引用本文： 梁至潔, 黃東琳, 張木子, 易曉林, 吳芳曉, 朱丹丹, 寧艷, 甘慧敏, 黎洪棉. 基質細胞衍生因子 1α 修飾促進大鼠脂肪干細胞遷移能力的體外實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(10): 1305-1312. doi: 10.7507/1002-1892.202004134 復制
近年來，再生醫學應用研究的熱點聚焦于脂肪干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs），這是一類由脂肪組織分離獲得的 MSCs，具有較強的增殖能力、多向分化（成脂、成骨、成軟骨、成神經等）潛能以及旁分泌、免疫調節等功能，其來源豐富且易于分離[1-2]，適用于傷口愈合[3]、血運重建、骨骼肌肉組織再生修復等臨床疾病的治療[4]，凸顯了強大的再生功能。基質細胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）又名 CXCL12，屬于 CXC 類趨化因子[5]，在胚胎發育、受傷組織、低氧條件下表達[6]，在體內的形式以 SDF-1α 為主，是一種具有多種生物學功能的趨化細胞因子，如 MSCs 動員、炎癥細胞浸潤和血管新生等[7]，可促進 MSCs、原始細胞或祖細胞等發生募集歸巢[8]。ADSCs 應用于創傷修復與再生治療主要有以下環節：ADSCs 的動員遷移、分化以及新生組織的成熟[9]，其中 ADSCs 在體內趨化至損傷部位是組織修復的基礎。因此，探索有效的趨化條件或手段來進一步誘導 ADSCs 的遷移進而促進組織修復，是再生醫學臨床應用中需要解決的問題。本研究通過體外實驗，擬使用腺病毒構建 SDF-1α 過表達的大鼠 ADSCs（rat ADSCs，rADSCs），探討 SDF-1α 修飾 rADSCs 促進其遷移能力的可能性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6 周齡 SPF 級 SD 大鼠 3 只，雌雄不拘，體質量 180～200 g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。
DMEM 培養基、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、無水乙醇、15% 水合氯醛、PBS、FBS（HyClone 公司，美國）；青鏈霉素雙抗（上海生工生物工程有限公司）；山羊抗兔 IgG-FITC、CD90-FITC（eBioscienc 公司，美國）；CD49d、CD34、CD166-FITC、兔抗山羊 IgG-FITC（Invitrogen 公司，美國）；地塞米松、吲哚美辛、胰島素、甘油三酯檢測試劑盒、β-甘油磷酸鈉、維生素 C、茜素紅 S 染色液、甲苯胺藍染色液（北京索萊寶科技有限公司）；油紅 O（上海伊卡生物技術有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（合肥白鯊生物科技有限公司）；成軟骨誘導液、0.1% 結晶紫染液（中國臨床試驗集團）；大鼠重組 SDF-1α 蛋白（艾博抗上海貿易有限公司）；攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒載體（recombinant adenovirus-mediated green fluorescent protein，Adv-GFP）、Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒載體（蘇州吉瑪科技有限公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技術有限公司）。
Transwell 小室、96 孔培養板（Costar Coring Incorporated 公司，美國）；酶標檢測儀（北京長弓科技有限公司）；搖床（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰科技有限公司）；低溫臺式離心機（Eppendorf 公司，德國）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；光學顯微鏡、熒光顯微鏡、倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；細胞培養箱、紫外及可見光分光光度計（Thermo Fisher 公司，美國）；超聲細胞破碎儀（上海之信儀器有限公司）。
1.2 rADSCs 分離培養及鑒定
1.2.1 rADSCs 分離培養
取 3 只 SD 大鼠腹腔注射 15% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后脫頸處死，乙醇浸泡 10 min，超凈臺中取腹股溝脂肪組織；移至離心管中剪成 1 mm×1 mm×1 mm 糊狀，無菌 PBS 沖洗；加入 0.1%Ⅰ型膠原酶 37℃ 振蕩消化 30～40 min，加等體積完全培養基（含 10%FBS、1% 青鏈霉素雙抗的 DMEM 培養基）終止消化；將混合物倒至 200 目細胞濾網中吹打過篩，無菌培養皿收集濾過液，以離心半徑 17 cm、800 r/min 離心 5 min，吸棄上層組織及上清液后加入 2 mL 完全培養基重懸細胞，以離心半徑 17 cm、800 r/min 離心 5 min，棄上清；以 3 mL 完全培養基重懸細胞，接種于培養皿中并置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱，隔天換液；培養至細胞覆蓋瓶壁 90% 左右，消化后按 1∶（3～4）比例傳代培養。倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態。
1.2.2 體外成脂、成骨、成軟骨誘導分化
取第 3 代 rADSCs 調整濃度為 1×104 個/mL，接種至 35 mm 細胞培養皿，采用含 10%FBS 的 DMEM 培養基培養；待細胞貼壁并生長至 90% 左右時，分別更換為成脂誘導培養基（含 10 μg/mL 胰島素、1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、0.1 mmol/L 吲哚美辛的 DMEM 培養基）、成骨誘導培養基（含 5 μg/mL 胰島素、100 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.2 mmol/L 維生素 C 的DMEM 培養基）、成軟骨誘導液進行培養。培養期間倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，分別于培養 14、14、21 d 后行油紅 O、茜素紅及甲苯胺藍染色觀察。
1.2.3 流式細胞儀鑒定
取第 3 代 rADSCs 調整濃度為 1×105 個/mL，以離心半徑 17 cm、1 200 r/min 離心 10 min；棄上清液，加入 PBS 100 μL 及 0.5 μL 待檢抗體（CD34、山羊抗兔 IgG-FITC、CD49d、CD90-FITC、CD166-FITC、兔抗山羊 IgG-FITC）；混勻，4℃ 避光孵育 60 min 后 PBS 洗滌 2 次，重懸于 500 μL PBS，流式細胞儀檢測（其中 CD49d、CD34 組孵育一抗后繼續避光孵育相應的 FITC 標記二抗 30 min，再進行檢測）。
1.3 體外 SDF-1α 處理及修飾對 ADSCs 遷移的影響
1.3.1 rADSCs 遷移實驗中 SDF-1α 最佳濃度篩選
實驗分組：1 組，單純 rADSCs；2 組，3.125 nmol/L SDF-1α+rADSCs；3 組，6.25 nmol/L SDF-1α+rADSCs；4 組，12.5 nmol/L SDF-1α+rADSCs；5 組，25 nmol/L SDF-1α+rADSCs；6 組，50 nmol/L SDF-1α+rADSCs；7 組，100 nmol/L SDF-1α+rADSCs。取第 3 代 rADSCs，待細胞長滿 80% 后調整細胞濃度為 1×105 個/mL，于 Transwell 上室加入 300 μL 細胞懸液，48 h 后按照分組，在下室內加入 600 μL 含不同濃度 SDF-1α 的完全培養基，于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養 24 h；取出 Transwell 小室，吸棄上室液體，用棉簽仔細擦凈，37℃ 預溫的 PBS 液漂洗 2 次，冰預冷的 4% 多聚甲醛固定 30 min，0.1% 結晶紫染色 10 min；將聚碳酯膜自上室基底切取下來，封片后光鏡觀察，于 200 倍下取 1 個視野，計數細胞遷移數量，實驗重復 3 次，取均值。
1.3.2 腺病毒感染及最佳感染復數（optimal multiplicity of infection，MOI）篩選
取第 3 代 rADSCs 以 4 000 個/孔密度鋪板于 96 孔板中，24 h 后分別以 Adv-GFP 腺病毒（MOI 50、100、200），Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒（MOI 100、200、400）感染，72 h 后熒光顯微鏡觀察病毒感染效率，以鏡下細胞狀態較好和熒光表達細胞數量較多組 MOI 作為最佳 MOI。
1.3.3 CCK-8 法檢測細胞增殖
取原代 rADSCs，待 80% 貼壁后調整細胞濃度為 1×104 個/mL，接種于 96 孔培養板，每孔 200 μL，于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養 24 h。將細胞分為 4 組，A 組為單純 rADSCs；B 組于 rADSCs 中加入最佳濃度的 SDF-1α 共培養；C 組采用 Adv-GFP腺病毒以最佳 MOI 感染 rADSCs；D 組采用 Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒以最佳 MOI 感染 rADSCs。分別于培養 12、24、48、72、96 h 每孔加入 20 μL CCK-8，37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱避光孵育 3 h；酶標檢測儀于 450 nm 波長處檢測吸光度（A）值，繪制細胞生長曲線。
1.3.4 SDF-1α 蛋白或 SDF-1α 過表達腺病毒感染后細胞遷移能力檢測
取第 3 代 rADSCs，同 1.3.3 方法進行分組培養后，同 1.3.1 方法檢測各組細胞遷移數量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 rADSCs 分離培養及鑒定
2.1.1 rADSCs 的生長特性
原代培養 48 h 后可見細胞貼壁生長，細胞呈長梭形或多角形；培養 6 d 后細胞明顯增加，呈集落狀生長。傳代后細胞形態以長梭狀為主，生長速度較原代細胞明顯增快。見圖 1。
圖1
原代 rADSCs 形態學觀察（倒置顯微鏡×200）
a. 培養 48 h；b. 培養 6 d
Figure1. Morphological observation of primary rADSCs (Inverted microscope×200)a. Cultured for 48 hours; b. Cultured for 6 days
2.1.2 體外成脂、成骨、成軟骨誘導分化
① 成脂誘導分化：誘導過程中細胞形態發生明顯變化，細胞逐漸變圓，14 d 后細胞內充滿大量脂滴，細胞核被擠向邊緣；油紅 O 染色示細胞內脂滴呈紅色，符合脂肪細胞的特征。② 成骨誘導分化：誘導過程中細胞由梭形變為多角形、不規則形，呈多層生長，細胞表面鈣鹽沉積；14 d 茜素紅染色示細胞密集處有橘紅色鈣沉積結節。③ 成軟骨誘導分化：培養 21 d，細胞呈多邊形或類圓形，局部形成多個結節樣結構；甲苯胺藍染色可見染成藍色的軟骨結節樣結構。見圖 2。
圖2
rADSCs 多向誘導分化鑒定（倒置顯微鏡×100）
a. 成脂誘導 14 d 油紅 O 染色觀察；b. 成骨誘導 14 d 茜素紅染色觀察；c. 成軟骨誘導 21 d 甲苯胺藍染色觀察
Figure2. Identification of multi-directional differentiations of rADSCs (Inverted microscope×100)a. Oil red O staining after adipogenic induction for 14 days; b. Alizarin red staining after osteogenic induction for 14 days; c. Toluidine blue staining after chondrogenic induction for 21 days
2.1.3 流式細胞儀鑒定
rADSCs 表面標志物特征為：CD49d、CD90、CD166 表達呈陽性，表達率高于 80%；而 CD34 表達呈陰性，表達率低于 10%。見圖 3。
圖3
rADSCs 表面標志物流式細胞儀鑒定
a. CD34；b. CD49d；c. CD90；d. CD166
Figure3. Identification of rADSCs surface markers by flow cytometrya. CD34; b. CD49d; c. CD90; d. CD166
2.2 SDF-1α 外源性刺激及內源性修飾對 rADSCs 遷移能力的影響
2.2.1 rADSCs 遷移實驗中 SDF-1α 最佳濃度篩選
倒置顯微鏡觀察及細胞遷移計數顯示，隨著下室內 SDF-1α 濃度提高，遷移的 rADSCs 逐漸增加。其中 3～7 組 rADSCs 遷移數量顯著高于 1～2 組，4～7 組顯著高于 3 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；4～7 組間差異無統計學意義（P>0.05）。因此，rADSCs 遷移實驗中 SDF-1α 的最佳濃度為 4 組 12.5 nmol/L。見圖 4、5。
圖4
不同 SDF-1α 濃度下 rADSCs 遷移能力比較（倒置顯微鏡×200）
a. 1 組；b. 2 組；c. 3 組；d. 4 組；e. 5 組；f. 6 組；g. 7 組
Figure4. Comparison of rADSCs migration ability at different SDF-1α concentrations (Inverted microscope×200)a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4; e. Group 5; f. Group 6; g. Group 7
圖5
不同 SDF-1α 濃度下 rADSCs 遷移數量比較
Figure5.
Comparison of the migration number of rADSCs at different SDF-1α concentrations
2.2.2 腺病毒感染最佳 MOI 篩選
rADSCs 經 Adv-GFP 腺病毒感染 72 h 后熒光顯微鏡下可見 rADSCs 有細胞輪廓突起于表面，熒光強度較強，表明多數細胞被轉染并成功表達，且 MOI 為 200 時效果最明顯。rADSCs 經 Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒感染 72 h 后可見熒光表達，隨著 MOI 升高，熒光強度越強，且 MOI 為 400 時效果最明顯。見圖 6、7。因此后續實驗中用 MOI 為 200 的 Adv-GFP 腺病毒和 MOI 為 400 的 Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒感染 rADSCs。
圖6
rADSCs 經 Adv-GFP 腺病毒感染 72 h 后熒光顯微鏡觀察（×100）
a. MOI 為 50；b. MOI 為 100；c. MOI 為 200
Figure6. rADSCs were infected by Adv-GFP adenovirus for 72 hours under fluorescence microscope (×100)a. MOI of 50; b. MOI of 100; c. MOI of 200
圖7
rADSCs 經 Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒感染 72 h 后熒光顯微鏡觀察（×100）
a. MOI 為 100；b. MOI 為 200；c. MOI 為 400
Figure7. rADSCs were infected by Adv-GFP-SDF-1α overexpressed adenovirus for 72 h under fluorescence microscope (×100)a. MOI of 100; b. MOI of 200; c. MOI of 400
2.2.3 CCK-8 法檢測細胞增殖
隨培養時間延長，各組細胞 A 值均逐漸增加，自 48 h 開始 B、D 組 A 值均顯著高于 A、C 組，且 96 h 時 D 組 A 值顯著高于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。其余時間點組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 8。
圖8
CCK-8 法檢測各組 rADSCs 增殖情況
Figure8.
Proliferation of rADSCs in each group detected by CCK-8 method
2.2.4 SDF-1α 蛋白或 SDF-1α 過表達腺病毒感染后細胞遷移能力檢測
倒置顯微鏡觀察示，rADSCs 經外源性添加 SDF-1α 蛋白或者感染 Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒后，細胞遷移數量顯著增加。見圖 9。A、B、C、D 組細胞遷移數量分別為（20.7±1.2）、（48.0±2.6）、（19.0±1.0）、（37.77±2.1）個/視野，B、D 組顯著高于 A、C 組，B 組顯著高于 D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖9
SDF-1α 蛋白刺激或 SDF-1α 過表達腺病毒感染后細胞遷移能力檢測（倒置顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure9. Detection of cell migration ability after SDF-1α stimulation or SDF-1α overexpressed (Inverted microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 討論
ADSCs 具有取材簡便、易于分離培養獲得、低免疫原性、多向分化潛能及旁分泌功能等特性[10]，經定向誘導后可分化成為具有脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、神經元及肝細胞等細胞譜系特征的成熟細胞[11-13]，是組織工程研究中重要的種子細胞。目前，ADSCs 已用于治療多種疾病治療以及組織再生創傷修復，如缺血性疾病、關節軟骨缺損[14-15]、心肌損傷[16]、泌尿系統功能障礙修復治療[17]等，并取得了理想效果。
在臨床實踐中，ADSCs 多作為成體組織種子細胞直接移植于體表部位或與支架復合體內移植，如面部凹陷填充修復[18]、骨組織缺損重建[19]等。ADSCs 促進組織修復再生的可能機制為：① 向再生組織的成熟細胞定向分化；② 通過旁分泌細胞因子促進局部新生血管形成，以及促周圍的炎癥細胞、成纖維細胞等發揮相關功能。對于深部損傷組織及部位實行修復再生治療，需要將 MSCs 經靜脈或動脈方式注入，如缺血性腦損傷修復[20-21]、心肌梗死修復[22]、腎臟缺血性損傷修復[23]、組織缺血再灌注損傷的修復[24]等。然而，經外周靜脈注射修復深部組織的方式面臨著 MSCs 注射后歸巢率的問題，歸巢率過低會使移植療效受限[25]，但提高輸注細胞數量會極大提高治療成本。這使得提高 MSCs 向損傷區域遷移能力成為優化療效的重要突破口之一，也是臨床應用中需要面臨的挑戰。
SDF-1 被認為是最主要的 MSCs 歸巢趨化因子之一，可以充當 MSCs 定向遷移的化學引誘物。有研究[26]證實，MSCs 的動員及歸巢（無論是外源性移植或內源性細胞）多依賴于 SDF-1 調控。SDF-1 在體內損傷組織局部通常高表達，有助于誘導 MSCs 沿濃度梯度遷移至損傷部位實現歸巢[27-28]，促進受損組織再生、修復以及炎癥因子在損傷部位的浸潤。外源性 SDF-1 也可以用于促進移植 MSCs 的動員與歸巢[29]，通過與細胞中的特異性受體 CXCR4 結合形成偶聯分子對，從而促進細胞的黏附、遷移、分泌和增殖能力，SDF-1/CXCR-4 通路的激活在 MSCs 遷移歸巢過程中發揮了關鍵作用[30-31]。這些研究說明了優化 MSCs 遷移能力是有價值的研究方向，而 SDF-1 是促進 MSCs 遷移最為高效的因子之一。
MSCs 的遷移能力對其移植治療效果的影響極大。Gleeson 等[32]的研究表明，經靜脈、動脈及局部注射途徑給予 MSCs 時，只有 2%～12% 細胞到達目標區域，且存活率很低。因此，要提高 MSCs 治療療效，就需要提高 MSCs 進入體內遷移至損傷區域的速度，但在有效提高 ADSCs 本身趨化性遷移能力的同時，還應優化細胞活性，使其在凋亡前及時到達損傷部位發揮作用。本研究體外實驗表明了在適宜濃度范圍內，外源性 SDF-1α 能促進 rADSCs 體外增殖及遷移能力增加。然而體內的相關歸巢機制比體外的遷移機制更為復雜，體內環境中外源性 SDF-1α 的濃度控制及其對體內 ADSCs 的驅動效果存在不確定性，但內源性 SDF-1α 表達則可給予細胞較為穩定和持續的驅動力。故我們采用 Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒感染 rADSCs，與空白對照的 rADSCs 相比，其增殖和遷移能力明顯增強，雖然與最佳濃度外源性 SDF-1α 刺激的 rADSCs 相比其遷移能力仍有一定差距，但增殖能力明顯高于外源性 SDF-1α 刺激的 rADSCs，提示感染 SDF-1α 也能使 rADSCs 遷移及增殖能力獲得優化。但能否利用有效濃度的 SDF-1α 或轉染 SDF-1α 增強 ADSCs 的趨化性遷移能力，促使 ADSCs 在體內迅速歸巢優化組織修復再生，以及比較兩種方法的優劣，均有待我們進一步的動物實驗驗證。
綜上述，SDF-1α 作為趨化因子不僅能促進 rADSCs 增殖，還可提高 rADSCs 遷移能力，構建穩定表達 SDF-1α 的 rADSCs 也能獲得這種優化效果。SDF-1α 對 ADSCs 應用于臨床組織再生、創傷修復治療有一定的優化作用，為優化 ADSCs 促進損傷組織修復提供了有力的實驗數據支撐。
作者貢獻：梁至潔、黃東琳負責數據分析及文章撰寫；張木子、易曉林、吳芳曉負責數據收集整理；朱丹丹、寧艷、甘慧敏負責細胞實驗；黎洪棉負責科研設計。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：涉及動物的研究方案獲得廣西醫科大學實驗動物倫理委員會批準（201905057）。實驗動物使用許可證號：SYXK（桂）2014-0003。
近年來，再生醫學應用研究的熱點聚焦于脂肪干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs），這是一類由脂肪組織分離獲得的 MSCs，具有較強的增殖能力、多向分化（成脂、成骨、成軟骨、成神經等）潛能以及旁分泌、免疫調節等功能，其來源豐富且易于分離[1-2]，適用于傷口愈合[3]、血運重建、骨骼肌肉組織再生修復等臨床疾病的治療[4]，凸顯了強大的再生功能。基質細胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）又名 CXCL12，屬于 CXC 類趨化因子[5]，在胚胎發育、受傷組織、低氧條件下表達[6]，在體內的形式以 SDF-1α 為主，是一種具有多種生物學功能的趨化細胞因子，如 MSCs 動員、炎癥細胞浸潤和血管新生等[7]，可促進 MSCs、原始細胞或祖細胞等發生募集歸巢[8]。ADSCs 應用于創傷修復與再生治療主要有以下環節：ADSCs 的動員遷移、分化以及新生組織的成熟[9]，其中 ADSCs 在體內趨化至損傷部位是組織修復的基礎。因此，探索有效的趨化條件或手段來進一步誘導 ADSCs 的遷移進而促進組織修復，是再生醫學臨床應用中需要解決的問題。本研究通過體外實驗，擬使用腺病毒構建 SDF-1α 過表達的大鼠 ADSCs（rat ADSCs，rADSCs），探討 SDF-1α 修飾 rADSCs 促進其遷移能力的可能性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6 周齡 SPF 級 SD 大鼠 3 只，雌雄不拘，體質量 180～200 g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。
DMEM 培養基、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、無水乙醇、15% 水合氯醛、PBS、FBS（HyClone 公司，美國）；青鏈霉素雙抗（上海生工生物工程有限公司）；山羊抗兔 IgG-FITC、CD90-FITC（eBioscienc 公司，美國）；CD49d、CD34、CD166-FITC、兔抗山羊 IgG-FITC（Invitrogen 公司，美國）；地塞米松、吲哚美辛、胰島素、甘油三酯檢測試劑盒、β-甘油磷酸鈉、維生素 C、茜素紅 S 染色液、甲苯胺藍染色液（北京索萊寶科技有限公司）；油紅 O（上海伊卡生物技術有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（合肥白鯊生物科技有限公司）；成軟骨誘導液、0.1% 結晶紫染液（中國臨床試驗集團）；大鼠重組 SDF-1α 蛋白（艾博抗上海貿易有限公司）；攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒載體（recombinant adenovirus-mediated green fluorescent protein，Adv-GFP）、Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒載體（蘇州吉瑪科技有限公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技術有限公司）。
Transwell 小室、96 孔培養板（Costar Coring Incorporated 公司，美國）；酶標檢測儀（北京長弓科技有限公司）；搖床（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰科技有限公司）；低溫臺式離心機（Eppendorf 公司，德國）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；光學顯微鏡、熒光顯微鏡、倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；細胞培養箱、紫外及可見光分光光度計（Thermo Fisher 公司，美國）；超聲細胞破碎儀（上海之信儀器有限公司）。
1.2 rADSCs 分離培養及鑒定
1.2.1 rADSCs 分離培養
取 3 只 SD 大鼠腹腔注射 15% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后脫頸處死，乙醇浸泡 10 min，超凈臺中取腹股溝脂肪組織；移至離心管中剪成 1 mm×1 mm×1 mm 糊狀，無菌 PBS 沖洗；加入 0.1%Ⅰ型膠原酶 37℃ 振蕩消化 30～40 min，加等體積完全培養基（含 10%FBS、1% 青鏈霉素雙抗的 DMEM 培養基）終止消化；將混合物倒至 200 目細胞濾網中吹打過篩，無菌培養皿收集濾過液，以離心半徑 17 cm、800 r/min 離心 5 min，吸棄上層組織及上清液后加入 2 mL 完全培養基重懸細胞，以離心半徑 17 cm、800 r/min 離心 5 min，棄上清；以 3 mL 完全培養基重懸細胞，接種于培養皿中并置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱，隔天換液；培養至細胞覆蓋瓶壁 90% 左右，消化后按 1∶（3～4）比例傳代培養。倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態。
1.2.2 體外成脂、成骨、成軟骨誘導分化
取第 3 代 rADSCs 調整濃度為 1×104 個/mL，接種至 35 mm 細胞培養皿，采用含 10%FBS 的 DMEM 培養基培養；待細胞貼壁并生長至 90% 左右時，分別更換為成脂誘導培養基（含 10 μg/mL 胰島素、1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、0.1 mmol/L 吲哚美辛的 DMEM 培養基）、成骨誘導培養基（含 5 μg/mL 胰島素、100 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.2 mmol/L 維生素 C 的DMEM 培養基）、成軟骨誘導液進行培養。培養期間倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，分別于培養 14、14、21 d 后行油紅 O、茜素紅及甲苯胺藍染色觀察。
1.2.3 流式細胞儀鑒定
取第 3 代 rADSCs 調整濃度為 1×105 個/mL，以離心半徑 17 cm、1 200 r/min 離心 10 min；棄上清液，加入 PBS 100 μL 及 0.5 μL 待檢抗體（CD34、山羊抗兔 IgG-FITC、CD49d、CD90-FITC、CD166-FITC、兔抗山羊 IgG-FITC）；混勻，4℃ 避光孵育 60 min 后 PBS 洗滌 2 次，重懸于 500 μL PBS，流式細胞儀檢測（其中 CD49d、CD34 組孵育一抗后繼續避光孵育相應的 FITC 標記二抗 30 min，再進行檢測）。
1.3 體外 SDF-1α 處理及修飾對 ADSCs 遷移的影響
1.3.1 rADSCs 遷移實驗中 SDF-1α 最佳濃度篩選
實驗分組：1 組，單純 rADSCs；2 組，3.125 nmol/L SDF-1α+rADSCs；3 組，6.25 nmol/L SDF-1α+rADSCs；4 組，12.5 nmol/L SDF-1α+rADSCs；5 組，25 nmol/L SDF-1α+rADSCs；6 組，50 nmol/L SDF-1α+rADSCs；7 組，100 nmol/L SDF-1α+rADSCs。取第 3 代 rADSCs，待細胞長滿 80% 后調整細胞濃度為 1×105 個/mL，于 Transwell 上室加入 300 μL 細胞懸液，48 h 后按照分組，在下室內加入 600 μL 含不同濃度 SDF-1α 的完全培養基，于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養 24 h；取出 Transwell 小室，吸棄上室液體，用棉簽仔細擦凈，37℃ 預溫的 PBS 液漂洗 2 次，冰預冷的 4% 多聚甲醛固定 30 min，0.1% 結晶紫染色 10 min；將聚碳酯膜自上室基底切取下來，封片后光鏡觀察，于 200 倍下取 1 個視野，計數細胞遷移數量，實驗重復 3 次，取均值。
1.3.2 腺病毒感染及最佳感染復數（optimal multiplicity of infection，MOI）篩選
取第 3 代 rADSCs 以 4 000 個/孔密度鋪板于 96 孔板中，24 h 后分別以 Adv-GFP 腺病毒（MOI 50、100、200），Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒（MOI 100、200、400）感染，72 h 后熒光顯微鏡觀察病毒感染效率，以鏡下細胞狀態較好和熒光表達細胞數量較多組 MOI 作為最佳 MOI。
1.3.3 CCK-8 法檢測細胞增殖
取原代 rADSCs，待 80% 貼壁后調整細胞濃度為 1×104 個/mL，接種于 96 孔培養板，每孔 200 μL，于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養 24 h。將細胞分為 4 組，A 組為單純 rADSCs；B 組于 rADSCs 中加入最佳濃度的 SDF-1α 共培養；C 組采用 Adv-GFP腺病毒以最佳 MOI 感染 rADSCs；D 組采用 Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒以最佳 MOI 感染 rADSCs。分別于培養 12、24、48、72、96 h 每孔加入 20 μL CCK-8，37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱避光孵育 3 h；酶標檢測儀于 450 nm 波長處檢測吸光度（A）值，繪制細胞生長曲線。
1.3.4 SDF-1α 蛋白或 SDF-1α 過表達腺病毒感染后細胞遷移能力檢測
取第 3 代 rADSCs，同 1.3.3 方法進行分組培養后，同 1.3.1 方法檢測各組細胞遷移數量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 rADSCs 分離培養及鑒定
2.1.1 rADSCs 的生長特性
原代培養 48 h 后可見細胞貼壁生長，細胞呈長梭形或多角形；培養 6 d 后細胞明顯增加，呈集落狀生長。傳代后細胞形態以長梭狀為主，生長速度較原代細胞明顯增快。見圖 1。
圖1
原代 rADSCs 形態學觀察（倒置顯微鏡×200）
a. 培養 48 h；b. 培養 6 d
Figure1. Morphological observation of primary rADSCs (Inverted microscope×200)a. Cultured for 48 hours; b. Cultured for 6 days
2.1.2 體外成脂、成骨、成軟骨誘導分化
① 成脂誘導分化：誘導過程中細胞形態發生明顯變化，細胞逐漸變圓，14 d 后細胞內充滿大量脂滴，細胞核被擠向邊緣；油紅 O 染色示細胞內脂滴呈紅色，符合脂肪細胞的特征。② 成骨誘導分化：誘導過程中細胞由梭形變為多角形、不規則形，呈多層生長，細胞表面鈣鹽沉積；14 d 茜素紅染色示細胞密集處有橘紅色鈣沉積結節。③ 成軟骨誘導分化：培養 21 d，細胞呈多邊形或類圓形，局部形成多個結節樣結構；甲苯胺藍染色可見染成藍色的軟骨結節樣結構。見圖 2。
圖2
rADSCs 多向誘導分化鑒定（倒置顯微鏡×100）
a. 成脂誘導 14 d 油紅 O 染色觀察；b. 成骨誘導 14 d 茜素紅染色觀察；c. 成軟骨誘導 21 d 甲苯胺藍染色觀察
Figure2. Identification of multi-directional differentiations of rADSCs (Inverted microscope×100)a. Oil red O staining after adipogenic induction for 14 days; b. Alizarin red staining after osteogenic induction for 14 days; c. Toluidine blue staining after chondrogenic induction for 21 days
2.1.3 流式細胞儀鑒定
rADSCs 表面標志物特征為：CD49d、CD90、CD166 表達呈陽性，表達率高于 80%；而 CD34 表達呈陰性，表達率低于 10%。見圖 3。
圖3
rADSCs 表面標志物流式細胞儀鑒定
a. CD34；b. CD49d；c. CD90；d. CD166
Figure3. Identification of rADSCs surface markers by flow cytometrya. CD34; b. CD49d; c. CD90; d. CD166
2.2 SDF-1α 外源性刺激及內源性修飾對 rADSCs 遷移能力的影響
2.2.1 rADSCs 遷移實驗中 SDF-1α 最佳濃度篩選
倒置顯微鏡觀察及細胞遷移計數顯示，隨著下室內 SDF-1α 濃度提高，遷移的 rADSCs 逐漸增加。其中 3～7 組 rADSCs 遷移數量顯著高于 1～2 組，4～7 組顯著高于 3 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；4～7 組間差異無統計學意義（P>0.05）。因此，rADSCs 遷移實驗中 SDF-1α 的最佳濃度為 4 組 12.5 nmol/L。見圖 4、5。
圖4
不同 SDF-1α 濃度下 rADSCs 遷移能力比較（倒置顯微鏡×200）
a. 1 組；b. 2 組；c. 3 組；d. 4 組；e. 5 組；f. 6 組；g. 7 組
Figure4. Comparison of rADSCs migration ability at different SDF-1α concentrations (Inverted microscope×200)a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4; e. Group 5; f. Group 6; g. Group 7
圖5
不同 SDF-1α 濃度下 rADSCs 遷移數量比較
Figure5.
Comparison of the migration number of rADSCs at different SDF-1α concentrations
2.2.2 腺病毒感染最佳 MOI 篩選
rADSCs 經 Adv-GFP 腺病毒感染 72 h 后熒光顯微鏡下可見 rADSCs 有細胞輪廓突起于表面，熒光強度較強，表明多數細胞被轉染并成功表達，且 MOI 為 200 時效果最明顯。rADSCs 經 Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒感染 72 h 后可見熒光表達，隨著 MOI 升高，熒光強度越強，且 MOI 為 400 時效果最明顯。見圖 6、7。因此后續實驗中用 MOI 為 200 的 Adv-GFP 腺病毒和 MOI 為 400 的 Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒感染 rADSCs。
圖6
rADSCs 經 Adv-GFP 腺病毒感染 72 h 后熒光顯微鏡觀察（×100）
a. MOI 為 50；b. MOI 為 100；c. MOI 為 200
Figure6. rADSCs were infected by Adv-GFP adenovirus for 72 hours under fluorescence microscope (×100)a. MOI of 50; b. MOI of 100; c. MOI of 200
圖7
rADSCs 經 Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒感染 72 h 后熒光顯微鏡觀察（×100）
a. MOI 為 100；b. MOI 為 200；c. MOI 為 400
Figure7. rADSCs were infected by Adv-GFP-SDF-1α overexpressed adenovirus for 72 h under fluorescence microscope (×100)a. MOI of 100; b. MOI of 200; c. MOI of 400
2.2.3 CCK-8 法檢測細胞增殖
隨培養時間延長，各組細胞 A 值均逐漸增加，自 48 h 開始 B、D 組 A 值均顯著高于 A、C 組，且 96 h 時 D 組 A 值顯著高于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。其余時間點組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 8。
圖8
CCK-8 法檢測各組 rADSCs 增殖情況
Figure8.
Proliferation of rADSCs in each group detected by CCK-8 method
2.2.4 SDF-1α 蛋白或 SDF-1α 過表達腺病毒感染后細胞遷移能力檢測
倒置顯微鏡觀察示，rADSCs 經外源性添加 SDF-1α 蛋白或者感染 Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒后，細胞遷移數量顯著增加。見圖 9。A、B、C、D 組細胞遷移數量分別為（20.7±1.2）、（48.0±2.6）、（19.0±1.0）、（37.77±2.1）個/視野，B、D 組顯著高于 A、C 組，B 組顯著高于 D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖9
SDF-1α 蛋白刺激或 SDF-1α 過表達腺病毒感染后細胞遷移能力檢測（倒置顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure9. Detection of cell migration ability after SDF-1α stimulation or SDF-1α overexpressed (Inverted microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 討論
ADSCs 具有取材簡便、易于分離培養獲得、低免疫原性、多向分化潛能及旁分泌功能等特性[10]，經定向誘導后可分化成為具有脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、神經元及肝細胞等細胞譜系特征的成熟細胞[11-13]，是組織工程研究中重要的種子細胞。目前，ADSCs 已用于治療多種疾病治療以及組織再生創傷修復，如缺血性疾病、關節軟骨缺損[14-15]、心肌損傷[16]、泌尿系統功能障礙修復治療[17]等，并取得了理想效果。
在臨床實踐中，ADSCs 多作為成體組織種子細胞直接移植于體表部位或與支架復合體內移植，如面部凹陷填充修復[18]、骨組織缺損重建[19]等。ADSCs 促進組織修復再生的可能機制為：① 向再生組織的成熟細胞定向分化；② 通過旁分泌細胞因子促進局部新生血管形成，以及促周圍的炎癥細胞、成纖維細胞等發揮相關功能。對于深部損傷組織及部位實行修復再生治療，需要將 MSCs 經靜脈或動脈方式注入，如缺血性腦損傷修復[20-21]、心肌梗死修復[22]、腎臟缺血性損傷修復[23]、組織缺血再灌注損傷的修復[24]等。然而，經外周靜脈注射修復深部組織的方式面臨著 MSCs 注射后歸巢率的問題，歸巢率過低會使移植療效受限[25]，但提高輸注細胞數量會極大提高治療成本。這使得提高 MSCs 向損傷區域遷移能力成為優化療效的重要突破口之一，也是臨床應用中需要面臨的挑戰。
SDF-1 被認為是最主要的 MSCs 歸巢趨化因子之一，可以充當 MSCs 定向遷移的化學引誘物。有研究[26]證實，MSCs 的動員及歸巢（無論是外源性移植或內源性細胞）多依賴于 SDF-1 調控。SDF-1 在體內損傷組織局部通常高表達，有助于誘導 MSCs 沿濃度梯度遷移至損傷部位實現歸巢[27-28]，促進受損組織再生、修復以及炎癥因子在損傷部位的浸潤。外源性 SDF-1 也可以用于促進移植 MSCs 的動員與歸巢[29]，通過與細胞中的特異性受體 CXCR4 結合形成偶聯分子對，從而促進細胞的黏附、遷移、分泌和增殖能力，SDF-1/CXCR-4 通路的激活在 MSCs 遷移歸巢過程中發揮了關鍵作用[30-31]。這些研究說明了優化 MSCs 遷移能力是有價值的研究方向，而 SDF-1 是促進 MSCs 遷移最為高效的因子之一。
MSCs 的遷移能力對其移植治療效果的影響極大。Gleeson 等[32]的研究表明，經靜脈、動脈及局部注射途徑給予 MSCs 時，只有 2%～12% 細胞到達目標區域，且存活率很低。因此，要提高 MSCs 治療療效，就需要提高 MSCs 進入體內遷移至損傷區域的速度，但在有效提高 ADSCs 本身趨化性遷移能力的同時，還應優化細胞活性，使其在凋亡前及時到達損傷部位發揮作用。本研究體外實驗表明了在適宜濃度范圍內，外源性 SDF-1α 能促進 rADSCs 體外增殖及遷移能力增加。然而體內的相關歸巢機制比體外的遷移機制更為復雜，體內環境中外源性 SDF-1α 的濃度控制及其對體內 ADSCs 的驅動效果存在不確定性，但內源性 SDF-1α 表達則可給予細胞較為穩定和持續的驅動力。故我們采用 Adv-GFP-SDF-1α 過表達腺病毒感染 rADSCs，與空白對照的 rADSCs 相比，其增殖和遷移能力明顯增強，雖然與最佳濃度外源性 SDF-1α 刺激的 rADSCs 相比其遷移能力仍有一定差距，但增殖能力明顯高于外源性 SDF-1α 刺激的 rADSCs，提示感染 SDF-1α 也能使 rADSCs 遷移及增殖能力獲得優化。但能否利用有效濃度的 SDF-1α 或轉染 SDF-1α 增強 ADSCs 的趨化性遷移能力，促使 ADSCs 在體內迅速歸巢優化組織修復再生，以及比較兩種方法的優劣，均有待我們進一步的動物實驗驗證。
綜上述，SDF-1α 作為趨化因子不僅能促進 rADSCs 增殖，還可提高 rADSCs 遷移能力，構建穩定表達 SDF-1α 的 rADSCs 也能獲得這種優化效果。SDF-1α 對 ADSCs 應用于臨床組織再生、創傷修復治療有一定的優化作用，為優化 ADSCs 促進損傷組織修復提供了有力的實驗數據支撐。
作者貢獻：梁至潔、黃東琳負責數據分析及文章撰寫；張木子、易曉林、吳芳曉負責數據收集整理；朱丹丹、寧艷、甘慧敏負責細胞實驗；黎洪棉負責科研設計。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：涉及動物的研究方案獲得廣西醫科大學實驗動物倫理委員會批準（201905057）。實驗動物使用許可證號：SYXK（桂）2014-0003。
