目的 探索過表達 TBX3、TBX18 在人源誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cells，HiPS）向竇房結樣細胞富集分化的作用。方法 取 HiPS，采用實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測其干性標記物 OCT3/4、SOX2、NANOG 表達，并與人胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESCs）比較；免疫熒光染色觀察 HiPS 干性標記物 OCT3/4、NANOG、SSEA4 和 TRA-1-60 表達。將 HiPS 向心肌細胞定向分化，qRT-PCR 檢測心肌前體細胞特異性基因 ISL1、NKX2-5（NK2 homeobox 5）以及心肌細胞特異標記物 ACTN1、TNNT2 表達，以成人心肌細胞（human adult cardiomyocytes，hACM）作為陽性對照；免疫熒光染色觀察心肌前體細胞特異核轉錄因子 NKX2-5，心肌細胞特異性收縮蛋白肌球蛋白（cardiac troponin，cTnT）、α-輔肌動蛋白（α-actinin），以及心房肌球蛋白輕鏈（myosin light chain 2A，MLC-2A）和心室肌球蛋白輕鏈（myosin light chain 2V，MLC-2V）表達；流式細胞術檢測 α-actinin 陽性率。在 HiPS 向心肌細胞定向分化第 3 天（中胚層階段），以慢病毒方式過表達竇房結相關基因 TBX3、TBX18，繼續培養至 21 d，采用 qRT-PCR 檢測竇房結細胞特異性標記物 TBX3、TBX18、SHOX2、NKX2-5、HCN4、HCN1 相對表達量，以增強綠色熒光蛋白空白病毒為對照。結果 OCT3/4、SOX2、NANOG 在 HiPS 和 ESCs 中均高表達，各基因相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）；OCT3/4 和 NANOG 在 HiPS 中特異分布于細胞核中，SSEA4 和 TRA-1-60 分布于細胞膜上。HiPS 向心肌細胞分化 5、7、21、28 d 時 ISL1 基因以及分化 7、21、28 d 時 NKX2-5 基因相對表達量均顯著高于 hACM（P<0.05），分化 3、5、7、21 d ACTN1 和 TNNT2 基因相對表達量均顯著低于 hACM（P<0.05）。NKX2-5 在絕大部分細胞核中表達；cTnT 和 α-actinin，MLC-2A 和 MLC-2V 信號定位于細胞質中，并初步呈現出肌小結紋理樣結構。流式細胞術檢測示 HiPS 向心肌細胞誘導分化成功。過表達 TBX3 組中，TBX18、SHOX2、HCN4、HCN1 較對照組表達均有上調，且 SHOX2 基因相對表達量差異有統計學意義（P<0.05）；NKX2-5 基因相對表達量雖低于對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）。過表達 TBX18 組中，各基因相對表達量與對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。結論 HiPS 和 hESCs 的多能性相近，建立了穩定的 HiPS 干性維持及培養方法；成功建立 HiPS 向心肌細胞高效分化技術平臺；盡管 TBX3、TBX18 在 HiPS 向竇房結樣細胞富集分化中的促進作用不顯著，但 TBX3 呈現出一定促進趨勢，未來可進一步探索。
目的探討聯合調控 Wnt 和 BMP 信號通路在人源誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）分化為心肌細胞中的作用。方法復蘇 hiPSCs 培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，免疫熒光染色鑒定多能性標記物 OCT3/4、NANOG 和 TRA-1-60 表達；傳代培養 hiPSCs，取 35 代以內細胞進行后續實驗。待細胞融合接近 100% 時開始分化（記為分化第 0 天），加入 Wnt 通路激活劑 CHIR99021。于分化第 3 天加入不同濃度的 IWP4（Wnt 通路抑制劑），實時熒光定量 PCR 檢測心肌細胞特異性標記物肌鈣蛋白 T（troponin T，TNNT2）mRNA 表達，篩選 IWP4 最佳濃度；在不同時間點加入最佳濃度 IWP4，通過比較 TNNT2 mRNA 表達篩選最佳作用時間。然后，在加入 CHIR99021 和 IWP4 基礎上于分化第 5 天加入不同濃度 BMP-4 以及不同時間點加入 BMP-4，通過檢測 TNNT2 mRNA 表達篩選 BMP-4 最佳濃度及最佳作用時間。最后，將 hiPSCs 分為 3 組，Wnt 調控組、BMP 調控組和 Wnt+BMP 聯合調控組，在分化第 0 天加入 CHIR99021 基礎上，分別按照篩選結果加入 IWP4、BMP-4、IWP4+BMP-4。收集分化第 7、15 天細胞，實時熒光定量 PCR 檢測心肌前體細胞標記物 ISL1（ISL LIM homeobox 1）、NKX2-5（NK2 homeobox 5）以及心肌細胞特異性標記肌細胞增強因子 2C（myocyte enhancer factor 2C，MEF2C）、肌球蛋白輕鏈 2（myosin light chain 2，MYL2）、MYL7 及 TNNT2 mRNA 表達；收集分化第 28 天細胞，流式細胞術及免疫熒光染色檢測心肌細胞特異性蛋白心肌肌鈣蛋白 T（cardiac troponin T，cTnT）表達。結果細胞形態及免疫熒光染色觀察顯示 hiPSCs 表達多能性標記物 OCT3/4、NANOG 和 TRA-1-60，提示其具有良好的多能性特點。IWP4 促 hiPSCs 向心肌細胞分化的最佳濃度為 10.0 μmol/L（P<0.05），最佳作用時間是分化第 3 天（P<0.05）。BMP-4 促 hiPSCs 向心肌細胞分化的最佳濃度為 20.0 ng/mL（P<0.05），最佳作用時間是分化第 3 天（P<0.05）。Wnt+BMP 聯合調控組 ISL1、NKX2-5 以及 MEF2C、MYL2、MYL7、TNNT2 mRNA 相對表達量，cTnT 陽性表達率，以及免疫熒光染色 cTnT 陽性表達和肌節結構，均優于 Wnt 調控組，相關定量指標差異均有統計學意義（P<0.05）。結論聯合調控 Wnt 和 BMP 信號通路可以提高 hiPSCs 誘導分化為心肌細胞的效率。