目的觀察多聚嘧啶序列結合蛋白相關剪接因子(PSF)對體外培養的視網膜色素上皮(RPE)細胞磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路的調控作用。 方法將體外培養的RPE細胞分為PSF高表達組、PSF高表達對照組、PSF低表達組、PSF低表達對照組及假轉染組。應用脂質體2000將上調PSF表達的真核質粒增強型綠色熒光蛋白(pEGFP)-C2-PSF、下調PSF表達的真核質粒pGenesil-PSF-RNAi以0.25、0.50、1.00 μg的遞增量分別轉染至PSF高表達組及PSF低表達組細胞。PSF高表達對照組細胞轉染pEGFP-C2空載質粒。PSF低表達對照組細胞轉染pGenesil-scramble-siRNA質粒。假轉染組僅做轉染處理,不加入任何表達質粒。采用水溶性四氮唑法檢測胰島素樣生長因子1(IGF-1)刺激條件下PSF對RPE細胞增生的影響。應用脂質體2000將0.50 μg真核質粒pEGFP-C2-PSF、1.00 μg真核質粒pGenesil-PSF-RNAi及pEGFP-C2空載質粒轉染細胞分別作為PSF高表達組、PSF低表達組、對照組,采用實時定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測PSF對 IGF-1誘導的RPE細胞內血管內皮生長因子(VEGF) mRNA表達的影響。采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測PSF對IGF-1誘導的磷酸化Akt(pAkt)蛋白表達的影響。在IGF-1刺激后,將RPE細胞分為單純渥曼青霉素(Wortmannin)處理組、單純PSF高表達組、渥曼青霉素聯合PSF高表達處理組,并以未經渥曼青霉素處理的常規體外培養的RPE細胞為對照組,采用實時定量PCR檢測各組VEGF的表達。 結果IGF-1刺激后,PSF高表達組、PSF高表達對照組及假轉染組之間RPE細胞增生率比較,差異有統計學意義(F=29.728,P<0.05);PSF低表達組、PSF低表達對照組及假轉染組之間RPE細胞增生率比較,差異有統計學意義(F=14.121,P<0.05)。PSF高表達組RPE細胞中VEGF mRNA表達較對照組明顯降低,差異有統計學意義(P=0.000 3);PSF低表達組RPE細胞中VEGF mRNA表達較對照組明顯提高,差異有統計學意義(P=0.030 9)。Western blot檢測結果顯示,IGF-1刺激可上調pAkt蛋白表達水平,PSF高表達可明顯下調pAkt蛋白表達水平。IGF-1刺激后,渥曼青霉素聯合PSF高表達處理組VEGF表達較單純渥曼青霉素處理組明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。 結論PSF能抑制IGF-1 刺激后體外培養的RPE細胞中PI3K/Akt信號通路活化,下調VEGF表達。
目的觀察探討聚嘧啶束結合蛋白相關剪接子（PSF）高表達對糖基化終末產物（AGEs）誘導下人視網微血管內皮細胞（hRMECs）氧化損傷的保護作用及相應分子機制。方法將hRMECs分為正常組、空載組、PSF組、鋅原卟啉（ZnPP）組及PSF+ ZnPP組進行實驗。正常組細胞使用含有10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素的DMEM培養基，置于37 °C、95%空氣、5% CO2的密閉恒溫培養箱中培養。空載組細胞采用空載慢病毒感染。PSF組細胞采用過表達PSF慢病毒感染。ZnPP組細胞采用ZnPP（10 mol/L）處理2 h。PSF+ZnPP組細胞采用過表達PSF慢病毒感染后，再用ZnPP（10 mol/L）預處理2 h。后四組細胞輔以AGEs刺激，HE、Hoechst33258染色法和流式細胞法觀察PSF高表達對細胞損傷的保護作用以及ZnPP對PSF的拮抗作用。采用Western blot檢測細胞中血紅素氧合酶-1（HO-1）、磷酸化（p）細胞外調節蛋白激酶（ERK）、核因子2相關因子2（Nrf2）的蛋白表達。引入ERK通路的特異性拮抗劑U0126，Western blot驗證U0126對PSF蛋白所誘導的HO-1表達的逆轉作用。結果HE染色和Hoechst33258染色結果顯示，PSF組受損細胞核數較正常組明顯增加，較PSF+ZnPP組明顯減少，差異均有統計學意義（F=27.5、38.7，P＜0.05）。流式細胞法結果顯示，PSF組細胞產生的ROS較正常組明顯增加，較PSF+ZnPP組明顯減少，差異有統計學意義（F=126.4，P＜0.05）。Western blot檢測結果顯示，PSF組HO-1蛋白表達量較正常組、空載組明顯增加，差異均有統計學意義（F=70.1，P＜0.05）；AGEs處理30、60、120、240 min時pERK的蛋白表達量與15 min時比較，差異均有統計學意義（F=474.0，P＜0.05）；PSF+/U0126－組HO-1、Nrf2蛋白表達量較PSF－/U0126－組明顯增加，PSF+/U0126+組HO-1、Nrf2蛋白表達量較PSF+/U0126－組明顯降低，差異有統計學意義（F=30.2、489.4，P＜0.05）。結論PSF高表達可以通過活化ERK通路，促進Nrf2轉位入核進而誘導HO-1表達，從而保護hRMECs免受AGEs誘導的氧化損傷。
目的觀察聚嘧啶束結合蛋白相關剪接因子（PSF）高表達對糖基化終末產物（AGEs）誘導下RPE細胞損傷的保護作用。方法將體外培養的人RPE細胞分為正常對照組（N組）、空白對照組（N+AGAGEs組）、空載體對照組（Vec+AGEs組）、PSF高表達組（PSF+AGEs組）。N組RPE細胞常規培養；N+AGEs組只做轉染處理但不導入任何外源性基因的RPE細胞聯合AGEs誘導；Vec+AGEs組、PSF+AGEs組利用轉染試劑脂質體2000將pcDNA空載體或pcDNA-PSF真核表達質粒導入RPE細胞聯合AGEs誘導。除N組以外，其余3組細胞進行相應的轉染處理，24 h后應用150 μg/ml的AGEs刺激72 h。采用HE染色和Hoechst 33258染色觀察PSF高表達對RPE細胞凋亡相關形態改變的影響；通過ROS水平檢測分析PSF高表達對AGEs誘導的RPE細胞ROS表達的影響；采用MTT比色法檢測PSF高表達對RPE細胞生存力的影響；采用Western blot檢測PSF不同作用時間及不同劑量對血紅素氧合酶1（HO-1）表達的影響。結果HE染色和Hoechst 33258染色觀察發現，N組細胞形態飽滿，細胞核呈圓形，細胞質豐富，染色均一；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞體積縮小，嗜酸性染色增強，細胞核致密濃染、固縮甚至碎裂；PSF+AGEs組細胞形態尚飽滿，細胞漿染色較均勻，細胞核染色均一。MTT比色法檢測結果顯示，PSF高表達可有效提高RPE細胞生存力，但該作用可被ZnPP有效拮抗，且差異有統計學意義（F=33.26，P＜0.05）。DCFH-DA法檢測結果顯示，與N+AGEs組、Vec+AGEs組比較，PSF+AGEs組細胞中ROS產量下降，差異有統計學意義（F=11.94，P＜0.05）。Western blot檢測結果顯示，PSF蛋白以時間、劑量依賴性的方式上調HO-1的表達水平。PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相對表達水平較0 h明顯升高，差異有統計學意義（F=164.91，P＜0.05）。0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg PSF蛋白作用下的HO-1相對表達水平較0.0 μg明顯升高，差異有統計學意義（F=104.82，P＜0.05）。結論PSF可能通過上調HO-1的表達而抑制ROS產生，從而對AGEs誘導下的RPE細胞損傷發揮保護作用。