引用本文： 朱國念, 鐘禮春, 吳思思, 田鑫, 湯小菊. 人 CTGF 基因啟動子熒光素酶報告基因的構建及活性鑒定. 華西醫學, 2020, 35(1): 22-27. doi: 10.7507/1002-0179.201909159 復制
結締組織纖維化基本上是所有形式慢性組織損傷中常見的致病過程。無論是由炎癥反應、代謝損傷、血管功能障礙還是環境因素引起，纖維化過程一旦啟動，就會導致纖維化病變，從而導致器官損傷、衰竭。轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β 長久以來被認為是結締組織形成和維持過程中重要的生長因子，且為較多進行性纖維化疾病的主要推動因素。現在人們也更多地關注結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）在纖維化中的作用[1]。CTGF 是一種分泌蛋白，是即刻早期基因家族中的重要成員，為正常肺發育所必需[2]。上皮細胞構成的黏液屏障系統是機體抵御外源入侵致病因子的第一道防線，其功能損傷在纖維化發生發展中起著重要作用。氣道上皮細胞損傷后自身修復能力降低，導致氣道上皮細胞再生障礙，引起病理性修復，進而會導致肺纖維化的發生。有研究表明 CTGF 的表達增加會誘導肺成纖維細胞的增殖、遷移和分化[3]，我們在前期實驗研究中也發現，博來霉素誘導肺纖維化的形成過程中，氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞 CTGF 表達均增加，但較少有人研究表達變化的上游調控機制。為此，本實驗通過設計啟動子區域引物構建人 CTGF 啟動子熒光素酶表達載體，并對其活性進行驗證，為進一步探究肺上皮細胞中人 CTGF 基因表達的調控機制提供工具。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、細胞株、質粒
Trelief TM 5α 化學感受態細胞購自北京擎科生物科技有限公司，人胚腎細胞 293T、人肺泡上皮細胞 A549、人氣道上皮細胞 HBE 細胞株和載體 pGL3.0-Basic 由本實驗室提供。
1.1.2 主要試劑
金牌 MIX（Green）購于北京擎科生物科技有限公司；限制性內切酶、DNA 連接酶等購于美國 Thermo 公司；瓊脂糖購于西班牙 Biowest 公司；膠回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；質粒提取試劑盒購于美國 Omega 公司；RPMI-1640 培養基和胎牛血清購于美國 Gibco 公司；轉染試劑 Lipofectamine 3000 購自美國 Invitrogen 公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統購自美國 Promega 公司。
1.1.3 主要儀器
聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀（T100 Thermal Cycler，美國 Bio-Rad 公司）；化學發光儀（ChemiDoc MP，美國 Bio-Rad 公司）；恒溫培養箱（Heratherm IGS 180，美國 Thermo 公司）；恒溫搖床（ZWY-100H，上海智城分析儀器制造有限公司）；離心機（Allegra X-15R，美國 Beckman 公司）；生物安全柜（1300 SERIES A2，美國 Thermo 公司）；二氧化碳培養箱（C150，德國 Binder 公司）；多功能熒光酶標儀（Synergy Mx，美國 BioTek 公司）。
1.2 方法
1.2.1 CTGF 基因啟動子區域選取
根據美國國立生物技術信息中心查找的人 CTGF 全基因組序列，選取轉錄起始位點上游 2 kb，并使用此段序列進行后續引物設計。
1.2.2 引物設計和合成
根據 PCR 實驗的設計原則和已選取的人 CTGF 啟動子區域序列，使用 Primer3 在線網站設計特異性引物：在上游引物加入 Xho Ⅰ酶切位點（CTCGAG），在下游引物加入 Hind Ⅲ的酶切位點（AAGCTT），并分別在上下游引物的 5′ 端加上保護堿基，得到上游引物序列（5′-3′）:ACTCTCGAGCAGTGTTCCCACCCTGACAC，下游引物序列（5′-3′）：ACTAAGCTTGGTTGGCACTGCGGGCGGAG。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，啟動子區域（-835/+214）擴增長度為 1 049 bp。
1.2.3 人 CTGF 基因啟動子區域序列擴增
從人外周血中提取全基因組 DNA 作為模板，使用上述合成引物擴增 CTGF 啟動子區域的 DNA 序列。擴增體系為金牌 MIX（Green）45 μL、上下游引物各 2 μL、模板 DNA 1 μL。PCR 反應參數設置如下：98℃ 預變性 2 min，98℃ 變性 10 s，55℃ 退火 15 s，72℃ 延伸 20 s，擴增 40 個循環；72℃ 最后延伸 5 min。配制 1% 瓊脂糖凝膠，取 PCR 產物 10 μL 在 120 V 電泳 30 min 后使用化學發光儀觀察電泳條帶位置。
1.2.4 重組載體 pGL3.0-Basic-CTGF 的構建和鑒定
1% 瓊脂糖凝膠電泳后切出目的條帶，用試劑盒純化 PCR 產物后再次電泳確認。確認以后使用 XhoⅠ酶、HindⅢ酶對膠回收純化產物和空白載體 pGL3.0-Basic 進行 37℃ 雙酶切過夜，用同樣的方法純化回收過夜的酶切物。
將純化后的 pGL3.0-Basic 載體和 CTGF 片段進行連接反應。連接體系為酶切純化后 pGL3.0-Basic 載體 2 μL、酶切純化后 CTGF 片段 4 μL、T4 DNA 連接酶 0.8 μL、T4 DNA 連接酶緩沖液（5×）2 μL、雙蒸水 1.2 μL，共 10 μL 體系，置于 PCR 中 16℃ 連接過夜。連接后的產物使用超級感受態細胞 Trelief TM 5α 進行轉化，之后將細胞沉淀接種到含氨芐霉素的 LB 固體培養平板中培養篩選過夜。
在每個培養平板中選取 5 個單克隆菌落，各用 5 μL 的無菌水溶解得到菌液，取 2 μL 作為模板進行菌落 PCR，擴增后采用 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定；剩余 3 μL 菌液加入到 3 mL 含氨芐霉素的 LB 液體培養基中，37℃、220 r/min 培養過夜，然后小提質粒。提取得到的質粒用 XhoⅠ酶、HindⅢ酶雙酶切 2 h，瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段是否插入。對經過初步鑒定的質粒進行測序，將重組載體命名為 pGL3.0-Basic-CTGF。
1.2.5 細胞培養與轉染
293T、HBE、A549 細胞分別培養在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培養基和 RPMI-1640 培養基中（兩種培養基均含 10% 胎牛血清、100 μg/mL 青/鏈霉素），培養條件為 37℃、5% 二氧化碳。用 0.25% 胰蛋白酶消化細胞后進行鋪板，細胞轉染實驗按 Lipofectamine 3000 轉染試劑盒提供的方案進行操作。
1.2.6 熒光素酶活性檢測
用美國 Promega 公司的雙熒光素酶報告基因檢測系統進行樣品熒光素酶活性檢測，具體方法如下：轉染前 1 d 在 48 孔板中接種細胞，6×104個/孔，至細胞融合度約為 50% 時使用 Lipofectamine 3000 進行質粒共轉染，設置對照組（pGL3.0-Basic 0.25 μg+海腎素質粒 0.025 μg 共轉染）和實驗組（pGL3.0-Basic-CTGF 0.25 μg +海腎素質粒 0.025 μg 共轉染），分別轉染至 293T、HBE 和 A549 細胞中。轉染質粒 48 h 以后吸走舊培養基，用磷酸鹽緩沖液輕柔清洗細胞 1 次，在每個孔中加入 65 μL 的被動裂解液，在 96 孔檢測板（黑色）的孔中加 20 μL 被動裂解液，再向檢測孔中加 100 μL 熒光素酶檢測試劑Ⅱ進行混合，檢測熒光素酶活性。最后再向檢測孔中加入 100 μL 猝滅劑 Stop&Glo Reagent，使用酶標儀測定海腎素熒光素酶活性。質粒熒光素酶活性和海腎素熒光酶活性的比值可作為衡量 CTGF 啟動子活性的依據。
1.3 統計學方法
使用 SPSS 21.0 軟件處理各組熒光素酶活性的實驗結果，組間比較采用析因設計資料的方差分析，檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 人 CTGF 啟動子區域擴增結果
以人外周血基因組 DNA 作為模板擴增 CTGF 啟動子區域序列，得到長度為 1 049 bp（以翻譯起始點 ATG 為 +1，擴增區域為 ?835/+214）的片段，PCR 產物凝膠電泳鑒定結果見圖 1，CTGF 啟動子擴增片段大小約為 1 000 bp。
圖1
PCR 擴增 CTGF 啟動子片段電泳圖
2.2 菌落 PCR 擴增初步鑒定結果
菌落 PCR 初步驗證結果如圖 2 所示，CTGF 泳道中箭頭所指擴增條帶大小約為 1 000 bp。
圖2
菌落 PCR 實驗初步鑒定電泳結果圖
2.3 pGL3.0-Basic-CTGF 質粒鑒定結果
pGL3.0-Basic-CTGF 質粒提取后雙酶切鑒定結果如圖 3 所示，圖中顯示了 pGL3.0-Basic-CTGF 在相應片段大小的位置切出來載體條帶和目的 DNA 片段，釋放出 1 049 bp 大小的片段。同時測序結果也證實 pGL3.0-Basic-CTGF 質粒包含了 CTGF 序列，圖 4 比對結果可知測序序列與 GenBank 里人啟動子序列匹配度達 99.50%；圖 5 測序峰圖可知峰形單一且連續，無雜峰套峰，說明包含了 CTGF 啟動子序列的報告基因載體構建成功。
圖3
pGL3.0-Basic-CTGF 雙酶切鑒定電泳圖
圖4
pGL3.0-Basic-CTGF 質粒測序后與 GenBank 里人 CTGF 序列比對結果
上下比對全是藍色即為完全匹配，一致性較高
圖5
pGL3.0-Basic-CTGF 質粒測序結果峰圖
2.4 pGL3.0-Basic-CTGF 熒光素酶活性檢測結果
pGL3.0-Basic-CTGF 在 293T、HBE 和 A549 細胞中均有熒光素酶活性，分別為 2.416、0.027、0.121，差異有統計學意義（P<0.01），表明人 pGL3.0-Basic-CTGF 載體構建成功（圖 6a～6c）。根據析因設計資料的方差分析可得 pGL3.0-Basic-CTGF 在肺泡上皮細胞 A549 中的啟動子活性明顯高于氣道上皮細胞 HBE（圖 6d），可為后續轉錄調控研究提供工具。
圖6
pGL3.0-Basic-CTGF 和 pGL3.0-Basic 在不同細胞中熒光素酶活性檢測
**表示與 pGL3.0-Basic 比較，
3 討論
纖維化過程被認為是正常組織在修復過程中的失調導致的嚴重組織瘢痕形成，包括成纖維細胞的增殖過程、上皮細胞損傷修復、細胞外基質組分的產生和積累等系列的過程。增殖性疾病和慢性纖維化的特征在于過度和持續的瘢痕形成，容易導致器官功能的障礙和完全喪失，而 CTGF 作為此類疾病中經常涉及到的一個因素，是一個治療纖維化的全新靶點[4]。
CTGF 是一種富含半胱氨酸的細胞外基質蛋白。其主要包含 4 個亞單元，在進化中高度保守，形成的蛋白相對分子質量約為 38×103。CTGF 最早發現于人臍靜脈內皮系，研究發現 CTGF 基因在各組織分化與生長過程中發揮重要調節作用，可通過促進細胞增殖、遷徙、黏附與分化等參與血管生成、軟骨分化、傷口愈合等病理生理進程[5-7]，同時在干預腫瘤轉移方面也有一定的應用前景。CTGF 可以通過與不同的受體或整合素[8]結合，參與調控細胞增殖凋亡、組織黏附與細胞遷移[9]及新血管生成等過程，進而介導纖維化過程。同時，越來越多的來自組織重塑和纖維化的體內、體外模型證據表明，CTGF 可代表 TGF-β 在維持和修復結締組織和纖維化疾病環境中的促纖維化活性的下游效應分子[10]，CTGF 能夠獨立驅動成纖維細胞的增殖和基質沉積，并在急性纖維化模型中其與 TGF-β 具有協同作用[11]。據報道，采用特異性抗體如 Pamrevlumab、抑制劑或基因編輯等手段抑制或阻斷 CTGF 的表達，可緩解多種組織器官的纖維進展，如腎間質纖維化、神經纖維化、肺纖維化等[12-15]，由此可知，CTGF 在肺纖維化發生發展中具有重要作用，且在纖維化治療過程中有一定的實際應用前景。
然而關于 CTGF 的上游調控途徑目前研究并不多，CTGF 自身被轉錄調控的分子機制也尚不清楚。因此，本研究選取了 CTGF 啟動子區域的序列設計引物進行擴增，克隆了人 CTGF 基因上游 5′ 非翻譯區上游 1 049 bp 的 DNA 序列作為 CTGF 啟動子，構建了人 CTGF 啟動子熒光素酶報告基因真核表達質粒；通過雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳和測序可知插入的 DNA 片段大小和序列順序與美國國立生物技術信息中心庫序列一致，且插入方向無誤。雙熒光素酶檢測是一種研究細胞生物學功能的技術，是檢測轉錄因子特異性結合其靶啟動子序列的重要手段。其可以驗證潛在的啟動子片段在各種細胞環境下啟動熒光素酶報告基因表達的能力，也可以用來篩選和分析啟動子中的結合元素[16]。本研究使用雙熒光素酶試劑盒驗證質粒的啟動活性，實驗結果表明將重組載體 pGL3.0-Basic-CTGF 分別轉染于 A549 細胞和 HBE 細胞后，均檢測到熒光素酶活性，提示該重組載體構建成功，可為后續深入研究提供工具。同時本研究發現轉染于肺泡上皮細胞 A549 中的 CTGF 啟動子活性明顯高于氣道上皮細胞 HBE，分析其原因，一方面可能是由相同條件下，重組質粒轉染于 A549 細胞的效率顯著高于 HBE 細胞所致；另一方面，A549 和 HBE 細胞雖然都是肺上皮細胞，但 A549 細胞實際上是一種非小細胞肺癌細胞株，故 CTGF 在這兩種細胞中的基礎表達水平是不一樣的，但具體原因需進一步研究證實。
CTGF 是一種低表達的多功能肝素結合糖蛋白，幾乎在所有的纖維化病癥中都有顯著富集，因此在肺、心血管系統或肝臟中抑制 CTGF 具有逆轉組織纖維化過程的潛力，已有研究表明 CTGF 的調節有助于纖維化發生的多個進程[15]。本研究將為后續工作奠定堅實的基礎。后續研究可通過使用本研究構建的人 CTGF 基因啟動子熒光素酶報告基因載體和上下游相關轉錄因子共轉染于細胞中，觀察其轉錄活性，并結合染色質免疫共沉淀進一步驗證其功能，篩選和鑒定出能夠調控 CTGF 轉錄水平的相關因子，為研究防治肺纖維化新的潛在治療靶點提供工具。
綜上所述，本實驗成功構建人 CTGF 啟動子熒光素酶報告基因載體，并驗證其有啟動活性，為進一步探究肺上皮細胞中人 CTGF 基因表達的調控機制提供了工具。
結締組織纖維化基本上是所有形式慢性組織損傷中常見的致病過程。無論是由炎癥反應、代謝損傷、血管功能障礙還是環境因素引起，纖維化過程一旦啟動，就會導致纖維化病變，從而導致器官損傷、衰竭。轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β 長久以來被認為是結締組織形成和維持過程中重要的生長因子，且為較多進行性纖維化疾病的主要推動因素。現在人們也更多地關注結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）在纖維化中的作用[1]。CTGF 是一種分泌蛋白，是即刻早期基因家族中的重要成員，為正常肺發育所必需[2]。上皮細胞構成的黏液屏障系統是機體抵御外源入侵致病因子的第一道防線，其功能損傷在纖維化發生發展中起著重要作用。氣道上皮細胞損傷后自身修復能力降低，導致氣道上皮細胞再生障礙，引起病理性修復，進而會導致肺纖維化的發生。有研究表明 CTGF 的表達增加會誘導肺成纖維細胞的增殖、遷移和分化[3]，我們在前期實驗研究中也發現，博來霉素誘導肺纖維化的形成過程中，氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞 CTGF 表達均增加，但較少有人研究表達變化的上游調控機制。為此，本實驗通過設計啟動子區域引物構建人 CTGF 啟動子熒光素酶表達載體，并對其活性進行驗證，為進一步探究肺上皮細胞中人 CTGF 基因表達的調控機制提供工具。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、細胞株、質粒
Trelief TM 5α 化學感受態細胞購自北京擎科生物科技有限公司，人胚腎細胞 293T、人肺泡上皮細胞 A549、人氣道上皮細胞 HBE 細胞株和載體 pGL3.0-Basic 由本實驗室提供。
1.1.2 主要試劑
金牌 MIX（Green）購于北京擎科生物科技有限公司；限制性內切酶、DNA 連接酶等購于美國 Thermo 公司；瓊脂糖購于西班牙 Biowest 公司；膠回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；質粒提取試劑盒購于美國 Omega 公司；RPMI-1640 培養基和胎牛血清購于美國 Gibco 公司；轉染試劑 Lipofectamine 3000 購自美國 Invitrogen 公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統購自美國 Promega 公司。
1.1.3 主要儀器
聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀（T100 Thermal Cycler，美國 Bio-Rad 公司）；化學發光儀（ChemiDoc MP，美國 Bio-Rad 公司）；恒溫培養箱（Heratherm IGS 180，美國 Thermo 公司）；恒溫搖床（ZWY-100H，上海智城分析儀器制造有限公司）；離心機（Allegra X-15R，美國 Beckman 公司）；生物安全柜（1300 SERIES A2，美國 Thermo 公司）；二氧化碳培養箱（C150，德國 Binder 公司）；多功能熒光酶標儀（Synergy Mx，美國 BioTek 公司）。
1.2 方法
1.2.1 CTGF 基因啟動子區域選取
根據美國國立生物技術信息中心查找的人 CTGF 全基因組序列，選取轉錄起始位點上游 2 kb，并使用此段序列進行后續引物設計。
1.2.2 引物設計和合成
根據 PCR 實驗的設計原則和已選取的人 CTGF 啟動子區域序列，使用 Primer3 在線網站設計特異性引物：在上游引物加入 Xho Ⅰ酶切位點（CTCGAG），在下游引物加入 Hind Ⅲ的酶切位點（AAGCTT），并分別在上下游引物的 5′ 端加上保護堿基，得到上游引物序列（5′-3′）:ACTCTCGAGCAGTGTTCCCACCCTGACAC，下游引物序列（5′-3′）：ACTAAGCTTGGTTGGCACTGCGGGCGGAG。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，啟動子區域（-835/+214）擴增長度為 1 049 bp。
1.2.3 人 CTGF 基因啟動子區域序列擴增
從人外周血中提取全基因組 DNA 作為模板，使用上述合成引物擴增 CTGF 啟動子區域的 DNA 序列。擴增體系為金牌 MIX（Green）45 μL、上下游引物各 2 μL、模板 DNA 1 μL。PCR 反應參數設置如下：98℃ 預變性 2 min，98℃ 變性 10 s，55℃ 退火 15 s，72℃ 延伸 20 s，擴增 40 個循環；72℃ 最后延伸 5 min。配制 1% 瓊脂糖凝膠，取 PCR 產物 10 μL 在 120 V 電泳 30 min 后使用化學發光儀觀察電泳條帶位置。
1.2.4 重組載體 pGL3.0-Basic-CTGF 的構建和鑒定
1% 瓊脂糖凝膠電泳后切出目的條帶，用試劑盒純化 PCR 產物后再次電泳確認。確認以后使用 XhoⅠ酶、HindⅢ酶對膠回收純化產物和空白載體 pGL3.0-Basic 進行 37℃ 雙酶切過夜，用同樣的方法純化回收過夜的酶切物。
將純化后的 pGL3.0-Basic 載體和 CTGF 片段進行連接反應。連接體系為酶切純化后 pGL3.0-Basic 載體 2 μL、酶切純化后 CTGF 片段 4 μL、T4 DNA 連接酶 0.8 μL、T4 DNA 連接酶緩沖液（5×）2 μL、雙蒸水 1.2 μL，共 10 μL 體系，置于 PCR 中 16℃ 連接過夜。連接后的產物使用超級感受態細胞 Trelief TM 5α 進行轉化，之后將細胞沉淀接種到含氨芐霉素的 LB 固體培養平板中培養篩選過夜。
在每個培養平板中選取 5 個單克隆菌落，各用 5 μL 的無菌水溶解得到菌液，取 2 μL 作為模板進行菌落 PCR，擴增后采用 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定；剩余 3 μL 菌液加入到 3 mL 含氨芐霉素的 LB 液體培養基中，37℃、220 r/min 培養過夜，然后小提質粒。提取得到的質粒用 XhoⅠ酶、HindⅢ酶雙酶切 2 h，瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段是否插入。對經過初步鑒定的質粒進行測序，將重組載體命名為 pGL3.0-Basic-CTGF。
1.2.5 細胞培養與轉染
293T、HBE、A549 細胞分別培養在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培養基和 RPMI-1640 培養基中（兩種培養基均含 10% 胎牛血清、100 μg/mL 青/鏈霉素），培養條件為 37℃、5% 二氧化碳。用 0.25% 胰蛋白酶消化細胞后進行鋪板，細胞轉染實驗按 Lipofectamine 3000 轉染試劑盒提供的方案進行操作。
1.2.6 熒光素酶活性檢測
用美國 Promega 公司的雙熒光素酶報告基因檢測系統進行樣品熒光素酶活性檢測，具體方法如下：轉染前 1 d 在 48 孔板中接種細胞，6×104個/孔，至細胞融合度約為 50% 時使用 Lipofectamine 3000 進行質粒共轉染，設置對照組（pGL3.0-Basic 0.25 μg+海腎素質粒 0.025 μg 共轉染）和實驗組（pGL3.0-Basic-CTGF 0.25 μg +海腎素質粒 0.025 μg 共轉染），分別轉染至 293T、HBE 和 A549 細胞中。轉染質粒 48 h 以后吸走舊培養基，用磷酸鹽緩沖液輕柔清洗細胞 1 次，在每個孔中加入 65 μL 的被動裂解液，在 96 孔檢測板（黑色）的孔中加 20 μL 被動裂解液，再向檢測孔中加 100 μL 熒光素酶檢測試劑Ⅱ進行混合，檢測熒光素酶活性。最后再向檢測孔中加入 100 μL 猝滅劑 Stop&Glo Reagent，使用酶標儀測定海腎素熒光素酶活性。質粒熒光素酶活性和海腎素熒光酶活性的比值可作為衡量 CTGF 啟動子活性的依據。
1.3 統計學方法
使用 SPSS 21.0 軟件處理各組熒光素酶活性的實驗結果，組間比較采用析因設計資料的方差分析，檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 人 CTGF 啟動子區域擴增結果
以人外周血基因組 DNA 作為模板擴增 CTGF 啟動子區域序列，得到長度為 1 049 bp（以翻譯起始點 ATG 為 +1，擴增區域為 ?835/+214）的片段，PCR 產物凝膠電泳鑒定結果見圖 1，CTGF 啟動子擴增片段大小約為 1 000 bp。
圖1
PCR 擴增 CTGF 啟動子片段電泳圖
2.2 菌落 PCR 擴增初步鑒定結果
菌落 PCR 初步驗證結果如圖 2 所示，CTGF 泳道中箭頭所指擴增條帶大小約為 1 000 bp。
圖2
菌落 PCR 實驗初步鑒定電泳結果圖
2.3 pGL3.0-Basic-CTGF 質粒鑒定結果
pGL3.0-Basic-CTGF 質粒提取后雙酶切鑒定結果如圖 3 所示，圖中顯示了 pGL3.0-Basic-CTGF 在相應片段大小的位置切出來載體條帶和目的 DNA 片段，釋放出 1 049 bp 大小的片段。同時測序結果也證實 pGL3.0-Basic-CTGF 質粒包含了 CTGF 序列，圖 4 比對結果可知測序序列與 GenBank 里人啟動子序列匹配度達 99.50%；圖 5 測序峰圖可知峰形單一且連續，無雜峰套峰，說明包含了 CTGF 啟動子序列的報告基因載體構建成功。
圖3
pGL3.0-Basic-CTGF 雙酶切鑒定電泳圖
圖4
pGL3.0-Basic-CTGF 質粒測序后與 GenBank 里人 CTGF 序列比對結果
上下比對全是藍色即為完全匹配，一致性較高
圖5
pGL3.0-Basic-CTGF 質粒測序結果峰圖
2.4 pGL3.0-Basic-CTGF 熒光素酶活性檢測結果
pGL3.0-Basic-CTGF 在 293T、HBE 和 A549 細胞中均有熒光素酶活性，分別為 2.416、0.027、0.121，差異有統計學意義（P<0.01），表明人 pGL3.0-Basic-CTGF 載體構建成功（圖 6a～6c）。根據析因設計資料的方差分析可得 pGL3.0-Basic-CTGF 在肺泡上皮細胞 A549 中的啟動子活性明顯高于氣道上皮細胞 HBE（圖 6d），可為后續轉錄調控研究提供工具。
圖6
pGL3.0-Basic-CTGF 和 pGL3.0-Basic 在不同細胞中熒光素酶活性檢測
**表示與 pGL3.0-Basic 比較，
3 討論
纖維化過程被認為是正常組織在修復過程中的失調導致的嚴重組織瘢痕形成，包括成纖維細胞的增殖過程、上皮細胞損傷修復、細胞外基質組分的產生和積累等系列的過程。增殖性疾病和慢性纖維化的特征在于過度和持續的瘢痕形成，容易導致器官功能的障礙和完全喪失，而 CTGF 作為此類疾病中經常涉及到的一個因素，是一個治療纖維化的全新靶點[4]。
CTGF 是一種富含半胱氨酸的細胞外基質蛋白。其主要包含 4 個亞單元，在進化中高度保守，形成的蛋白相對分子質量約為 38×103。CTGF 最早發現于人臍靜脈內皮系，研究發現 CTGF 基因在各組織分化與生長過程中發揮重要調節作用，可通過促進細胞增殖、遷徙、黏附與分化等參與血管生成、軟骨分化、傷口愈合等病理生理進程[5-7]，同時在干預腫瘤轉移方面也有一定的應用前景。CTGF 可以通過與不同的受體或整合素[8]結合，參與調控細胞增殖凋亡、組織黏附與細胞遷移[9]及新血管生成等過程，進而介導纖維化過程。同時，越來越多的來自組織重塑和纖維化的體內、體外模型證據表明，CTGF 可代表 TGF-β 在維持和修復結締組織和纖維化疾病環境中的促纖維化活性的下游效應分子[10]，CTGF 能夠獨立驅動成纖維細胞的增殖和基質沉積，并在急性纖維化模型中其與 TGF-β 具有協同作用[11]。據報道，采用特異性抗體如 Pamrevlumab、抑制劑或基因編輯等手段抑制或阻斷 CTGF 的表達，可緩解多種組織器官的纖維進展，如腎間質纖維化、神經纖維化、肺纖維化等[12-15]，由此可知，CTGF 在肺纖維化發生發展中具有重要作用，且在纖維化治療過程中有一定的實際應用前景。
然而關于 CTGF 的上游調控途徑目前研究并不多，CTGF 自身被轉錄調控的分子機制也尚不清楚。因此，本研究選取了 CTGF 啟動子區域的序列設計引物進行擴增，克隆了人 CTGF 基因上游 5′ 非翻譯區上游 1 049 bp 的 DNA 序列作為 CTGF 啟動子，構建了人 CTGF 啟動子熒光素酶報告基因真核表達質粒；通過雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳和測序可知插入的 DNA 片段大小和序列順序與美國國立生物技術信息中心庫序列一致，且插入方向無誤。雙熒光素酶檢測是一種研究細胞生物學功能的技術，是檢測轉錄因子特異性結合其靶啟動子序列的重要手段。其可以驗證潛在的啟動子片段在各種細胞環境下啟動熒光素酶報告基因表達的能力，也可以用來篩選和分析啟動子中的結合元素[16]。本研究使用雙熒光素酶試劑盒驗證質粒的啟動活性，實驗結果表明將重組載體 pGL3.0-Basic-CTGF 分別轉染于 A549 細胞和 HBE 細胞后，均檢測到熒光素酶活性，提示該重組載體構建成功，可為后續深入研究提供工具。同時本研究發現轉染于肺泡上皮細胞 A549 中的 CTGF 啟動子活性明顯高于氣道上皮細胞 HBE，分析其原因，一方面可能是由相同條件下，重組質粒轉染于 A549 細胞的效率顯著高于 HBE 細胞所致；另一方面，A549 和 HBE 細胞雖然都是肺上皮細胞，但 A549 細胞實際上是一種非小細胞肺癌細胞株，故 CTGF 在這兩種細胞中的基礎表達水平是不一樣的，但具體原因需進一步研究證實。
CTGF 是一種低表達的多功能肝素結合糖蛋白，幾乎在所有的纖維化病癥中都有顯著富集，因此在肺、心血管系統或肝臟中抑制 CTGF 具有逆轉組織纖維化過程的潛力，已有研究表明 CTGF 的調節有助于纖維化發生的多個進程[15]。本研究將為后續工作奠定堅實的基礎。后續研究可通過使用本研究構建的人 CTGF 基因啟動子熒光素酶報告基因載體和上下游相關轉錄因子共轉染于細胞中，觀察其轉錄活性，并結合染色質免疫共沉淀進一步驗證其功能，篩選和鑒定出能夠調控 CTGF 轉錄水平的相關因子，為研究防治肺纖維化新的潛在治療靶點提供工具。
綜上所述，本實驗成功構建人 CTGF 啟動子熒光素酶報告基因載體，并驗證其有啟動活性，為進一步探究肺上皮細胞中人 CTGF 基因表達的調控機制提供了工具。
