點血糖比較，僅2、4周差異有統計學意義(t=3.920，P=0.011)(圖 1)。
圖1
干預后各組大鼠不同處理時間血糖變化
視網膜血管鋪片結果顯示，A組大鼠視網膜血管管腔均勻、走行規則，毛細血管分為深淺兩層，未見熒光滲漏(圖 2A)。B組大鼠視網膜血管管腔節段性改變、走行紆曲、不規則擴張，可見靜脈串珠狀改變及熒光滲漏(圖 2B)。C、D組大鼠均可見視網膜血管管腔節段性改變、走行紆曲，靜脈串珠狀改變，C組大鼠同時可見熒光滲漏(圖 2C, 2D)。
圖2
視網膜血管鋪片熒光顯微鏡像。2A.A組。血管走行規則，未見熒光滲漏。2B.B組。血管走行紆曲，可見熒光滲漏(紅箭)。2C.C組。血管走行紆曲，可見熒光滲漏(紅箭)。2D.D組。血管走行紆曲，靜脈串珠狀改變
免疫組織化學染色結果顯示，A組BDNF表達呈陽性，陽性細胞邊界較清晰，主要位于視網膜神經節細胞(RGC)層，其余視網膜層內均有表達(圖 3A)。B組BDNF表達呈弱陽性，各層表達量明顯減少，陽性著色略淺(圖 3B)。C、D組BDNF表達增多，D組更為明顯，主要位于RGC層、神經纖維層、內叢狀層、視錐視桿層(圖 3C~3J)。
圖3
免疫組織化學染色像。3A.A組。BDNF蛋白呈陽性表達，細胞核棕黃深染，陽性著色主要位于RGC層(黑箭)，神經纖維層、內核層、視錐視桿層、內叢狀層、外核層也有表達SP ×200。3B.B組。BDNF蛋白弱陽性表達，陽性細胞染色淺，視網膜各層表達量顯著減少(黑箭) SP ×200。3C～3F.C組干預后2、4、6、8周。BDNF蛋白表達量較B組增多，且陽性細胞邊界隨時間進展而逐漸清晰，陽性細胞染色逐漸加深，陽性表達主要位于RGC層(黑箭)，神經纖維層、內叢狀層、視錐視桿層也有表達，少量位于內核層SP ×200。3G～3J.D組干預后2、4、6、8周。BDNF蛋白表達量較B組明顯增多，陽性細胞染色較深，數量隨時間延長遞增，邊界逐漸清晰，陽性表達主要位于RGC層(黑箭)，神經纖維層、內叢狀層、視錐視桿層，內核層也有表達SP ×200
RT-PCR檢測結果顯示，干預后2周，B、C、D組間視網膜BDNF mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義(F=1.567，P=0.241)；4、6、8周B、C、D組間視網膜BDNF mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(F=29.372、188.492、421.537，P=0.000)。4、6、8周時，C、D組視網膜BDNF mRNA相對表達量與B組比較，差異均有統計學意義(t=66.781、72.401、63.880、88.423、75.120、83.002，P＜0.01)；C組視網膜BDNF mRNA相對表達量與D組比較，4、6周時差異無統計學意義(t=8.409、12.344，P＞0.05)，8周時差異有統計學意義(t=127.321，P=0.005)(圖 4)。
圖4
BDNF mRNA相對表達量的倍數關系
干預后不同處理時間點，B、C、D組組內視網膜BDNF mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(F=28.255、9.016、15.180，P＜0.01)。B組視網膜BDNF mRNA相對表達量隨時間延長顯著下降，組內相鄰時間點視網膜BDNF mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(t=70.267、68.553、89.608，P＜0.01)。C、D組視網膜BDNF mRNA相對表達量隨時間延長逐漸增加，D組組內各相鄰時間點視網膜BDNF mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(t=69.453、24.794、25.012，P＜0.05)，C組僅4周與6周視網膜BDNF mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義(t=24.376，P=0.024)。
3 討論
hUCMSC是一種從臍帶的華頓膠質中分離培養獲得的成體干細胞，來源廣泛，不涉及倫理學問題，具有強大的分化能力，較低的免疫原性[7, 8]。本研究中，C組為hUCMSC經尾靜脈注射至大鼠體內，屬異種移植，且未給予任何免疫抑制劑，整個實驗過程未出現大鼠批量死亡的情況，因此尾靜脈輸注hUCMSC較為安全；血糖下降幅度較B、D組大，差異均有統計學意義，但仍高于16.7 mmol/L；C組組內相鄰時間點血糖比較，僅2周與4周比較差異有統計學意義。表明全身輸注hUCMSC在體內發揮降低血糖的作用時間為1~4周，而局部輸注hUCMSC對血糖無明顯調節作用。本研究為隨機對照實驗，首次進行尾靜脈及玻璃體腔兩種途徑輸注hUCMSC進行對比研究，采用相應的統計學方法進行分析，結果可信。有研究證實，hUCMSC能夠在體外分化為成熟的胰島樣細胞簇及胰島素分泌細胞，移植入DM模型鼠后，血內胰島素水平顯著提高，血糖水平顯著下降[9, 10]。經尾靜脈輸注hUCMSC后能夠降低血糖水平可能是因為其在胰腺組織處進行組織分化，發揮代償受損組織和分泌胰島素的作用。
hUCMSC對DR治療的可能機制為：(1) hUCMSC分化替代受損的視網膜血管周細胞和內皮細胞并抑制其凋亡，從而對視網膜血管進行修復，改善視網膜的缺血、缺氧情況[11]。在本研究中觀察了各組視網膜鋪片的血管形態，C、D組略有改善，且未見明顯排斥反應，即玻璃體腔輸注hUCMSC對視網膜血管有一定修復作用，安全性尚佳。(2)hUCMSC分化替代受損的視網膜神經細胞并抑制其凋亡，對視網膜神經功能進行代償[12]。(3)hUCMSC能夠分泌神經營養因子，營養受損視網膜[13]。BDNF作為神經營養因子家族的一員，調節神經元進化的諸多方面[14]，對視網膜RGC的存活數量也發揮著重要作用[14, 15]。本研究中，免疫組織化學染色發現，B組視網膜BDNF表達呈弱陽性，各層表達量明顯減少，視網膜BDNF mRNA相對表達量均隨著時間延長而逐漸降低，與A組比較，差異有統計學意義；C、D組BDNF在視網膜各層表達B組增多，其中D組視網膜BDNF mRNA相對表達量顯著增加，逐漸趨向正常水平。(4)hUCMSC對炎癥的免疫調節作用[16]。
本研究對DM模型鼠進行了不同途徑的干細胞治療，證實尾靜脈輸注hUCMSC具有一定的降低血糖作用；能夠提高大鼠視網膜中BDNF含量，其中玻璃體腔輸注效果更優，為進一步研究hUCMSC對DR的治療機制奠定基礎。但本研究由于條件限制樣本量較小，未進行BDNF陽性細胞計數的統計學分析以及hUCMSC多濃度及視網膜下腔注射的對照研究；未在注射后2周內進行多點觀察以發現更早期的視網膜變化。均有待今后的實驗中進一步完善。
