引用本文： 閆穎, 劉鋒, 侯曉杰, 萬居易, 熊琪, 周銳, 廖斌. 聯合調控 Wnt 和 BMP 信號通路促進人源誘導多能干細胞分化為心肌細胞的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(10): 1313-1321. doi: 10.7507/1002-1892.201912087 復制
心肌細胞在缺血缺氧壞死后很難再生，當大面積心肌細胞壞死危及患者生命時，常規治療手段（如藥物、介入及手術等）難以修復受損的心肌細胞，而心臟移植由于供體有限也無法廣泛應用于臨床[1]。人源誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）是具有類似于胚胎干細胞的全能性干細胞，能自主增殖和分化。由于 hiPSCs 可以由患者的體細胞重編程獲取，從而避免了胚胎干細胞的倫理問題和移植后免疫排斥反應，逐漸成為干細胞生物學和臨床再生/修復醫學理想的種子細胞[2-3]。研究發現 hiPSCs 分化而來的心肌細胞可以修復壞死的心肌組織，是目前挽救心肌壞死患者生命最有前景的治療措施之一。
干細胞可以自然分化為心肌細胞，但比例極低，遠遠無法滿足臨床治療需求。為此研究者嘗試各種方法提高干細胞向心肌細胞的分化效率，如采用環孢菌素[4]、維生素 C[5]、抑瘤素 M[6]等化學藥物誘導，或者將干細胞接種在靜電紡絲聚己內酯納米纖維仿生支架上進行分化培養[7]等。上述方法均可提高心肌細胞分化效率，但還有上升空間。為了獲得穩定且高效的心肌細胞分化效率，研究者從胚胎心臟發育學角度進行探索，發現調控與胚胎心臟發育相關的通路來誘導干細胞向心肌細胞分化，可以獲得相對穩定且較高的分化效率[8-9]。在脊椎動物體內，心臟發育是多條信號通路聯合調控的結果，其中 Wnt/β-catenin 和 BMP 信號通路發揮著重要作用[10]。Wnt/β-catenin 是雙相作用，早期發揮激活作用促進中胚層發育，隨后發揮抑制作用促進中胚層向心肌前體細胞發育[11]。BMP 信號通路在心臟左心室、瓣膜、流出道及心內膜墊等發育中發揮重要作用[12-13]。研究顯示將 Wnt 拮抗劑與 BMP 重疊表達于非洲爪蟾胚胎的前外側區域，共同促進心臟發育[14]。基于 Wnt/β-catenin 和 BMP 信號通路可協同促進心臟發育，本研究采用聯合調控 Wnt 和 BMP 信號通路方法誘導 hiPSCs 向心肌細胞分化，以期為臨床治療心肌壞死的種子細胞來源提供方法學參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
hiPSCs（LHPB-YaabC3）、BioCISO hiPSCs 維持培養基（廣州皓昇萊生物制藥有限公司）；Matrigel 基質膠（Corning 公司，美國）；DMEM、RPMI1640、0.02% EDTA 溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA（GIBCO 公司，美國）；Wnt 通路抑制劑 IWP4（Selleck 公司，美國）；Wnt 通路激活劑 CHIR99021（StemCell 公司，加拿大）；BMP-4（Peprotech 公司，美國）；4% 多聚甲醛（上海碧云天生物技術有限公司）；RNA 提取試劑 Nucleo Zol（MN 公司，德國）；逆轉錄試劑盒（Toyobo 公司，日本）；熒光定量 PCR 試劑盒（Qiagen 公司，美國）；抗 OCT3/4、NANOG、TRA-1-60、Alexa Fluor594 標記抗兔二抗（Cell Signaling Technology 公司，美國）；抗心肌肌鈣蛋白 T（cardiac troponin T，cTnT）抗體（Proteintech Group 公司，美國）；Alexa Fluor488 標記抗兔二抗、Alexa Fluor488 標記抗鼠二抗（Abcam 公司，美國）。
CO2 孵箱（SANYO 公司，日本）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；實時熒光定量 PCR 儀、低溫高速離心機（Thermo Fisher 公司，美國）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；紫外分光光度儀（NanoDrop 公司，德國）；U-8 培養皿（Ibidi 公司，德國）。
1.2 hiPSCs 培養及鑒定
1.2.1 hiPSCs 培養
復蘇 LHPB-YaabC3，BioCISO hiPSCs 維持培養基重懸后均勻接種在 Matrigel 包被的 6 cm 培養皿中，置于 37℃、5%CO2 孵箱中培養，每天更換培養基。待細胞融合達 50% 左右時，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。待細胞融合達 80% 左右時傳代至 12 孔板，取 35 代以內的 hiPSCs 用于后續實驗。
1.2.2 免疫熒光染色觀察 hiPSCs 多能性標記物表達
取 hiPSCs 均勻接種至 U-8 培養皿中，置于 37℃、5%CO2 孵箱中孵育 36 h；吸棄細胞培養基，PBS 洗脫，4% 多聚甲醛固定 30 min，0.5%Triton X-100 通透 10 min，牛血清白蛋白封閉 30 min。加入一抗 OCT3/4（1∶200）、NANOG（1∶400）、TRA-1-60（1∶400），4℃ 過夜。Alexa Fluor488（1∶500）和 Alexa Fluor594（1∶500）標記二抗，避光孵育 1 h。DAPI 染核 10 min，熒光顯微鏡觀察。
1.3 IWP4 促 hiPSCs 分化為心肌細胞的最佳濃度及作用時間篩選
1.3.1 IWP4 最佳濃度篩選
取 hiPSCs 按照 1.2×105個/孔密度接種至 12 孔板，待細胞融合接近 100% 時（記為分化第 0 天），更換為 RPMI1640/B27（不含胰島素；RPMI1640∶B27=50∶1）培養基，并加入 10 μmol/L CHIR99021[15]作用 24 h 后，更換為 RPMI1640/B27（不含胰島素）培養基；分化第 3 天分別加入濃度為 0、2.5、5.0、10.0 和 20.0 μmol/L 的 IWP4，培養 48 h 后再次更換為 RPMI1640/B27（不含胰島素）培養基。分化第 7 天更換為 RPMI1640/B27（含胰島素）培養基，以后每 3 天更換 1 次培養基。繼續培養細胞至分化第 15 天，收集細胞行實時熒光定量 PCR 檢測心肌細胞特異性標記物肌鈣蛋白 T（troponin T，TNNT2）mRNA 表達，以最高表達對應濃度為 IWP4 最佳濃度。
檢測方法：加入 0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化細胞 15 min，中止消化，將細胞轉移至無 RNA 酶 EP 管中，以離心半徑 6 cm，4 500 r/min 離心 5 min 沉淀細胞，PBS 洗脫 1 次，加入 NucleoZol 細胞裂解液，按照說明書提取 RNA。紫外分光光度儀測定 RNA 濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書取出 1 μg RNA，在 PCR 儀上將 RNA 逆轉至 cDNA，將獲得的 cDNA 稀釋 3 倍。按照熒光定量 PCR 試劑盒說明書精準上樣實時熒光定量 PCR 反應體系后進行檢測。反應條件：94℃ 預變性 2 min，94℃ 變性 2 s，60℃ 退火/延伸 15 s，40 個熱循環。熔解曲線：95℃、2 min，60℃、20 s，95℃、15 s，從 60℃ 緩慢加熱到 99℃。以 GAPDH 作為內參，采用 2–△△Ct 法檢測 TNNT2 mRNA 相對表達量。引物序列見表 1。
表1
實時熒光定量 PCR 各基因引物序列
Table1.
Primer sequence of real-time fluorescence quantitative PCR genes
1.3.2 IWP4 最佳作用時間篩選
實驗分為 3 組。對照組細胞只在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h；實驗組 1、2 在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h 基礎上，分別于第 3、5 天加入最佳濃度 IWP4 作用 48 h，之后更換培養基繼續培養。分化前 7 d 采用 RPMI1640/B27（不含胰島素）培養基，分化第 7 天更換為 RPMI1640/B27（含胰島素）培養基，以后每 3 天更換 1 次培養基。分化第 15 天收集細胞，同 1.3.1 方法行實時熒光定量 PCR 檢測心肌細胞特異性標記物 TNNT2 mRNA 表達，以最高表達對應作用時間為 IWP4 最佳作用時間。
1.4 BMP-4 促 hiPSCs 分化為心肌細胞的最佳濃度及作用時間篩選
1.4.1 BMP-4 最佳濃度篩選
實驗分為兩部分。實驗 1 在分化第 5 天分別加入濃度為 0、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0 ng/mL 的 BMP-4 作用 48 h；實驗 2 在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h 以及最佳濃度 IWP4 作用 48 h 基礎上，于分化第 5 天分別加入濃度為 0、2.5、5.0、10.0、20.0 和 30.0 ng/mL 的 BMP-4 作用 48 h；之后均更換為 RPMI1640/B27（含胰島素）培養基繼續培養。分化第 15 天收集細胞，同 1.3.1 方法行實時熒光定量 PCR 檢測心肌細胞特異性標記物 TNNT2 mRNA 表達，以最高表達對應濃度為 BMP-4 最佳濃度。
1.4.2 BMP-4 最佳作用時間篩選
實驗分為 4 組。對照組在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h 以及最佳濃度 IWP4 作用 48 h；實驗組 1、2、3 在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h 以及最佳濃度 IWP4 作用 48 h 基礎上，分別于分化第 3、5、7 天加入最佳濃度 BMP-4 作用 48 h，之后更換為 RPMI1640/B27（含胰島素）培養基繼續培養。分化第 15 天收集細胞，同 1.3.1 方法行實時熒光定量 PCR 檢測心肌細胞特異性標記物 TNNT2 mRNA 表達，以最高表達對應作用時間為 BMP-4 最佳作用時間。
1.5 Wnt 和 BMP 通路對 hiPSCs 向心肌細胞分化的影響
1.5.1 實驗分組及方法
實驗分為 3 組，分別為 Wnt 調控組、BMP 調控組、Wnt+BMP 聯合調控組。其中，Wnt 調控組在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h，然后于最佳作用時間加入最佳濃度 IWP4 作用 48 h；BMP 調控組于最佳作用時間加入最佳濃度 BMP-4 作用 48 h；Wnt+BMP 聯合調控組分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h，然后按照最佳作用時間依次加入最佳濃度 IWP4 和 BMP-4 作用 48 h 后，更換培養基繼續培養。分化前 7 d 加入 RPMI1640/B27（不含胰島素）培養基，分化第 7 天更換為 RPMI1640/B27（含胰島素）培養基，以后每 3 天換液 1 次，誘導 hiPSCs 向心肌細胞分化。
1.5.2 實時熒光定量 PCR 檢測
收集分化第 7 天細胞，按照 1.3.1 方法提取 RNA，檢測心肌前體細胞標記物 ISL1（ISL LIM homeobox 1）和 NKX2-5（NK2 homeobox 5）mRNA 表達。收集分化第 15 天細胞，檢測心肌細胞特異性標記物肌細胞增強因子 2C（myocyte enhancer factor 2C，MEF2C）、肌球蛋白輕鏈 2（myosin light chain 2，MYL2）、MYL7 及 TNNT2 mRNA 表達。各基因引物序列見表 1。
1.5.3 流式細胞術檢測
收集分化第 28 天細胞，4% 多聚甲醛室溫固定 15 min，0.2%Triton X-100 通透細胞 15 min，0.5% 牛血清白蛋白/PBS 封閉細胞非特異性結合位點 15 min。添加 1∶200 比例稀釋兔來源抗 cTnT 抗體，4℃ 孵育過夜（12～16 h）。添加 1∶500 比例稀釋 Alexa Fluor488 標記抗兔二抗，室溫避光孵育 30 min。0.5% 牛血清白蛋白/PBS 重懸細胞，100 μm 濾膜轉移至上機管中（置于冰盒上，注意避光），上機進行檢測。
1.5.4 免疫熒光染色觀察
收集分化第 28 天細胞，按照 1.2.2 方法行免疫熒光染色，觀察心肌細胞特異性蛋白 cTnT 的表達。
1.6 統計學方法
采用 GraphPad Prim 8 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hiPSCs 形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下見 hiPSCs 為成簇生長的克隆團，高倍鏡下細胞緊密規則排列，細胞呈橢圓形、形態較小，細胞核大而明顯，細胞質較少，核質比高。見圖 1。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察 hiPSCs
a. ×4；b. ×20
Figure1. Morphology observation of hiPSCs under inverted phase contrast microscopea. ×4; b. ×20
熒光顯微鏡下見 hiPSCs 多能性標記物 OCT3/4、NANOG 和 TRA-1-60 免疫熒光染色均為陽性。OCT3/4、NANOG 分布于細胞核中，能與 DAPI 染色的細胞核重合；TRA-1-60 分布在細胞核周圍。見圖 2。細胞形態學及免疫熒光染色觀察結果提示 hiPSCs 具有良好的多能性特點。
圖2
免疫熒光染色觀察 hiPSCs 多能性標記物表達（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為 DAPI 核染色、熒光染色及二者重疊 a. OCT3/4；b. NANOG；c.TRA-1-60
Figure2. The expressions of pluripotent markers of hiPSCs by immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)From left to right for DAPI nucleus staining, fluorescence staining, and merge a. OCT3/4; b. NANOG; c. TRA-1-60
2.2 IWP4 促 hiPSCs 分化為心肌細胞的最佳濃度及作用時間篩選
2.2.1 IWP4 最佳濃度
IWP4 濃度為 10.0 μmol/L 時 TNNT2 mRNA 相對表達量最高，與 0、2.5、5.0、20.0 μmol/L 比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3a。
圖3
實時熒光定量 PCR 檢測 IWP4 作用后 TNNT2 mRNA 相對表達量
a. IWP4 最佳濃度篩選；b. IWP4 最佳作用時間篩選
Figure3. The relative expression of TNNT2 mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCR after adding IWP4a. Screening of optimal concentration of IWP4; b. Screening of optimal effective period of IWP4
2.2.2 IWP4 最佳作用時間
實驗組 1 在分化第 3 天加入最佳濃度 IWP4 后，TNNT2 mRNA 相對表達量最高，與對照組和實驗組 2 比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3b。
IWP4 促 hiPSCs 分化為心肌細胞的最佳濃度為 10.0 μmol/L、最佳作用時間為分化第 3 天。
2.3 BMP-4 促 hiPSCs 向心肌細胞分化的最佳濃度及作用時間篩選
2.3.1 BMP-4 最佳濃度篩選
實驗 1 在 hiPSCs 分化第 5 天僅加入 BMP-4 作用 48 h 后未能啟動心肌細胞基因表達，故排除該部分實驗。實驗 2 中，當 BMP-4 濃度為 20.0 ng/mL 時，TNNT2 mRNA 相對表達量最高，與 2.5、5.0、10.0、30.0 ng/mL 比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4a。
圖4
實時熒光定量 PCR 檢測 BMP-4 作用后 TNNT2 mRNA 相對表達量
a. BMP-4 最佳濃度篩選；b. BMP-4 最佳作用時間篩選
Figure4. The relative expression of TNNT2 mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCR after adding BMP-4a. Screening of optimal concentration of BMP-4; b. Screening of optimal effective period of BMP-42.3.2 BMP-4 最佳作用時間
實驗組 1 分化第 3 天加入最佳濃度 BMP-4 后，TNNT2 mRNA 相對表達量最高，與其他 3 組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4b。
BMP-4 促 hiPSCs 向心肌細胞分化的最佳濃度為 20.0 ng/mL，最佳作用時間為分化后第 3 天。
2.4 Wnt 和 BMP 通路對 hiPSCs 向心肌細胞分化的影響
觀測顯示 BMP 調控組不能啟動心肌細胞基因的表達，故研究排除該組。
2.4.1 實時熒光定量 PCR 檢測
分化第 7 天 Wnt+BMP 聯合調控組的 ISL1 和 NKX2-5 mRNA 相對表達量高于 Wnt 調控組，差異有統計學意義（t=15.654，P=0.004；t=12.075，P=0.007）。分化第 15 天 Wnt+BMP 聯合調控組的 MEF2C、MYL2、MYL7 以及 TNNT2 mRNA 相對表達量均明顯高于 Wnt 調控組，差異均有統計學意義（t=13.489，P=0.006；t=15.444，P=0.004；t=19.348，P=0.003；t=57.840，P=0.000）。見圖 5。
圖5
實時熒光定量 PCR 檢測 Wnt 調控組及 Wnt+BMP 聯合調控組的心肌前體細胞標記物和心肌細胞標記物的表達a. 分化第 7 天；b. 分化第 15 天
Figure5.
Comparison of cardiac precursor cell marker expressions and cardiomyocyte markers expressions detected by real-time fluorescence quantitative PCR between Wnt group and Wnt+BMP group
a. On the 7th day of differentiation; b. On the 15th day of differentiation
2.4.2 流式細胞術檢測
分化第 28 天，Wnt+BMP 聯合調控組 cTnT 蛋白陽性率為 74.2%，高于 Wnt 調控組的 63.8%，說明前者心肌分化效率較高。見圖 6。
圖6
流式細胞術檢測心肌細胞特異性蛋白 cTnT 表達
a. Wnt 調控組；b. Wnt+BMP 聯合調控組
Figure6. Detection of positive expression ratio of cTnT by flow cytometrya. Wnt group; b. Wnt+BMP group
2.4.3 免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡觀察示各組均見 cTnT 蛋白陽性表達，其中 Wnt+BMP 聯合調控組陽性表達更明顯，可見類似于心肌細胞的肌節結構。見圖 7。
圖7
免疫熒光染色觀察心肌細胞特異性蛋白 cTnT 表達（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為 DAPI 核染色、熒光染色及二者重疊a. Wnt 調控組；b. Wnt+BMP 聯合調控組
Figure7. The expression of cTnT by immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)From left to right for DAPI nucleus staining, fluorescence staining, and merge a. Wnt group; b. Wnt+BMP group
3 討論
心臟是脊椎動物發育的第 1 個器官[16]。發育初期，心臟由原腸胚祖細胞分化而來的第 1 心臟場（first heart field，FHF）和第 2 心臟場（second heart field，SHF）細胞構成。隨后，FHF 形成心臟新月體，SHF 在新月體中間。FHF 和 SHF 細胞移動至中線，FHF 細胞形成線性心管，發育成左心室，SHF 細胞通過增殖、遷移以及與 FHF 細胞的融合，發育成右心室和流入、流出道。研究發現 BMP 信號通路促進 FHF 發育，而 Wnt 信號通路調控 SHF 的發育[10, 17]。
Wnt 信號通路主要由細胞外 Wnt 蛋白、細胞膜受體、細胞質內信號轉導部分和核內轉錄調控部分組成，物種間具有高度的保守性[18]。其中依賴于 β-catenin 者為經典通路，不依賴 β-catenin 者為非經典通路[19]，經典 Wnt/β-catenin 信號通路參與調控心臟 SHF 的發育。SHF 細胞的增殖、遷移及分化是心臟循環和右心室形成的基礎，當突變 β-catenin 阻斷 Wnt/β-catenin 通路時， SHF 細胞增殖受阻，細胞無法分散到右心室，導致 SHF 祖細胞缺乏、心臟環消失及右心室發育不良[10]。但是，Wnt/β-catenin 信號通路在整個心臟發育中的作用有所爭議。在雞和青蛙的胚胎培養實驗中，抑制經典 Wnt 信號可以促進心臟的發生[20-21]。在小鼠胚胎實驗中，β-catenin 的丟失會導致心臟環發育受阻，但在心前中胚層表達高水平的 β-catenin 又會阻止心新月形細胞與線性心管的融合，由于心臟環和心新月形細胞的融合是暫時分離，因此 Wnt 信號的雙向作用可能跟發育時間相關[10, 22]。Lian 等[11]的研究進一步證實了 Wnt/β-catenin 通路在心臟發育中的雙向作用。該研究顯示在 hiPSCs 向心肌細胞分化早期促進 Wnt/β-catenin 通路，而在中胚層形成后加入抑制劑抑制通路活性，采取依賴于分化時間的雙向調控 Wnt/β-catenin 通路，可以有效地促進 hiPSCs 向心肌細胞分化。同樣，在斑馬魚的心臟發育中，Wnt/β-catenin 通路也是發揮早期促進、晚期抑制的雙向作用[23]。
鑒于 Wnt 通路在心臟發育中的雙向調控作用，本研究中在分化開始的 24 h 用 CHIR99021 激活 Wnt 通路，隨后加入 IWP4 抑制 Wnt 通路。結果顯示在分化第 3 天加入 10 μmol/L IWP4 作用 48 h，可以有效促進 hiPSCs 分化為心肌細胞。分化而來的細胞可以表達心肌細胞前體標記物 ISL1 和 NKX2-5，以及心肌特異性基因 MEF2C、MYL2、MYL7 和 TNNT2，心肌細胞標志性蛋白 cTnT 陽性細胞可達 63.8%，免疫熒光染色 cTnT 為陽性表達。上述結果提示采用雙向調控 Wnt 通路的方法可以有效促進 hiPSCs 分化為心肌細胞。
BMP 信號通路具有促進 FHF 發育的作用。當用突變的 BMP 受體阻斷 BMP 信號通路時，心臟的新月體消失和 FHF 特異性基因 Gata6、Tbx-5 和 eHand 表達缺失，心臟祖細胞不能向心臟特異性譜系發展，心肌分化受損，無法形成心臟[10]。BMP-2/4 是 BMP 信號通路的配體，這些配體是 TGF-β 超家族成員，參與了很多組織器官的分化，如心臟、神經系統、肺、腎、牙齒等[14]。將合適濃度的 BMP-2/4 作用于雞的非心前中胚層 48 h，可誘導出表達 NKX2-5 的心系細胞，說明 BMP 可以將雞的非心前中胚層誘導為心臟譜系[24]。在非洲爪蟾胚胎中采用瞬時轉基因策略的實驗也證明了 BMP 信號具有促進脊椎動物體內心臟形成和維持 NKX2-5 表達的作用，阻斷 BMP 信號會導致心臟形成受阻，NKX2-5 表達下調[25]。由于 BMP-2 或 BMP-4 純合突變小鼠表現出早期胚胎致死性，因此在構建 BMP-2 和 BMP-4 雙雜合子小鼠的實驗中發現在發育過程中，大約有一半的雜合胎鼠出現室間隔缺損，并在出生后不久死亡，存活小鼠在出生后 2 個月心臟瓣膜結構逐漸發育異常，說明 BMP-2、4 對胚胎發育和出生后功能性心臟的形成至關重要，通路活性的降低可能是先天性和后天性心臟病的潛在原因[26]。在胚胎心臟的形成過程中，BMP 信號通路的激活促進 FHF 的發育。
然而本研究發現在 hiPSCs 向心肌細胞分化中，僅加入 BMP-4 未能啟動心肌細胞的基因和蛋白表達，Kattman 等[9]的研究也發現僅激活 BMP 信號通路難以促進 hiPSCs 向心肌細胞分化。但是，當 BMP 通路聯合 Wnt 通路時，可以有效促進 hiPSCs 分化為心肌細胞，且優于僅調控 Wnt 信號通路。說明 Wnt 信號通路和 BMP 信號通路對于心臟的發育具有協同促進作用。研究也發現 Wnt/β-catenin 在調控心臟發育過程中，通過自分泌和旁分泌途徑觸發多條發育信號的表達，如 Nodal、BMP 等信號通路[9]。當在適當的分化階段，敲除 β-catenin 可以增強 BMP 信號通路配體誘導的心肌細胞生成[11]。說明在心臟發育過程中，Wnt/β-catenin 信號通路處于抑制狀態時，BMP 信號通路是激活狀態，兩者協同合作以促進體內心臟的發育和形成[10]。本研究中，在 hiPSCs 分化第 3 天加入 IWP4 使 Wnt 信號通路處于抑制狀態時，加入 BMP-4 激活 BMP 信號通路，分化效果最佳，心肌細胞特異性基因表達及蛋白 cTnT 陽性表達更高。Wnt 和 BMP 信號通路的聯合調控，也優于僅調控 Wnt 通路促 hiPSCs 分化為心肌細胞的方案。
綜上述，聯合調控 Wnt 和 BMP 信號通路誘導 hiPSCs 向心肌分化可以上調心肌特異性基因，如 MEF2C、MYL2、MYL7、TNNT2 等的表達，提高 cTnT 陽性細胞比例，表現為接近成熟心肌細胞的肌節結構，從而有效提高 hiPSCs 分化為心肌細胞的效率，為修復壞死心肌細胞、心臟疾病建模、心臟藥物篩選等提供更加充足的細胞來源[1]。
作者貢獻：廖斌、周銳、閆穎構思與設計研究，閆穎、劉鋒、侯曉杰、萬居易、熊琪參與實驗實施；閆穎、劉鋒負責數據收集整理及統計分析；閆穎撰寫文章；廖斌、周銳對文章的知識性內容作批閱性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
心肌細胞在缺血缺氧壞死后很難再生，當大面積心肌細胞壞死危及患者生命時，常規治療手段（如藥物、介入及手術等）難以修復受損的心肌細胞，而心臟移植由于供體有限也無法廣泛應用于臨床[1]。人源誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）是具有類似于胚胎干細胞的全能性干細胞，能自主增殖和分化。由于 hiPSCs 可以由患者的體細胞重編程獲取，從而避免了胚胎干細胞的倫理問題和移植后免疫排斥反應，逐漸成為干細胞生物學和臨床再生/修復醫學理想的種子細胞[2-3]。研究發現 hiPSCs 分化而來的心肌細胞可以修復壞死的心肌組織，是目前挽救心肌壞死患者生命最有前景的治療措施之一。
干細胞可以自然分化為心肌細胞，但比例極低，遠遠無法滿足臨床治療需求。為此研究者嘗試各種方法提高干細胞向心肌細胞的分化效率，如采用環孢菌素[4]、維生素 C[5]、抑瘤素 M[6]等化學藥物誘導，或者將干細胞接種在靜電紡絲聚己內酯納米纖維仿生支架上進行分化培養[7]等。上述方法均可提高心肌細胞分化效率，但還有上升空間。為了獲得穩定且高效的心肌細胞分化效率，研究者從胚胎心臟發育學角度進行探索，發現調控與胚胎心臟發育相關的通路來誘導干細胞向心肌細胞分化，可以獲得相對穩定且較高的分化效率[8-9]。在脊椎動物體內，心臟發育是多條信號通路聯合調控的結果，其中 Wnt/β-catenin 和 BMP 信號通路發揮著重要作用[10]。Wnt/β-catenin 是雙相作用，早期發揮激活作用促進中胚層發育，隨后發揮抑制作用促進中胚層向心肌前體細胞發育[11]。BMP 信號通路在心臟左心室、瓣膜、流出道及心內膜墊等發育中發揮重要作用[12-13]。研究顯示將 Wnt 拮抗劑與 BMP 重疊表達于非洲爪蟾胚胎的前外側區域，共同促進心臟發育[14]。基于 Wnt/β-catenin 和 BMP 信號通路可協同促進心臟發育，本研究采用聯合調控 Wnt 和 BMP 信號通路方法誘導 hiPSCs 向心肌細胞分化，以期為臨床治療心肌壞死的種子細胞來源提供方法學參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
hiPSCs（LHPB-YaabC3）、BioCISO hiPSCs 維持培養基（廣州皓昇萊生物制藥有限公司）；Matrigel 基質膠（Corning 公司，美國）；DMEM、RPMI1640、0.02% EDTA 溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA（GIBCO 公司，美國）；Wnt 通路抑制劑 IWP4（Selleck 公司，美國）；Wnt 通路激活劑 CHIR99021（StemCell 公司，加拿大）；BMP-4（Peprotech 公司，美國）；4% 多聚甲醛（上海碧云天生物技術有限公司）；RNA 提取試劑 Nucleo Zol（MN 公司，德國）；逆轉錄試劑盒（Toyobo 公司，日本）；熒光定量 PCR 試劑盒（Qiagen 公司，美國）；抗 OCT3/4、NANOG、TRA-1-60、Alexa Fluor594 標記抗兔二抗（Cell Signaling Technology 公司，美國）；抗心肌肌鈣蛋白 T（cardiac troponin T，cTnT）抗體（Proteintech Group 公司，美國）；Alexa Fluor488 標記抗兔二抗、Alexa Fluor488 標記抗鼠二抗（Abcam 公司，美國）。
CO2 孵箱（SANYO 公司，日本）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；實時熒光定量 PCR 儀、低溫高速離心機（Thermo Fisher 公司，美國）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；紫外分光光度儀（NanoDrop 公司，德國）；U-8 培養皿（Ibidi 公司，德國）。
1.2 hiPSCs 培養及鑒定
1.2.1 hiPSCs 培養
復蘇 LHPB-YaabC3，BioCISO hiPSCs 維持培養基重懸后均勻接種在 Matrigel 包被的 6 cm 培養皿中，置于 37℃、5%CO2 孵箱中培養，每天更換培養基。待細胞融合達 50% 左右時，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。待細胞融合達 80% 左右時傳代至 12 孔板，取 35 代以內的 hiPSCs 用于后續實驗。
1.2.2 免疫熒光染色觀察 hiPSCs 多能性標記物表達
取 hiPSCs 均勻接種至 U-8 培養皿中，置于 37℃、5%CO2 孵箱中孵育 36 h；吸棄細胞培養基，PBS 洗脫，4% 多聚甲醛固定 30 min，0.5%Triton X-100 通透 10 min，牛血清白蛋白封閉 30 min。加入一抗 OCT3/4（1∶200）、NANOG（1∶400）、TRA-1-60（1∶400），4℃ 過夜。Alexa Fluor488（1∶500）和 Alexa Fluor594（1∶500）標記二抗，避光孵育 1 h。DAPI 染核 10 min，熒光顯微鏡觀察。
1.3 IWP4 促 hiPSCs 分化為心肌細胞的最佳濃度及作用時間篩選
1.3.1 IWP4 最佳濃度篩選
取 hiPSCs 按照 1.2×105個/孔密度接種至 12 孔板，待細胞融合接近 100% 時（記為分化第 0 天），更換為 RPMI1640/B27（不含胰島素；RPMI1640∶B27=50∶1）培養基，并加入 10 μmol/L CHIR99021[15]作用 24 h 后，更換為 RPMI1640/B27（不含胰島素）培養基；分化第 3 天分別加入濃度為 0、2.5、5.0、10.0 和 20.0 μmol/L 的 IWP4，培養 48 h 后再次更換為 RPMI1640/B27（不含胰島素）培養基。分化第 7 天更換為 RPMI1640/B27（含胰島素）培養基，以后每 3 天更換 1 次培養基。繼續培養細胞至分化第 15 天，收集細胞行實時熒光定量 PCR 檢測心肌細胞特異性標記物肌鈣蛋白 T（troponin T，TNNT2）mRNA 表達，以最高表達對應濃度為 IWP4 最佳濃度。
檢測方法：加入 0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化細胞 15 min，中止消化，將細胞轉移至無 RNA 酶 EP 管中，以離心半徑 6 cm，4 500 r/min 離心 5 min 沉淀細胞，PBS 洗脫 1 次，加入 NucleoZol 細胞裂解液，按照說明書提取 RNA。紫外分光光度儀測定 RNA 濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書取出 1 μg RNA，在 PCR 儀上將 RNA 逆轉至 cDNA，將獲得的 cDNA 稀釋 3 倍。按照熒光定量 PCR 試劑盒說明書精準上樣實時熒光定量 PCR 反應體系后進行檢測。反應條件：94℃ 預變性 2 min，94℃ 變性 2 s，60℃ 退火/延伸 15 s，40 個熱循環。熔解曲線：95℃、2 min，60℃、20 s，95℃、15 s，從 60℃ 緩慢加熱到 99℃。以 GAPDH 作為內參，采用 2–△△Ct 法檢測 TNNT2 mRNA 相對表達量。引物序列見表 1。
表1
實時熒光定量 PCR 各基因引物序列
Table1.
Primer sequence of real-time fluorescence quantitative PCR genes
1.3.2 IWP4 最佳作用時間篩選
實驗分為 3 組。對照組細胞只在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h；實驗組 1、2 在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h 基礎上，分別于第 3、5 天加入最佳濃度 IWP4 作用 48 h，之后更換培養基繼續培養。分化前 7 d 采用 RPMI1640/B27（不含胰島素）培養基，分化第 7 天更換為 RPMI1640/B27（含胰島素）培養基，以后每 3 天更換 1 次培養基。分化第 15 天收集細胞，同 1.3.1 方法行實時熒光定量 PCR 檢測心肌細胞特異性標記物 TNNT2 mRNA 表達，以最高表達對應作用時間為 IWP4 最佳作用時間。
1.4 BMP-4 促 hiPSCs 分化為心肌細胞的最佳濃度及作用時間篩選
1.4.1 BMP-4 最佳濃度篩選
實驗分為兩部分。實驗 1 在分化第 5 天分別加入濃度為 0、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0 ng/mL 的 BMP-4 作用 48 h；實驗 2 在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h 以及最佳濃度 IWP4 作用 48 h 基礎上，于分化第 5 天分別加入濃度為 0、2.5、5.0、10.0、20.0 和 30.0 ng/mL 的 BMP-4 作用 48 h；之后均更換為 RPMI1640/B27（含胰島素）培養基繼續培養。分化第 15 天收集細胞，同 1.3.1 方法行實時熒光定量 PCR 檢測心肌細胞特異性標記物 TNNT2 mRNA 表達，以最高表達對應濃度為 BMP-4 最佳濃度。
1.4.2 BMP-4 最佳作用時間篩選
實驗分為 4 組。對照組在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h 以及最佳濃度 IWP4 作用 48 h；實驗組 1、2、3 在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h 以及最佳濃度 IWP4 作用 48 h 基礎上，分別于分化第 3、5、7 天加入最佳濃度 BMP-4 作用 48 h，之后更換為 RPMI1640/B27（含胰島素）培養基繼續培養。分化第 15 天收集細胞，同 1.3.1 方法行實時熒光定量 PCR 檢測心肌細胞特異性標記物 TNNT2 mRNA 表達，以最高表達對應作用時間為 BMP-4 最佳作用時間。
1.5 Wnt 和 BMP 通路對 hiPSCs 向心肌細胞分化的影響
1.5.1 實驗分組及方法
實驗分為 3 組，分別為 Wnt 調控組、BMP 調控組、Wnt+BMP 聯合調控組。其中，Wnt 調控組在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h，然后于最佳作用時間加入最佳濃度 IWP4 作用 48 h；BMP 調控組于最佳作用時間加入最佳濃度 BMP-4 作用 48 h；Wnt+BMP 聯合調控組分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h，然后按照最佳作用時間依次加入最佳濃度 IWP4 和 BMP-4 作用 48 h 后，更換培養基繼續培養。分化前 7 d 加入 RPMI1640/B27（不含胰島素）培養基，分化第 7 天更換為 RPMI1640/B27（含胰島素）培養基，以后每 3 天換液 1 次，誘導 hiPSCs 向心肌細胞分化。
1.5.2 實時熒光定量 PCR 檢測
收集分化第 7 天細胞，按照 1.3.1 方法提取 RNA，檢測心肌前體細胞標記物 ISL1（ISL LIM homeobox 1）和 NKX2-5（NK2 homeobox 5）mRNA 表達。收集分化第 15 天細胞，檢測心肌細胞特異性標記物肌細胞增強因子 2C（myocyte enhancer factor 2C，MEF2C）、肌球蛋白輕鏈 2（myosin light chain 2，MYL2）、MYL7 及 TNNT2 mRNA 表達。各基因引物序列見表 1。
1.5.3 流式細胞術檢測
收集分化第 28 天細胞，4% 多聚甲醛室溫固定 15 min，0.2%Triton X-100 通透細胞 15 min，0.5% 牛血清白蛋白/PBS 封閉細胞非特異性結合位點 15 min。添加 1∶200 比例稀釋兔來源抗 cTnT 抗體，4℃ 孵育過夜（12～16 h）。添加 1∶500 比例稀釋 Alexa Fluor488 標記抗兔二抗，室溫避光孵育 30 min。0.5% 牛血清白蛋白/PBS 重懸細胞，100 μm 濾膜轉移至上機管中（置于冰盒上，注意避光），上機進行檢測。
1.5.4 免疫熒光染色觀察
收集分化第 28 天細胞，按照 1.2.2 方法行免疫熒光染色，觀察心肌細胞特異性蛋白 cTnT 的表達。
1.6 統計學方法
采用 GraphPad Prim 8 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hiPSCs 形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下見 hiPSCs 為成簇生長的克隆團，高倍鏡下細胞緊密規則排列，細胞呈橢圓形、形態較小，細胞核大而明顯，細胞質較少，核質比高。見圖 1。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察 hiPSCs
a. ×4；b. ×20
Figure1. Morphology observation of hiPSCs under inverted phase contrast microscopea. ×4; b. ×20
熒光顯微鏡下見 hiPSCs 多能性標記物 OCT3/4、NANOG 和 TRA-1-60 免疫熒光染色均為陽性。OCT3/4、NANOG 分布于細胞核中，能與 DAPI 染色的細胞核重合；TRA-1-60 分布在細胞核周圍。見圖 2。細胞形態學及免疫熒光染色觀察結果提示 hiPSCs 具有良好的多能性特點。
圖2
免疫熒光染色觀察 hiPSCs 多能性標記物表達（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為 DAPI 核染色、熒光染色及二者重疊 a. OCT3/4；b. NANOG；c.TRA-1-60
Figure2. The expressions of pluripotent markers of hiPSCs by immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)From left to right for DAPI nucleus staining, fluorescence staining, and merge a. OCT3/4; b. NANOG; c. TRA-1-60
2.2 IWP4 促 hiPSCs 分化為心肌細胞的最佳濃度及作用時間篩選
2.2.1 IWP4 最佳濃度
IWP4 濃度為 10.0 μmol/L 時 TNNT2 mRNA 相對表達量最高，與 0、2.5、5.0、20.0 μmol/L 比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3a。
圖3
實時熒光定量 PCR 檢測 IWP4 作用后 TNNT2 mRNA 相對表達量
a. IWP4 最佳濃度篩選；b. IWP4 最佳作用時間篩選
Figure3. The relative expression of TNNT2 mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCR after adding IWP4a. Screening of optimal concentration of IWP4; b. Screening of optimal effective period of IWP4
2.2.2 IWP4 最佳作用時間
實驗組 1 在分化第 3 天加入最佳濃度 IWP4 后，TNNT2 mRNA 相對表達量最高，與對照組和實驗組 2 比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3b。
IWP4 促 hiPSCs 分化為心肌細胞的最佳濃度為 10.0 μmol/L、最佳作用時間為分化第 3 天。
2.3 BMP-4 促 hiPSCs 向心肌細胞分化的最佳濃度及作用時間篩選
2.3.1 BMP-4 最佳濃度篩選
實驗 1 在 hiPSCs 分化第 5 天僅加入 BMP-4 作用 48 h 后未能啟動心肌細胞基因表達，故排除該部分實驗。實驗 2 中，當 BMP-4 濃度為 20.0 ng/mL 時，TNNT2 mRNA 相對表達量最高，與 2.5、5.0、10.0、30.0 ng/mL 比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4a。
圖4
實時熒光定量 PCR 檢測 BMP-4 作用后 TNNT2 mRNA 相對表達量
a. BMP-4 最佳濃度篩選；b. BMP-4 最佳作用時間篩選
Figure4. The relative expression of TNNT2 mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCR after adding BMP-4a. Screening of optimal concentration of BMP-4; b. Screening of optimal effective period of BMP-42.3.2 BMP-4 最佳作用時間
實驗組 1 分化第 3 天加入最佳濃度 BMP-4 后，TNNT2 mRNA 相對表達量最高，與其他 3 組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4b。
BMP-4 促 hiPSCs 向心肌細胞分化的最佳濃度為 20.0 ng/mL，最佳作用時間為分化后第 3 天。
2.4 Wnt 和 BMP 通路對 hiPSCs 向心肌細胞分化的影響
觀測顯示 BMP 調控組不能啟動心肌細胞基因的表達，故研究排除該組。
2.4.1 實時熒光定量 PCR 檢測
分化第 7 天 Wnt+BMP 聯合調控組的 ISL1 和 NKX2-5 mRNA 相對表達量高于 Wnt 調控組，差異有統計學意義（t=15.654，P=0.004；t=12.075，P=0.007）。分化第 15 天 Wnt+BMP 聯合調控組的 MEF2C、MYL2、MYL7 以及 TNNT2 mRNA 相對表達量均明顯高于 Wnt 調控組，差異均有統計學意義（t=13.489，P=0.006；t=15.444，P=0.004；t=19.348，P=0.003；t=57.840，P=0.000）。見圖 5。
圖5
實時熒光定量 PCR 檢測 Wnt 調控組及 Wnt+BMP 聯合調控組的心肌前體細胞標記物和心肌細胞標記物的表達a. 分化第 7 天；b. 分化第 15 天
Figure5.
Comparison of cardiac precursor cell marker expressions and cardiomyocyte markers expressions detected by real-time fluorescence quantitative PCR between Wnt group and Wnt+BMP group
a. On the 7th day of differentiation; b. On the 15th day of differentiation
2.4.2 流式細胞術檢測
分化第 28 天，Wnt+BMP 聯合調控組 cTnT 蛋白陽性率為 74.2%，高于 Wnt 調控組的 63.8%，說明前者心肌分化效率較高。見圖 6。
圖6
流式細胞術檢測心肌細胞特異性蛋白 cTnT 表達
a. Wnt 調控組；b. Wnt+BMP 聯合調控組
Figure6. Detection of positive expression ratio of cTnT by flow cytometrya. Wnt group; b. Wnt+BMP group
2.4.3 免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡觀察示各組均見 cTnT 蛋白陽性表達，其中 Wnt+BMP 聯合調控組陽性表達更明顯，可見類似于心肌細胞的肌節結構。見圖 7。
圖7
免疫熒光染色觀察心肌細胞特異性蛋白 cTnT 表達（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為 DAPI 核染色、熒光染色及二者重疊a. Wnt 調控組；b. Wnt+BMP 聯合調控組
Figure7. The expression of cTnT by immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)From left to right for DAPI nucleus staining, fluorescence staining, and merge a. Wnt group; b. Wnt+BMP group
3 討論
心臟是脊椎動物發育的第 1 個器官[16]。發育初期，心臟由原腸胚祖細胞分化而來的第 1 心臟場（first heart field，FHF）和第 2 心臟場（second heart field，SHF）細胞構成。隨后，FHF 形成心臟新月體，SHF 在新月體中間。FHF 和 SHF 細胞移動至中線，FHF 細胞形成線性心管，發育成左心室，SHF 細胞通過增殖、遷移以及與 FHF 細胞的融合，發育成右心室和流入、流出道。研究發現 BMP 信號通路促進 FHF 發育，而 Wnt 信號通路調控 SHF 的發育[10, 17]。
Wnt 信號通路主要由細胞外 Wnt 蛋白、細胞膜受體、細胞質內信號轉導部分和核內轉錄調控部分組成，物種間具有高度的保守性[18]。其中依賴于 β-catenin 者為經典通路，不依賴 β-catenin 者為非經典通路[19]，經典 Wnt/β-catenin 信號通路參與調控心臟 SHF 的發育。SHF 細胞的增殖、遷移及分化是心臟循環和右心室形成的基礎，當突變 β-catenin 阻斷 Wnt/β-catenin 通路時， SHF 細胞增殖受阻，細胞無法分散到右心室，導致 SHF 祖細胞缺乏、心臟環消失及右心室發育不良[10]。但是，Wnt/β-catenin 信號通路在整個心臟發育中的作用有所爭議。在雞和青蛙的胚胎培養實驗中，抑制經典 Wnt 信號可以促進心臟的發生[20-21]。在小鼠胚胎實驗中，β-catenin 的丟失會導致心臟環發育受阻，但在心前中胚層表達高水平的 β-catenin 又會阻止心新月形細胞與線性心管的融合，由于心臟環和心新月形細胞的融合是暫時分離，因此 Wnt 信號的雙向作用可能跟發育時間相關[10, 22]。Lian 等[11]的研究進一步證實了 Wnt/β-catenin 通路在心臟發育中的雙向作用。該研究顯示在 hiPSCs 向心肌細胞分化早期促進 Wnt/β-catenin 通路，而在中胚層形成后加入抑制劑抑制通路活性，采取依賴于分化時間的雙向調控 Wnt/β-catenin 通路，可以有效地促進 hiPSCs 向心肌細胞分化。同樣，在斑馬魚的心臟發育中，Wnt/β-catenin 通路也是發揮早期促進、晚期抑制的雙向作用[23]。
鑒于 Wnt 通路在心臟發育中的雙向調控作用，本研究中在分化開始的 24 h 用 CHIR99021 激活 Wnt 通路，隨后加入 IWP4 抑制 Wnt 通路。結果顯示在分化第 3 天加入 10 μmol/L IWP4 作用 48 h，可以有效促進 hiPSCs 分化為心肌細胞。分化而來的細胞可以表達心肌細胞前體標記物 ISL1 和 NKX2-5，以及心肌特異性基因 MEF2C、MYL2、MYL7 和 TNNT2，心肌細胞標志性蛋白 cTnT 陽性細胞可達 63.8%，免疫熒光染色 cTnT 為陽性表達。上述結果提示采用雙向調控 Wnt 通路的方法可以有效促進 hiPSCs 分化為心肌細胞。
BMP 信號通路具有促進 FHF 發育的作用。當用突變的 BMP 受體阻斷 BMP 信號通路時，心臟的新月體消失和 FHF 特異性基因 Gata6、Tbx-5 和 eHand 表達缺失，心臟祖細胞不能向心臟特異性譜系發展，心肌分化受損，無法形成心臟[10]。BMP-2/4 是 BMP 信號通路的配體，這些配體是 TGF-β 超家族成員，參與了很多組織器官的分化，如心臟、神經系統、肺、腎、牙齒等[14]。將合適濃度的 BMP-2/4 作用于雞的非心前中胚層 48 h，可誘導出表達 NKX2-5 的心系細胞，說明 BMP 可以將雞的非心前中胚層誘導為心臟譜系[24]。在非洲爪蟾胚胎中采用瞬時轉基因策略的實驗也證明了 BMP 信號具有促進脊椎動物體內心臟形成和維持 NKX2-5 表達的作用，阻斷 BMP 信號會導致心臟形成受阻，NKX2-5 表達下調[25]。由于 BMP-2 或 BMP-4 純合突變小鼠表現出早期胚胎致死性，因此在構建 BMP-2 和 BMP-4 雙雜合子小鼠的實驗中發現在發育過程中，大約有一半的雜合胎鼠出現室間隔缺損，并在出生后不久死亡，存活小鼠在出生后 2 個月心臟瓣膜結構逐漸發育異常，說明 BMP-2、4 對胚胎發育和出生后功能性心臟的形成至關重要，通路活性的降低可能是先天性和后天性心臟病的潛在原因[26]。在胚胎心臟的形成過程中，BMP 信號通路的激活促進 FHF 的發育。
然而本研究發現在 hiPSCs 向心肌細胞分化中，僅加入 BMP-4 未能啟動心肌細胞的基因和蛋白表達，Kattman 等[9]的研究也發現僅激活 BMP 信號通路難以促進 hiPSCs 向心肌細胞分化。但是，當 BMP 通路聯合 Wnt 通路時，可以有效促進 hiPSCs 分化為心肌細胞，且優于僅調控 Wnt 信號通路。說明 Wnt 信號通路和 BMP 信號通路對于心臟的發育具有協同促進作用。研究也發現 Wnt/β-catenin 在調控心臟發育過程中，通過自分泌和旁分泌途徑觸發多條發育信號的表達，如 Nodal、BMP 等信號通路[9]。當在適當的分化階段，敲除 β-catenin 可以增強 BMP 信號通路配體誘導的心肌細胞生成[11]。說明在心臟發育過程中，Wnt/β-catenin 信號通路處于抑制狀態時，BMP 信號通路是激活狀態，兩者協同合作以促進體內心臟的發育和形成[10]。本研究中，在 hiPSCs 分化第 3 天加入 IWP4 使 Wnt 信號通路處于抑制狀態時，加入 BMP-4 激活 BMP 信號通路，分化效果最佳，心肌細胞特異性基因表達及蛋白 cTnT 陽性表達更高。Wnt 和 BMP 信號通路的聯合調控，也優于僅調控 Wnt 通路促 hiPSCs 分化為心肌細胞的方案。
綜上述，聯合調控 Wnt 和 BMP 信號通路誘導 hiPSCs 向心肌分化可以上調心肌特異性基因，如 MEF2C、MYL2、MYL7、TNNT2 等的表達，提高 cTnT 陽性細胞比例，表現為接近成熟心肌細胞的肌節結構，從而有效提高 hiPSCs 分化為心肌細胞的效率，為修復壞死心肌細胞、心臟疾病建模、心臟藥物篩選等提供更加充足的細胞來源[1]。
作者貢獻：廖斌、周銳、閆穎構思與設計研究，閆穎、劉鋒、侯曉杰、萬居易、熊琪參與實驗實施；閆穎、劉鋒負責數據收集整理及統計分析；閆穎撰寫文章；廖斌、周銳對文章的知識性內容作批閱性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
