引用本文： 程悅, 康凱, 啜俊波, 覃雄海, 田鑫, 楊峰, 蔣樹林, 謝寶棟. 大鼠右室流出道重建術模型的構建. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2019, 26(3): 260-263. doi: 10.7507/1007-4848.201811045 復制
對以法洛四聯癥為代表的一類紫紺型先天性心臟病（先心病）患兒，采用修補材料，包括自體心包補片進行右室流出道加寬是手術糾治的基本操作之一[1]。但由于目前修補材料的自身局限（如缺乏生長能力，遠期容易發生僵硬、鈣化，缺乏電傳導性能及機械收縮能力），相當一部分患兒仍面臨著二次手術風險[2]。因此，理論上具有全部生物活性的組織工程心肌補片（engineered heart tissues，EHTs）是解決上述問題希望所在[3-4]。為驗證各種 EHTs 的在體生物學行為，有必要建立一種逼真、穩定且經濟的小動物模型。我們利用大鼠構建了右室流出道重建術模型，并初步檢測了補片部分在體生物學性能。
1 材料與方法
1.1 種子細胞的分離和培養
種子細胞均取自擬行手術的紫紺型先心病的患兒（年齡<5 歲）的胸骨骨髓。取材前，本實驗已獲得哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會的批準（倫理號：2014-研-010）并均與患者的監護人簽署了知情同意書。取得的骨髓經梯度密度離心法分離出單個核細胞層置于含有 10% 胎牛血清的改良伊戈氏液（IMDM 培養液）中于低氧培養箱內培養（37℃，1% O2，94% N2，5% CO2），待細胞融合至 80% 左右，0.25% 胰酶消化傳代，取第 3 代（P3）細胞作種子細胞。
1.2 補片制備及分組
膠原補片購自上海其勝生物制劑有限公司，手術前修剪成直徑為 5 mm，厚度為 2 mm 的圓形。采用碳化二亞胺法（EDC 法）對上述膠原補片進行交聯加固處理，補片制備過程見文獻[5-6]。 經強化處理后的補片以 1×106/片的密度種植以上述培養的種子細胞，種植過程見文獻[5]。
1.3 實驗動物及手術操作
實驗動物均為 2 個月齡雌性 Sprague-Dawley（SD）大鼠（體重 220～250 g），購自哈爾濱醫科大學附屬第二醫院動物實驗中心。本實驗所有操作均符合國家及哈爾濱醫科大學關于實驗動物應用及管理的相關規定。
所有實驗動物于補片植入前 3 d 腹腔注射環孢素 A（5 mg/kg）以防止細胞植入后的免疫反應發生。具體手術操作步驟如下：10% 水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，術區備皮，以 16G 靜脈留置針行氣管插管，并連接于小動物呼吸機進行人工呼吸，呼吸頻率為 60 次/分，潮氣量為 1.5 ml。將大鼠置于仰臥位，碘伏消毒手術區域，并固定四肢。正中開胸，逐層分離，剪開胸骨，確切止血，用開胸器撐開胸骨，撕開心包，將心臟很好地顯露于手術野中。以 7-0 Prolene 線于右室流出道環形縫合一荷包，線的兩端穿過 18G 靜脈留置針，收緊荷包線并固定，將右室流出道突起心肌用眼科剪刀剪去，快速松開荷包線，有高速血流噴出以確認透壁切除右室流出道。以 7-0 Prolene 線將上述補片沿切口邊緣縫合。縫合完畢后收緊縫線并打結，緩慢松開荷包線，并輕壓右室流出道進行止血。清除胸腔內血液，無明顯出血點時于呼氣末正壓通氣下逐層關胸。術后 2 d 給予青霉素 G 8 萬單位/250 g，同時給予環孢素 A 5 mg/（kg·d），直至觀察終點。
1.4 實驗取材及切片制備
至術后 4 周時，以上述方式麻醉大鼠后，再次于自胸骨正中開胸，暴露心臟，以 10% 氯化鉀溶液 3 ml 經心尖注射，使心臟停跳于舒張期。將心臟剪下，生理鹽水沖洗后自肺動脈置入球囊，加壓至 30 mm Hg，于固定距離下照相。然后將心臟標本序貫浸泡于 10% 蔗糖 1 h，20% 蔗糖 1 h，30% 蔗糖 24 h 后，于右室流出道長軸切開心臟，干冰速凍并切成 5 μm 厚的冰凍切片。
1.5 補片的降解情況及存活細胞檢測
分別于術后 1 個月、術后 3 個月，隨機選取 3 只大鼠處死，直視攝像后制成冰凍切片，行馬洪（Masson’s trichrome）染色觀察補片降解情況；術后 4 周取 4 只大鼠行抗人線粒體抗體染色以觀察種子細胞存活情況，方法見文獻[5, 7]。
2 結果
2.1 透壁全層切除的驗證
為保證右室流出道心肌為透壁切除，術者在每次切除荷包縫合線內的心肌時都要快速松解荷包線，有高速血流噴出；證明切除為透壁全層切除；此外，在術后 3 d，隨機選取 3 只大鼠處死，內面觀、側面觀；均可證實術后補片成為右室流出道的一部分。
2.2 補片在體降解情況
術后 1 個月時，直視下顯示補片輪廓尚清晰存在（圖 1a），鏡下顯示補片兩側均已內、外膜化，兩側宿主細胞有向補片中心生長的趨勢，補片中心仍有大量纖維組織存在（圖 1b）；至術后 3 個月時，直視下補片輪廓已不可見（圖 1c），鏡下顯示補片的支架結構基本消失，僅有少許崩解的纖維組織殘留，補片大部分為宿主組織所替代（圖 1d）。
圖1
顯微鏡下補片在體降解情況
a、b：術后 1 個月直視下 ，鏡下補片降解情況；c、d：術后 3 個月直視下，鏡下補片降解情況（b、d 馬洪染色 ×100）
2.3 種子細胞存活情況
術后 4 周各只大鼠的抗人線粒體抗體免疫熒光染色顯示：直至移植后 4 周，補片上仍有移植的存活的 hMSCs 的存在（圖 2）。
圖2
顯微鏡下大鼠抗人線粒體抗體免疫熒光染色
a：補片上的細胞核 Dapi 染色（藍色）；b：補片上抗人線粒體抗體染色陽性細胞（箭頭所示，紅色）；c：融合圖 ×200
3 討論
目前，EHTs 作為自體心肌最有希望的替代物，已受到了學界的廣泛青睞，利用各種材料和技術制備的 EHTs 層出不窮[8-10]。因此，建立一種簡單、經濟的小動物模型以在體驗證各種 EHTs 的生物學行為就顯得十分必要。既往，此類模型多在豬、羊等大型動物上建立[11-12]，需在體外循環輔助下進行，不僅所需實驗動物費用昂貴，更需要專業的體外循環人員及輔助設備支撐，經濟性價比較低。顯而易見，此種動物模型不適合組織工程補片的初篩。
本研究組既往曾利用上述補片材料建立了大鼠心肌梗死室壁瘤切除，左室重建術的模型[5-6, 13]，但是，右心系統的病理生理環境畢竟不同于左心系統，上述左室重建的技術平臺能否完整地移植到右心系統，尚未得知。在本研究中，針對大鼠右室流出道的特點，我們對上述技術進行了部分調整：（1）適當縮小荷包縫合的面積：因大鼠右室流出道壓力明顯低于左室，如荷包縫合過大，環縮時右室流出道過窄，容易導致右室過脹而死亡，如果荷包縫合過小，則難以保證心肌的透壁切除；（2）術前觀察好左冠狀動脈前降支的走行，術中盡量避免損傷，否則將導致惡性心律失常或術后左心功能不全，影響模型建立的成功率；此外，在本模型中，保證右室流出道心肌的透壁切除是手術的關鍵之一。因為如果不能保證補片的透壁修補，使補片成為右室流出道的一部分，就不能在體驗證補片的生物力學性能并考察其在體生物學行為。為保證心肌的透壁切除，我們采取了以下幾項措施：（1）如前所述，避免荷包縫合過小，我們的經驗是切除直徑約 5 mm 左右的心肌則基本能保證透壁切除；（2）術中切完心肌后可快速松放荷包線一次，如果有高速血流沖出，則可證明心肌為透壁切除；（3）手術最好在放大眼鏡輔助下進行。
此外，在組織工程材料的研究中，合適的組織降解率以及與種子細胞的相容性也是需要考慮的問題之一[14-16] 。在本研究中，我們的支架材料選用的是經 EDC 法處理過的膠原海綿。膠原海綿來源廣泛，可隨意鑄形，是臨床廣泛使用的止血材料，但質脆易碎，降解迅速，無法直接作為右室流出道的修補材料。但經過 EDC 法處理后，該補片的降解周期大大延長。我們的觀察顯示：在體內移植后 4 周時，補片的支架結構仍清晰存在，可見補片周圍組織有較多宿主細胞和組織長入；至術后 3 個月，補片的支架結構基本消失，僅有少許崩解的纖維組織殘留，補片大部分為宿主組織所替代。這一時程已足以滿足絕大多數宿主組織的長入。此外，我們還采用抗人線粒體抗體免疫熒光染色證實，直至術后 4 周，補片上仍有植入的種子細胞的存活，這證實，就組織相容而言，這種經 EDC 法處理的膠原海綿是理想的。
從臨床角度而言，本模型也存在著一定局限。比如，本模型利用小動物進行短期在體實驗觀察，不能反映補片遠期是否會出現膨出、鈣化等問題，而這在臨床是影響患者術后心臟功能的重要原因；對絕大多數紫紺型先心病患者而言，植入時合適的補片寬度與患者術后的近、遠期療效均有密切的關系，而由于檢測手段有限，本團隊難以對大鼠這樣的小動物的右心功能進行精確檢測；此外，由于術后缺氧環境的迅速改善，患者體內的內環境也要經歷復雜的病理生理改變；體外循環也會造成多種炎性介質的產生以及內環境的改變等。這些都無法在本模型內得到真實復制。但從組織工程角度而言，作為 EHT 的初選驗證模型，該模型仍不失為一種經濟、有效、簡單的初篩模型。
對以法洛四聯癥為代表的一類紫紺型先天性心臟病（先心病）患兒，采用修補材料，包括自體心包補片進行右室流出道加寬是手術糾治的基本操作之一[1]。但由于目前修補材料的自身局限（如缺乏生長能力，遠期容易發生僵硬、鈣化，缺乏電傳導性能及機械收縮能力），相當一部分患兒仍面臨著二次手術風險[2]。因此，理論上具有全部生物活性的組織工程心肌補片（engineered heart tissues，EHTs）是解決上述問題希望所在[3-4]。為驗證各種 EHTs 的在體生物學行為，有必要建立一種逼真、穩定且經濟的小動物模型。我們利用大鼠構建了右室流出道重建術模型，并初步檢測了補片部分在體生物學性能。
1 材料與方法
1.1 種子細胞的分離和培養
種子細胞均取自擬行手術的紫紺型先心病的患兒（年齡<5 歲）的胸骨骨髓。取材前，本實驗已獲得哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會的批準（倫理號：2014-研-010）并均與患者的監護人簽署了知情同意書。取得的骨髓經梯度密度離心法分離出單個核細胞層置于含有 10% 胎牛血清的改良伊戈氏液（IMDM 培養液）中于低氧培養箱內培養（37℃，1% O2，94% N2，5% CO2），待細胞融合至 80% 左右，0.25% 胰酶消化傳代，取第 3 代（P3）細胞作種子細胞。
1.2 補片制備及分組
膠原補片購自上海其勝生物制劑有限公司，手術前修剪成直徑為 5 mm，厚度為 2 mm 的圓形。采用碳化二亞胺法（EDC 法）對上述膠原補片進行交聯加固處理，補片制備過程見文獻[5-6]。 經強化處理后的補片以 1×106/片的密度種植以上述培養的種子細胞，種植過程見文獻[5]。
1.3 實驗動物及手術操作
實驗動物均為 2 個月齡雌性 Sprague-Dawley（SD）大鼠（體重 220～250 g），購自哈爾濱醫科大學附屬第二醫院動物實驗中心。本實驗所有操作均符合國家及哈爾濱醫科大學關于實驗動物應用及管理的相關規定。
所有實驗動物于補片植入前 3 d 腹腔注射環孢素 A（5 mg/kg）以防止細胞植入后的免疫反應發生。具體手術操作步驟如下：10% 水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，術區備皮，以 16G 靜脈留置針行氣管插管，并連接于小動物呼吸機進行人工呼吸，呼吸頻率為 60 次/分，潮氣量為 1.5 ml。將大鼠置于仰臥位，碘伏消毒手術區域，并固定四肢。正中開胸，逐層分離，剪開胸骨，確切止血，用開胸器撐開胸骨，撕開心包，將心臟很好地顯露于手術野中。以 7-0 Prolene 線于右室流出道環形縫合一荷包，線的兩端穿過 18G 靜脈留置針，收緊荷包線并固定，將右室流出道突起心肌用眼科剪刀剪去，快速松開荷包線，有高速血流噴出以確認透壁切除右室流出道。以 7-0 Prolene 線將上述補片沿切口邊緣縫合。縫合完畢后收緊縫線并打結，緩慢松開荷包線，并輕壓右室流出道進行止血。清除胸腔內血液，無明顯出血點時于呼氣末正壓通氣下逐層關胸。術后 2 d 給予青霉素 G 8 萬單位/250 g，同時給予環孢素 A 5 mg/（kg·d），直至觀察終點。
1.4 實驗取材及切片制備
至術后 4 周時，以上述方式麻醉大鼠后，再次于自胸骨正中開胸，暴露心臟，以 10% 氯化鉀溶液 3 ml 經心尖注射，使心臟停跳于舒張期。將心臟剪下，生理鹽水沖洗后自肺動脈置入球囊，加壓至 30 mm Hg，于固定距離下照相。然后將心臟標本序貫浸泡于 10% 蔗糖 1 h，20% 蔗糖 1 h，30% 蔗糖 24 h 后，于右室流出道長軸切開心臟，干冰速凍并切成 5 μm 厚的冰凍切片。
1.5 補片的降解情況及存活細胞檢測
分別于術后 1 個月、術后 3 個月，隨機選取 3 只大鼠處死，直視攝像后制成冰凍切片，行馬洪（Masson’s trichrome）染色觀察補片降解情況；術后 4 周取 4 只大鼠行抗人線粒體抗體染色以觀察種子細胞存活情況，方法見文獻[5, 7]。
2 結果
2.1 透壁全層切除的驗證
為保證右室流出道心肌為透壁切除，術者在每次切除荷包縫合線內的心肌時都要快速松解荷包線，有高速血流噴出；證明切除為透壁全層切除；此外，在術后 3 d，隨機選取 3 只大鼠處死，內面觀、側面觀；均可證實術后補片成為右室流出道的一部分。
2.2 補片在體降解情況
術后 1 個月時，直視下顯示補片輪廓尚清晰存在（圖 1a），鏡下顯示補片兩側均已內、外膜化，兩側宿主細胞有向補片中心生長的趨勢，補片中心仍有大量纖維組織存在（圖 1b）；至術后 3 個月時，直視下補片輪廓已不可見（圖 1c），鏡下顯示補片的支架結構基本消失，僅有少許崩解的纖維組織殘留，補片大部分為宿主組織所替代（圖 1d）。
圖1
顯微鏡下補片在體降解情況
a、b：術后 1 個月直視下 ，鏡下補片降解情況；c、d：術后 3 個月直視下，鏡下補片降解情況（b、d 馬洪染色 ×100）
2.3 種子細胞存活情況
術后 4 周各只大鼠的抗人線粒體抗體免疫熒光染色顯示：直至移植后 4 周，補片上仍有移植的存活的 hMSCs 的存在（圖 2）。
圖2
顯微鏡下大鼠抗人線粒體抗體免疫熒光染色
a：補片上的細胞核 Dapi 染色（藍色）；b：補片上抗人線粒體抗體染色陽性細胞（箭頭所示，紅色）；c：融合圖 ×200
3 討論
目前，EHTs 作為自體心肌最有希望的替代物，已受到了學界的廣泛青睞，利用各種材料和技術制備的 EHTs 層出不窮[8-10]。因此，建立一種簡單、經濟的小動物模型以在體驗證各種 EHTs 的生物學行為就顯得十分必要。既往，此類模型多在豬、羊等大型動物上建立[11-12]，需在體外循環輔助下進行，不僅所需實驗動物費用昂貴，更需要專業的體外循環人員及輔助設備支撐，經濟性價比較低。顯而易見，此種動物模型不適合組織工程補片的初篩。
本研究組既往曾利用上述補片材料建立了大鼠心肌梗死室壁瘤切除，左室重建術的模型[5-6, 13]，但是，右心系統的病理生理環境畢竟不同于左心系統，上述左室重建的技術平臺能否完整地移植到右心系統，尚未得知。在本研究中，針對大鼠右室流出道的特點，我們對上述技術進行了部分調整：（1）適當縮小荷包縫合的面積：因大鼠右室流出道壓力明顯低于左室，如荷包縫合過大，環縮時右室流出道過窄，容易導致右室過脹而死亡，如果荷包縫合過小，則難以保證心肌的透壁切除；（2）術前觀察好左冠狀動脈前降支的走行，術中盡量避免損傷，否則將導致惡性心律失常或術后左心功能不全，影響模型建立的成功率；此外，在本模型中，保證右室流出道心肌的透壁切除是手術的關鍵之一。因為如果不能保證補片的透壁修補，使補片成為右室流出道的一部分，就不能在體驗證補片的生物力學性能并考察其在體生物學行為。為保證心肌的透壁切除，我們采取了以下幾項措施：（1）如前所述，避免荷包縫合過小，我們的經驗是切除直徑約 5 mm 左右的心肌則基本能保證透壁切除；（2）術中切完心肌后可快速松放荷包線一次，如果有高速血流沖出，則可證明心肌為透壁切除；（3）手術最好在放大眼鏡輔助下進行。
此外，在組織工程材料的研究中，合適的組織降解率以及與種子細胞的相容性也是需要考慮的問題之一[14-16] 。在本研究中，我們的支架材料選用的是經 EDC 法處理過的膠原海綿。膠原海綿來源廣泛，可隨意鑄形，是臨床廣泛使用的止血材料，但質脆易碎，降解迅速，無法直接作為右室流出道的修補材料。但經過 EDC 法處理后，該補片的降解周期大大延長。我們的觀察顯示：在體內移植后 4 周時，補片的支架結構仍清晰存在，可見補片周圍組織有較多宿主細胞和組織長入；至術后 3 個月，補片的支架結構基本消失，僅有少許崩解的纖維組織殘留，補片大部分為宿主組織所替代。這一時程已足以滿足絕大多數宿主組織的長入。此外，我們還采用抗人線粒體抗體免疫熒光染色證實，直至術后 4 周，補片上仍有植入的種子細胞的存活，這證實，就組織相容而言，這種經 EDC 法處理的膠原海綿是理想的。
從臨床角度而言，本模型也存在著一定局限。比如，本模型利用小動物進行短期在體實驗觀察，不能反映補片遠期是否會出現膨出、鈣化等問題，而這在臨床是影響患者術后心臟功能的重要原因；對絕大多數紫紺型先心病患者而言，植入時合適的補片寬度與患者術后的近、遠期療效均有密切的關系，而由于檢測手段有限，本團隊難以對大鼠這樣的小動物的右心功能進行精確檢測；此外，由于術后缺氧環境的迅速改善，患者體內的內環境也要經歷復雜的病理生理改變；體外循環也會造成多種炎性介質的產生以及內環境的改變等。這些都無法在本模型內得到真實復制。但從組織工程角度而言，作為 EHT 的初選驗證模型，該模型仍不失為一種經濟、有效、簡單的初篩模型。
