目的構建人結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)基因啟動子熒光素酶報告基因的真核表達載體。方法設計特異性引物,通過聚合酶鏈反應實驗擴增人基因組中 CTGF 啟動子區域的 DNA(-835/+214),通過分子克隆方式將人 CTGF 啟動子的序列插入到 pGL3.0-Basic 載體,通過單克隆菌落聚合酶鏈反應、質粒雙酶切鑒定、測序等方法對其進行陽性質粒的篩選和鑒定;然后使用轉染試劑 Lipofectamine 3000 將 pGL3.0-Basic-CTGF 分別轉染于人胚腎細胞 293T、人氣道上皮細胞 HBE 和人肺泡上皮細胞 A549,通過測定熒光素酶活性鑒定其功能。結果序列比對結果為 99.50%,提示 pGL3.0-Basic-CTGF 載體構建成功。將 pGL3.0-Basic-CTGF 分別轉染于 293T、HBE 和 A549 細胞 48 h 后檢測,在 293T、HBE 和 A549 細胞中均有啟動子活性,分別為 2.416、0.027、0.121(P<0.01);而且在 A549 細胞中熒光素酶的活性明顯高于 HBE 細胞組,差異有統計學意義(P<0.01)。結論人 pGL3.0-Basic-CTGF 熒光素酶系統構建成功,且在氣道上皮細胞 HBE 和肺泡上皮細胞 A549 中均有啟動子活性,可為后續轉錄調控研究提供工具。
目的探討建立大鼠右室流出道重建術動物模型的可行性。方法對 15 只成年雌性 Sprague-Dawley(SD)大鼠實施右室流出道重建術。將膠原海綿補片經過碳化二亞胺法處理,并種植人骨髓間充質干細胞(紫紺型先心病患者來源,年齡<5 歲),利用新構建的工程化心肌補片修補大鼠的右心室流出道。3 d 后,隨機取 3 只大鼠處死,取出心臟,對心臟正面、內面及剖面攝片,以確定透壁切除心肌組織。4 周后,將大鼠心臟取出,作抗人線粒體抗體染色確定補片是否仍有種子細胞存活(n=4)。此外,在 1 個月、3 個月時,各處死大鼠 3 只,直視攝影觀察并行馬洪染色(Masson’s trichrome)觀察補片降解情況(n=3)。結果2 只大鼠于術后 24 h 內死亡,建模總體死亡率為 13.3%(2/15)。直視攝片證明右心室流出道為透壁切除,補片完全替代了右室流出道心肌組織。4 周后補片上仍有種子細胞存活。結論大鼠右室流出道重建術模型可作為組織工程心肌補片(EHT)實驗研究中一種穩定、可靠且經濟的初篩模型。