引用本文： 賀亞軍, 孫麟, 馮皓宇, 李季聲, 張楠, 王志強. 甘草甜素抑制高遷移率族蛋白 B1 對大鼠脊髓損傷后膠質瘢痕形成的作用及機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(10): 1298-1304. doi: 10.7507/1002-1892.202002116 復制
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后組織中大量反應性星形膠質細胞肥大、增生，膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）等中間絲蛋白高表達[1]，大量硫酸軟骨素蛋白聚糖（chondroitin sulfate proteoglycan，CSPG）分泌至細胞外基質中[2]。而 GFAP 與 CSPG 是膠質瘢痕的重要組成成分，SCI 后 2 周即開始形成膠質瘢痕，構成物理屏障與化學屏障，抑制軸突再生[3]。
高遷移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種促炎因子， SCI 后 HMGB1 表達上調，在促炎癥反應中起著關鍵作用，而炎癥反應與 SCI 后膠質瘢痕的形成密切相關[4]。有文獻報道，抗 HMGB1 治療可促進繼發性 SCI 后脊髓功能的恢復[5]。甘草甜素（glycyrrhizin，GL）是一種 HMGB1 抑制劑，在腦損傷及 SCI 早期發揮一定保護作用[6]。本課題組前期研究表明，GL 可緩解 SCI 后急性期脊髓水腫[7]。但目前有關其對 SCI 后膠質瘢痕形成的影響罕見報道。另外，有研究發現 GL 能通過 HMGB1/NF-κB 途徑抑制星形膠質細胞凋亡，發揮細胞保護作用[8]，其是否也通過該途徑影響膠質瘢痕形成尚缺乏有效論證。為此，本次研究旨在探討 GL 抑制 HMGB1 對 SCI 后膠質瘢痕形成的影響，并通過應用 NF-κB 抑制劑 1-吡咯烷二硫代羧酸銨鹽（pynolidine dithiocarbamate，PDTC）[9]分析其作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8～10 周齡 SPF 級雌性 SD 大鼠 72 只，體質量 220～250 g，由北京海淀區實驗動物飼養場及山西醫科大學動物中心提供，飼養于山西醫科大學生理動物實驗室。飼養條件：室溫 25℃、濕度 40%～50%、循環照明 12 h。
GL（純度>95%；上海伊卡生物技術有限公司）；PDTC、抗 CSPG 抗體（Sigma 公司，德國）；GAPDH 抗體（Bioworld 公司，美國）；抗 HMGB1 抗體 [艾博抗（上海）貿易有限公司]；抗 GFAP 抗體（CST 公司，美國）；抗 Histone 抗體（上海碧云天生物技術有限公司）；HE 試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗、BCA 蛋白質分析試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。凝膠成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）；Image pro-plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）；Image J 1.52v 軟件（美國國立衛生研究院）。
1.2 實驗分組及方法
取 72 只 SD 大鼠隨機分為 4 組，分別為假手術組（n=12）、SCI 模型組（SCI 組，n=36）、GL 干預組（SCI+GL 組，n=12）以及 PDTC 干預組（SCI+PDTC 組，n=12）。
大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，俯臥位固定，剃除背部毛發，聚維酮碘消毒皮膚。定位 T10 節段，作背部正中切口長 3～4 cm，逐層切開后行椎板切除術，暴露脊髓。其中，假手術組僅切除椎板，不損傷脊髓。其余 3 組應用改良 Allen’ s 重物墜落實驗制備 SCI 模型[5, 10]，撞擊桿質量為 10 g，墜落高度 25 mm；撞擊后大鼠脊髓表面立即充血、出現收縮下肢及擺尾反射，提示 SCI 模型制備成功。SCI 模型制備后大鼠連續皮下注射青霉素鈉（8 萬 U/只）3 d，按摩膀胱輔助排尿，每天 2 次，直至排尿反射恢復。
SCI 模型制備后，SCI+GL 組及 SCI+PDTC 組大鼠分別腹腔注射 GL（100 mg/kg）[11]以及 PDTC（100 mg/kg）[12]，每天 1 次，持續 3 周。SCI 組于術后 1、2、3 周各取 12 只大鼠，假手術組、SCI+GL 組及 SCI+PDTC 組于術后 3 周取 12 只大鼠進行觀測。其中 6 只行 Western blot 檢測，6 只行組織學及免疫組織化學染色觀察。
1.3 SCI 后膠質瘢痕形成相關觀測
1.3.1 行為學觀測
術后 1、2、3 周取假手術組及 SCI 組大鼠（n=6），采用BBB 評分[13]和斜坡實驗[14]評價大鼠后肢運動功能。BBB 評分記錄 2 次有效評分，取均值；斜坡實驗時獲取 5 次有效角度，取均值。
1.3.2 Western blot 檢測
取術后 3 周假手術組以及術后 1、2、3 周 SCI 組大鼠（n=6），同上法麻醉后，自心尖灌注生理鹽水，直至右心耳流出清亮液體；按照原手術切口入路，以損傷節段為中心切取長 10 mm 的脊髓組織。提取蛋白上清后，使用 BCA 蛋白質分析試劑盒測定蛋白質濃度。上樣電泳后轉移至聚偏二氟乙烯膜，置于 5% 脫脂牛奶中阻斷封閉膜 2 h 后，分別添加一抗 4℃ 孵育過夜，包括抗 HMGB1 抗體（1∶1 000）、抗 GFAP 抗體（1∶1 000），以 GAPDH 作為內參。TBST 洗膜后用相應二抗孵育 2 h，ECL 顯影技術觀察條帶，使用 Image J 1.52v 軟件計算 HMGB1 及 GFAP 蛋白相對表達量。
根據 SCI 組行為學及 Western blot 檢測結果，選擇 BBB 評分、斜坡角度以及 HMGB1 蛋白表達明顯增高，且 GFAP 蛋白表達最明顯的時間點標本，進行 GL 對大鼠 SCI 后膠質瘢痕形成作用的實驗。
1.4 GL 對大鼠 SCI 后膠質瘢痕形成的作用及機制
1.4.1 行為學觀測
術后 1、2、3 周取 SCI+GL 組大鼠（n=6），參照 1.3.1 方法行后肢 BBB 評分及斜坡實驗，并與同時間點 SCI 組及假手術組觀測結果進行比較。
1.4.2 組織學觀察
取術后 3 周假手術組、SCI 組及 SCI+GL 組大鼠（n=6），同上法麻醉后，自心尖灌注生理鹽水及 4% 多聚甲醛固定 30 min。以原手術切口入路，以損傷水平為中心切取長 10 mm 的脊髓組織，置于 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，脫水、石蠟包埋、切片，片厚 4 μm。取部分切片常規 HE 染色后，光鏡下觀察脊髓組織結構、炎癥細胞浸潤、囊腔及膠質瘢痕形成等情況。
1.4.3 Western blot 檢測
取術后 3 周假手術組、SCI 組、SCI+GL 組、SCI+PDTC 組大鼠（n=6），參照 1.3.2 中方法檢測 HMGB1、GFAP、NF-κB 蛋白相對表達量，其中 SCI+PDTC 組僅檢測 GFAP、NF-κB 蛋白。
1.4.4 免疫組織化學染色觀察
取 1.4.2 制備的各組部分脊髓組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，EDTA 稀釋液進行抗原修復。置于 5% 牛血清白蛋白中，37℃ 封閉 30 min、4℃一抗 [抗 GFAP 抗體（1∶100）、抗 CSPG 抗體（1∶100）] 孵育過夜；PBS 沖洗 3 次，37℃ 二抗孵育 30 min。PBS 沖洗，DAB 顯色試劑顯色 90 s。蒸餾水沖洗后 37℃ 下蘇木素染色 20 s，脫水、封片。光鏡下觀察并采集圖片，用 Image pro-plus 6.0 軟件測定 GFAP、CSPG 蛋白積分吸光度（IA）值，計算 GFAP 陽性細胞率（GFAP 陽性細胞數/視野細胞數）。其中，SCI+PDTC 組僅進行 CSPG 免疫組織化學染色檢測。
1.5 統計學方法
采用 SPSS22.0 及 GraphPad Prism7.04 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 SCI 后膠質瘢痕形成相關觀測
2.1.1 行為學觀測
術后 SCI 組大鼠后肢 BBB 評分及斜坡角度隨時間延長而逐漸增大，但各時間點均明顯低于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
圖1
大鼠行為學觀測
a. BBB 評分；b. 斜坡實驗
Figure1. Behavioral test of ratsa. BBB score; b. Slope test
2.1.2 Western blot 檢測
SCI 組術后 1、2、3 周 HMGB1 及 GFAP 蛋白相對表達量均明顯高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）。隨時間延長，SCI 組 HMGB1 蛋白相對表達量逐漸降低，其中術后 1 周與 2、3 周時差異有統計學意義（P<0.05），2、3 周間差異無統計學意義（P>0.05）；而 GFAP 蛋白相對表達量逐漸增高，術后各時間點間差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2、3。
圖2
Western blot 檢測 HMGB1 蛋白表達
1：假手術組2：SCI 組 1 周 3：SCI 組 2 周 4：SCI 組 3 周 5：SCI+GL 組 3 周 a. 電泳圖；b. HMGB1 蛋白相對表達量
Figure2. The expression of HMGB1 protein detected by Western blot1: Sham group 2: SCI group for 1 week 3: SCI group for2 weeks 4: SCI group for 3 weeks 5: SCI+GL group for 3 weeksa. Electrophoregram; b. Relative expression of HMGB1 protein
圖3
Western blot 檢測 GFAP 蛋白表達
1：假手術組 2：SCI 組 1 周 3：SCI 組 2 周 4：SCI 組 3 周 5：SCI+PDTC 組 3 周 6：SCI+GL 組 3 周 a. 電泳圖；b. GFAP 蛋白相對表達量
Figure3. The expression of GFAP protein detected by Western blot 1: Sham group 2: SCI group for 1 week 3: SCI group for 2 weeks 4: SCI group for 3 weeks 5: SCI+PDTC group for 3 weeks 6: SCI+GL group for 3 weeks a. Electrophoregram; b. Relative expression of GFAP protein根據行為學及 Western blot 檢測結果，選擇 SCI 組術后 3 周脊髓組織行后續實驗。
2.2 GL 對大鼠 SCI 后膠質瘢痕形成的作用及機制
2.2.1 行為學觀測
術后隨時間延長，SCI+GL 組大鼠后肢運動功能逐漸恢復。除術后 2 周 SCI+GL 組與 SCI 組 BBB 評分差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各時間點 SCI+GL 組 BBB 評分及斜坡角度均明顯低于假手術組、高于 SCI 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
2.2.2 組織學觀察
術后 3 周，假手術組脊髓組織結構完整、致密整齊，細胞結構完整，核大且圓，核仁清晰。SCI 組脊髓組織結構紊亂，大量活化星形膠質細胞肥大、增殖，可見大量炎癥細胞、囊腔及膠質瘢痕形成。SCI+GL 組脊髓損傷區域結構紊亂較 SCI 組改善，炎癥細胞浸潤減少，囊腔及膠質瘢痕形成區域減小，膠質瘢痕形成有所減少。見圖 4。
圖4
術后 3 周 HE 染色觀察（×400）
a. 假手術組；b. SCI 組；c. SCI+GL 組
Figure4. HE staining observation at 3 weeks after operation (× 400)a. Sham group; b. SCI group; c. SCI+GL group
2.2.3 Western blot 檢測
術后 3 周，SCI+GL 組 HMGB1 蛋白相對表達量較 SCI 組明顯下調，但仍高于假手術組，差異均有統計學意義（P<0.05）。SCI+GL 組及 SCI+PDTC 組 GFAP、NF-κB 蛋白相對表達量均較 SCI 組明顯下調，但仍高于假手術組，差異均有統計學意義（P<0.05）；與 SCI+GL 組比較，SCI+PDTC 組 NF-κB 蛋白相對表達量明顯降低、GFAP 蛋白相對表達量升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2、3、5。
圖5
各組術后 3 周 Western blot 檢測 NF-κB 蛋白表達
1：假手術組 2：SCI 組 3：SCI+PDTC 組 4：SCI+GL 組 a. 電泳圖；b. NF-κB 蛋白相對表達量
Figure5. The expression of NF-κB protein in each group at 3 weeks after operation detected by Western blot1: Sham group 2: SCI group 3: SCI+PDTC group 4: SCI+GL group a. Electrophoregram; b. Relative expression of NF-κB protein
2.2.4 免疫組織化學染色觀察
術后 3 周，SCI 組中 GFAP 顯著高表達，GFAP 表達陽性的星形膠質細胞肥大、增殖，組織結構紊亂，有腔隙、囊腔形成；SCI+GL 組中 GFAP 表達陽性的星形膠質細胞肥大、增殖情況較 SCI 組明顯改善，腔隙幾乎不可見。定量分析顯示，假手術組、SCI 組、SCI+GL 組 GFAP 蛋白 IA 值分別為0.50±0.10、1.03±0.21、0.74±0.19，陽性細胞率分別為0.42±0.10、3.75±0.76、0.90±0.17；SCI+GL 組 GFAP IA 值以及陽性細胞率明顯低于 SCI 組，但仍高于假手術組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
圖6
術后 3 周 GFAP 免疫組織化學染色觀察（×400）
a. 假手術組； b. SCI 組； c. SCI+GL 組
Figure6. The immunohistochemical staining of GFAP expression at 3 weeks after operation (×400)a. Sham group; b. SCI group; c. SCI+GL group
術后 3 周，SCI 組細胞外基質中 CSPG 表達顯著增多，且呈現越接近損傷部位 CSPG 表達越強的趨勢，有較大面積的腔隙、囊腔形成，損傷區域組織結構紊亂。與 SCI 組相比，SCI+GL 組以及 SCI+PDTC 組囊腔、腔隙略減小。定量分析顯示，假手術組、SCI 組、SCI+GL 組、SCI+PDTC 組 CSPG 蛋白 IA 值分別為 0.41±0.10、0.93±0.23、0.62±0.10、0.72±0.09；SCI+GL 組、SCI+PDTC 組 CSPG IA 值明顯低于 SCI 組。SCI+GL 組低于 SCI+PDTC 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。而且上述 3 組均顯著高于假手術組，差異亦有統計學意義（P<0.05）。見圖 7。
圖7
術后 3 周 CSPG 免疫組織化學染色觀察（×400）
a. 假手術組； b. SCI 組； c. SCI+PDTC 組； d. SCI+GL 組
Figure7. Immunohistochemical staining of CSPG protein at 3 weeks after operation (×400)a. Sham group; b. SCI group; c. SCI+PDTC group; d. SCI+GL group
3 討論
中樞神經系統損傷后會產生大量 HMGB1 并擴散至細胞外，發揮強大的促炎活性[15]。研究發現，人急性 SCI 后血漿及脊髓中 HMGB1 水平顯著升高[7, 16]，而 HMGB1 水平升高與神經系統不良結局緊密相關[17]。HMGB1 可持續發揮晚期促炎因子作用[18]，使星形膠質細胞持續活化、增殖[8, 19]，GFAP 高表達，CSPG 亦在損傷后 1 d 內迅速分泌并持續數月[20]，二者共同形成膠質瘢痕。而陳舊性膠質瘢痕中 CSPG 對軸突生長具有極強抑制作用[3, 21]，抑制脊髓神經功能的恢復。本研究結果顯示，SCI 組 HMGB1 蛋白表達隨時間延長逐漸降低，但仍高于假手術組；3 周時 GFAP 及 CSPG 蛋白表達在各組中最高，星形膠質細胞活化增殖最明顯，提示脊髓組織中 GFAP、CSPG 蛋白過度表達會導致大量膠質瘢痕形成，組織學染色觀察結果與之對應，且 CSPG 在損傷中心區域表達更高，可能系損傷中心區域炎癥介質作用更強所致。行為學觀測表明 SCI 后大鼠后肢運動功能隨時間延長有所恢復，但評分均較低。上述結果表明 HMGB1 可促進大鼠 SCI 后膠質瘢痕的形成，阻礙了脊髓功能恢復。
目前已有研究發現抗 HMGB1 治療可改善 SCI 后缺血再灌注損傷[22]與出血[23]，應用 GL 抑制 HMGB1 的表達可減輕腦卒中[24]、蛛網膜下腔出血[25]以及 SCI 后脊髓水腫[10-11]，促進脊髓功能恢復。本研究結果顯示，SCI+GL 組 SCI 大鼠應用 GL 3 周后，HMGB1 表達明顯下調，GFAP 蛋白表達、陽性細胞率及 IA 值以及 CSPG 蛋白 IA 值均較 SCI 組明顯降低，表明 GL 明顯抑制了星形膠質細胞的活化增殖，下調了膠質瘢痕中 GFAP 及 CSPG 的表達，使膠質瘢痕形成減少，組織學觀察亦提示 GL 改善了脊髓結構紊亂情況，囊腔、膠質瘢痕形成減少；行為學觀測表明 GL 促進了大鼠后肢運動功能的恢復。
SCI 后脊髓組織中炎癥因子 TNF-α、IL-4、Toll 樣受體等大量釋放并激活 NF-κB 途徑，從而進一步激活炎癥反應過程[26]。細胞內 HMGB1 可通過激活細胞質內 NF-κB 的核轉位，進一步促進炎癥因子的釋放，加重細胞、組織損傷[27]。而 HMGB1 抑制劑可通過抑制 HMGB1/NF-κB 途徑改善 SCI 急性期脊髓水腫、星形膠質細胞凋亡[7-8]。為此，本研究探討了 GL 是否通過 HMGB1/NF-κB 途徑抑制膠質瘢痕形成。結果顯示 SCI+GL 組 NF-κB、GFAP 蛋白表達及 CSPG IA 值均較 SCI 組顯著下調，膠質瘢痕形成得到了抑制，說明膠質瘢痕的形成與 HMGB1 及 NF-κB 相關。而 SCI+PDTC 組 SCI 大鼠持續應用 NF-κB 抑制劑 PDTC 3 周后，NF-κB、GFAP 蛋白表達及 CSPG IA 值均較 SCI 組亦明顯下調，表明 PDTC 下調 NF-κB 表達，并抑制了膠質瘢痕的形成，說明膠質瘢痕形成與 NF-κB 通路有關。據此推測 GL 可能通過抑制 HMGB1/NF-κB 途徑來減少膠質瘢痕的形成，而 GL 減少膠質瘢痕作用較 PDTC 更顯著，可能是 GL 可同時通過其他途徑發揮膠質瘢痕形成抑制作用，后續將進一步探討。
綜上述，應用 GL 抑制 HMGB1 可抑制大鼠 SCI 后脊髓膠質瘢痕的形成，促進大鼠后肢運動功能的恢復。而 GL 可能通過抑制 HMGB1/NF-κB 途徑發揮膠質瘢痕抑制作用。
作者貢獻：賀亞軍負責文章撰寫、實驗設計及實施、數據收集；李季聲、王志強負責實驗設計及實施、數據收集；張楠指導數據統計分析；孫麟、馮皓宇指導實驗并對文章內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究及文章撰寫中不存在相關利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點及對實驗數據客觀結果的統計分析及報道。
機構倫理問題：研究方案經山西醫科大學實驗動物福利倫理委員會批準（2018012013），實驗動物使用許可證號：SYXK（晉）2019-0008。實驗過程中動物處置均符合 2006 年科學技術部發布的《實驗動物保健與使用指導意見》要求。
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后組織中大量反應性星形膠質細胞肥大、增生，膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）等中間絲蛋白高表達[1]，大量硫酸軟骨素蛋白聚糖（chondroitin sulfate proteoglycan，CSPG）分泌至細胞外基質中[2]。而 GFAP 與 CSPG 是膠質瘢痕的重要組成成分，SCI 后 2 周即開始形成膠質瘢痕，構成物理屏障與化學屏障，抑制軸突再生[3]。
高遷移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種促炎因子， SCI 后 HMGB1 表達上調，在促炎癥反應中起著關鍵作用，而炎癥反應與 SCI 后膠質瘢痕的形成密切相關[4]。有文獻報道，抗 HMGB1 治療可促進繼發性 SCI 后脊髓功能的恢復[5]。甘草甜素（glycyrrhizin，GL）是一種 HMGB1 抑制劑，在腦損傷及 SCI 早期發揮一定保護作用[6]。本課題組前期研究表明，GL 可緩解 SCI 后急性期脊髓水腫[7]。但目前有關其對 SCI 后膠質瘢痕形成的影響罕見報道。另外，有研究發現 GL 能通過 HMGB1/NF-κB 途徑抑制星形膠質細胞凋亡，發揮細胞保護作用[8]，其是否也通過該途徑影響膠質瘢痕形成尚缺乏有效論證。為此，本次研究旨在探討 GL 抑制 HMGB1 對 SCI 后膠質瘢痕形成的影響，并通過應用 NF-κB 抑制劑 1-吡咯烷二硫代羧酸銨鹽（pynolidine dithiocarbamate，PDTC）[9]分析其作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8～10 周齡 SPF 級雌性 SD 大鼠 72 只，體質量 220～250 g，由北京海淀區實驗動物飼養場及山西醫科大學動物中心提供，飼養于山西醫科大學生理動物實驗室。飼養條件：室溫 25℃、濕度 40%～50%、循環照明 12 h。
GL（純度>95%；上海伊卡生物技術有限公司）；PDTC、抗 CSPG 抗體（Sigma 公司，德國）；GAPDH 抗體（Bioworld 公司，美國）；抗 HMGB1 抗體 [艾博抗（上海）貿易有限公司]；抗 GFAP 抗體（CST 公司，美國）；抗 Histone 抗體（上海碧云天生物技術有限公司）；HE 試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗、BCA 蛋白質分析試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。凝膠成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）；Image pro-plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）；Image J 1.52v 軟件（美國國立衛生研究院）。
1.2 實驗分組及方法
取 72 只 SD 大鼠隨機分為 4 組，分別為假手術組（n=12）、SCI 模型組（SCI 組，n=36）、GL 干預組（SCI+GL 組，n=12）以及 PDTC 干預組（SCI+PDTC 組，n=12）。
大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，俯臥位固定，剃除背部毛發，聚維酮碘消毒皮膚。定位 T10 節段，作背部正中切口長 3～4 cm，逐層切開后行椎板切除術，暴露脊髓。其中，假手術組僅切除椎板，不損傷脊髓。其余 3 組應用改良 Allen’ s 重物墜落實驗制備 SCI 模型[5, 10]，撞擊桿質量為 10 g，墜落高度 25 mm；撞擊后大鼠脊髓表面立即充血、出現收縮下肢及擺尾反射，提示 SCI 模型制備成功。SCI 模型制備后大鼠連續皮下注射青霉素鈉（8 萬 U/只）3 d，按摩膀胱輔助排尿，每天 2 次，直至排尿反射恢復。
SCI 模型制備后，SCI+GL 組及 SCI+PDTC 組大鼠分別腹腔注射 GL（100 mg/kg）[11]以及 PDTC（100 mg/kg）[12]，每天 1 次，持續 3 周。SCI 組于術后 1、2、3 周各取 12 只大鼠，假手術組、SCI+GL 組及 SCI+PDTC 組于術后 3 周取 12 只大鼠進行觀測。其中 6 只行 Western blot 檢測，6 只行組織學及免疫組織化學染色觀察。
1.3 SCI 后膠質瘢痕形成相關觀測
1.3.1 行為學觀測
術后 1、2、3 周取假手術組及 SCI 組大鼠（n=6），采用BBB 評分[13]和斜坡實驗[14]評價大鼠后肢運動功能。BBB 評分記錄 2 次有效評分，取均值；斜坡實驗時獲取 5 次有效角度，取均值。
1.3.2 Western blot 檢測
取術后 3 周假手術組以及術后 1、2、3 周 SCI 組大鼠（n=6），同上法麻醉后，自心尖灌注生理鹽水，直至右心耳流出清亮液體；按照原手術切口入路，以損傷節段為中心切取長 10 mm 的脊髓組織。提取蛋白上清后，使用 BCA 蛋白質分析試劑盒測定蛋白質濃度。上樣電泳后轉移至聚偏二氟乙烯膜，置于 5% 脫脂牛奶中阻斷封閉膜 2 h 后，分別添加一抗 4℃ 孵育過夜，包括抗 HMGB1 抗體（1∶1 000）、抗 GFAP 抗體（1∶1 000），以 GAPDH 作為內參。TBST 洗膜后用相應二抗孵育 2 h，ECL 顯影技術觀察條帶，使用 Image J 1.52v 軟件計算 HMGB1 及 GFAP 蛋白相對表達量。
根據 SCI 組行為學及 Western blot 檢測結果，選擇 BBB 評分、斜坡角度以及 HMGB1 蛋白表達明顯增高，且 GFAP 蛋白表達最明顯的時間點標本，進行 GL 對大鼠 SCI 后膠質瘢痕形成作用的實驗。
1.4 GL 對大鼠 SCI 后膠質瘢痕形成的作用及機制
1.4.1 行為學觀測
術后 1、2、3 周取 SCI+GL 組大鼠（n=6），參照 1.3.1 方法行后肢 BBB 評分及斜坡實驗，并與同時間點 SCI 組及假手術組觀測結果進行比較。
1.4.2 組織學觀察
取術后 3 周假手術組、SCI 組及 SCI+GL 組大鼠（n=6），同上法麻醉后，自心尖灌注生理鹽水及 4% 多聚甲醛固定 30 min。以原手術切口入路，以損傷水平為中心切取長 10 mm 的脊髓組織，置于 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，脫水、石蠟包埋、切片，片厚 4 μm。取部分切片常規 HE 染色后，光鏡下觀察脊髓組織結構、炎癥細胞浸潤、囊腔及膠質瘢痕形成等情況。
1.4.3 Western blot 檢測
取術后 3 周假手術組、SCI 組、SCI+GL 組、SCI+PDTC 組大鼠（n=6），參照 1.3.2 中方法檢測 HMGB1、GFAP、NF-κB 蛋白相對表達量，其中 SCI+PDTC 組僅檢測 GFAP、NF-κB 蛋白。
1.4.4 免疫組織化學染色觀察
取 1.4.2 制備的各組部分脊髓組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，EDTA 稀釋液進行抗原修復。置于 5% 牛血清白蛋白中，37℃ 封閉 30 min、4℃一抗 [抗 GFAP 抗體（1∶100）、抗 CSPG 抗體（1∶100）] 孵育過夜；PBS 沖洗 3 次，37℃ 二抗孵育 30 min。PBS 沖洗，DAB 顯色試劑顯色 90 s。蒸餾水沖洗后 37℃ 下蘇木素染色 20 s，脫水、封片。光鏡下觀察并采集圖片，用 Image pro-plus 6.0 軟件測定 GFAP、CSPG 蛋白積分吸光度（IA）值，計算 GFAP 陽性細胞率（GFAP 陽性細胞數/視野細胞數）。其中，SCI+PDTC 組僅進行 CSPG 免疫組織化學染色檢測。
1.5 統計學方法
采用 SPSS22.0 及 GraphPad Prism7.04 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 SCI 后膠質瘢痕形成相關觀測
2.1.1 行為學觀測
術后 SCI 組大鼠后肢 BBB 評分及斜坡角度隨時間延長而逐漸增大，但各時間點均明顯低于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
圖1
大鼠行為學觀測
a. BBB 評分；b. 斜坡實驗
Figure1. Behavioral test of ratsa. BBB score; b. Slope test
2.1.2 Western blot 檢測
SCI 組術后 1、2、3 周 HMGB1 及 GFAP 蛋白相對表達量均明顯高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）。隨時間延長，SCI 組 HMGB1 蛋白相對表達量逐漸降低，其中術后 1 周與 2、3 周時差異有統計學意義（P<0.05），2、3 周間差異無統計學意義（P>0.05）；而 GFAP 蛋白相對表達量逐漸增高，術后各時間點間差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2、3。
圖2
Western blot 檢測 HMGB1 蛋白表達
1：假手術組2：SCI 組 1 周 3：SCI 組 2 周 4：SCI 組 3 周 5：SCI+GL 組 3 周 a. 電泳圖；b. HMGB1 蛋白相對表達量
Figure2. The expression of HMGB1 protein detected by Western blot1: Sham group 2: SCI group for 1 week 3: SCI group for2 weeks 4: SCI group for 3 weeks 5: SCI+GL group for 3 weeksa. Electrophoregram; b. Relative expression of HMGB1 protein
圖3
Western blot 檢測 GFAP 蛋白表達
1：假手術組 2：SCI 組 1 周 3：SCI 組 2 周 4：SCI 組 3 周 5：SCI+PDTC 組 3 周 6：SCI+GL 組 3 周 a. 電泳圖；b. GFAP 蛋白相對表達量
Figure3. The expression of GFAP protein detected by Western blot 1: Sham group 2: SCI group for 1 week 3: SCI group for 2 weeks 4: SCI group for 3 weeks 5: SCI+PDTC group for 3 weeks 6: SCI+GL group for 3 weeks a. Electrophoregram; b. Relative expression of GFAP protein根據行為學及 Western blot 檢測結果，選擇 SCI 組術后 3 周脊髓組織行后續實驗。
2.2 GL 對大鼠 SCI 后膠質瘢痕形成的作用及機制
2.2.1 行為學觀測
術后隨時間延長，SCI+GL 組大鼠后肢運動功能逐漸恢復。除術后 2 周 SCI+GL 組與 SCI 組 BBB 評分差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各時間點 SCI+GL 組 BBB 評分及斜坡角度均明顯低于假手術組、高于 SCI 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
2.2.2 組織學觀察
術后 3 周，假手術組脊髓組織結構完整、致密整齊，細胞結構完整，核大且圓，核仁清晰。SCI 組脊髓組織結構紊亂，大量活化星形膠質細胞肥大、增殖，可見大量炎癥細胞、囊腔及膠質瘢痕形成。SCI+GL 組脊髓損傷區域結構紊亂較 SCI 組改善，炎癥細胞浸潤減少，囊腔及膠質瘢痕形成區域減小，膠質瘢痕形成有所減少。見圖 4。
圖4
術后 3 周 HE 染色觀察（×400）
a. 假手術組；b. SCI 組；c. SCI+GL 組
Figure4. HE staining observation at 3 weeks after operation (× 400)a. Sham group; b. SCI group; c. SCI+GL group
2.2.3 Western blot 檢測
術后 3 周，SCI+GL 組 HMGB1 蛋白相對表達量較 SCI 組明顯下調，但仍高于假手術組，差異均有統計學意義（P<0.05）。SCI+GL 組及 SCI+PDTC 組 GFAP、NF-κB 蛋白相對表達量均較 SCI 組明顯下調，但仍高于假手術組，差異均有統計學意義（P<0.05）；與 SCI+GL 組比較，SCI+PDTC 組 NF-κB 蛋白相對表達量明顯降低、GFAP 蛋白相對表達量升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2、3、5。
圖5
各組術后 3 周 Western blot 檢測 NF-κB 蛋白表達
1：假手術組 2：SCI 組 3：SCI+PDTC 組 4：SCI+GL 組 a. 電泳圖；b. NF-κB 蛋白相對表達量
Figure5. The expression of NF-κB protein in each group at 3 weeks after operation detected by Western blot1: Sham group 2: SCI group 3: SCI+PDTC group 4: SCI+GL group a. Electrophoregram; b. Relative expression of NF-κB protein
2.2.4 免疫組織化學染色觀察
術后 3 周，SCI 組中 GFAP 顯著高表達，GFAP 表達陽性的星形膠質細胞肥大、增殖，組織結構紊亂，有腔隙、囊腔形成；SCI+GL 組中 GFAP 表達陽性的星形膠質細胞肥大、增殖情況較 SCI 組明顯改善，腔隙幾乎不可見。定量分析顯示，假手術組、SCI 組、SCI+GL 組 GFAP 蛋白 IA 值分別為0.50±0.10、1.03±0.21、0.74±0.19，陽性細胞率分別為0.42±0.10、3.75±0.76、0.90±0.17；SCI+GL 組 GFAP IA 值以及陽性細胞率明顯低于 SCI 組，但仍高于假手術組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
圖6
術后 3 周 GFAP 免疫組織化學染色觀察（×400）
a. 假手術組； b. SCI 組； c. SCI+GL 組
Figure6. The immunohistochemical staining of GFAP expression at 3 weeks after operation (×400)a. Sham group; b. SCI group; c. SCI+GL group
術后 3 周，SCI 組細胞外基質中 CSPG 表達顯著增多，且呈現越接近損傷部位 CSPG 表達越強的趨勢，有較大面積的腔隙、囊腔形成，損傷區域組織結構紊亂。與 SCI 組相比，SCI+GL 組以及 SCI+PDTC 組囊腔、腔隙略減小。定量分析顯示，假手術組、SCI 組、SCI+GL 組、SCI+PDTC 組 CSPG 蛋白 IA 值分別為 0.41±0.10、0.93±0.23、0.62±0.10、0.72±0.09；SCI+GL 組、SCI+PDTC 組 CSPG IA 值明顯低于 SCI 組。SCI+GL 組低于 SCI+PDTC 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。而且上述 3 組均顯著高于假手術組，差異亦有統計學意義（P<0.05）。見圖 7。
圖7
術后 3 周 CSPG 免疫組織化學染色觀察（×400）
a. 假手術組； b. SCI 組； c. SCI+PDTC 組； d. SCI+GL 組
Figure7. Immunohistochemical staining of CSPG protein at 3 weeks after operation (×400)a. Sham group; b. SCI group; c. SCI+PDTC group; d. SCI+GL group
3 討論
中樞神經系統損傷后會產生大量 HMGB1 并擴散至細胞外，發揮強大的促炎活性[15]。研究發現，人急性 SCI 后血漿及脊髓中 HMGB1 水平顯著升高[7, 16]，而 HMGB1 水平升高與神經系統不良結局緊密相關[17]。HMGB1 可持續發揮晚期促炎因子作用[18]，使星形膠質細胞持續活化、增殖[8, 19]，GFAP 高表達，CSPG 亦在損傷后 1 d 內迅速分泌并持續數月[20]，二者共同形成膠質瘢痕。而陳舊性膠質瘢痕中 CSPG 對軸突生長具有極強抑制作用[3, 21]，抑制脊髓神經功能的恢復。本研究結果顯示，SCI 組 HMGB1 蛋白表達隨時間延長逐漸降低，但仍高于假手術組；3 周時 GFAP 及 CSPG 蛋白表達在各組中最高，星形膠質細胞活化增殖最明顯，提示脊髓組織中 GFAP、CSPG 蛋白過度表達會導致大量膠質瘢痕形成，組織學染色觀察結果與之對應，且 CSPG 在損傷中心區域表達更高，可能系損傷中心區域炎癥介質作用更強所致。行為學觀測表明 SCI 后大鼠后肢運動功能隨時間延長有所恢復，但評分均較低。上述結果表明 HMGB1 可促進大鼠 SCI 后膠質瘢痕的形成，阻礙了脊髓功能恢復。
目前已有研究發現抗 HMGB1 治療可改善 SCI 后缺血再灌注損傷[22]與出血[23]，應用 GL 抑制 HMGB1 的表達可減輕腦卒中[24]、蛛網膜下腔出血[25]以及 SCI 后脊髓水腫[10-11]，促進脊髓功能恢復。本研究結果顯示，SCI+GL 組 SCI 大鼠應用 GL 3 周后，HMGB1 表達明顯下調，GFAP 蛋白表達、陽性細胞率及 IA 值以及 CSPG 蛋白 IA 值均較 SCI 組明顯降低，表明 GL 明顯抑制了星形膠質細胞的活化增殖，下調了膠質瘢痕中 GFAP 及 CSPG 的表達，使膠質瘢痕形成減少，組織學觀察亦提示 GL 改善了脊髓結構紊亂情況，囊腔、膠質瘢痕形成減少；行為學觀測表明 GL 促進了大鼠后肢運動功能的恢復。
SCI 后脊髓組織中炎癥因子 TNF-α、IL-4、Toll 樣受體等大量釋放并激活 NF-κB 途徑，從而進一步激活炎癥反應過程[26]。細胞內 HMGB1 可通過激活細胞質內 NF-κB 的核轉位，進一步促進炎癥因子的釋放，加重細胞、組織損傷[27]。而 HMGB1 抑制劑可通過抑制 HMGB1/NF-κB 途徑改善 SCI 急性期脊髓水腫、星形膠質細胞凋亡[7-8]。為此，本研究探討了 GL 是否通過 HMGB1/NF-κB 途徑抑制膠質瘢痕形成。結果顯示 SCI+GL 組 NF-κB、GFAP 蛋白表達及 CSPG IA 值均較 SCI 組顯著下調，膠質瘢痕形成得到了抑制，說明膠質瘢痕的形成與 HMGB1 及 NF-κB 相關。而 SCI+PDTC 組 SCI 大鼠持續應用 NF-κB 抑制劑 PDTC 3 周后，NF-κB、GFAP 蛋白表達及 CSPG IA 值均較 SCI 組亦明顯下調，表明 PDTC 下調 NF-κB 表達，并抑制了膠質瘢痕的形成，說明膠質瘢痕形成與 NF-κB 通路有關。據此推測 GL 可能通過抑制 HMGB1/NF-κB 途徑來減少膠質瘢痕的形成，而 GL 減少膠質瘢痕作用較 PDTC 更顯著，可能是 GL 可同時通過其他途徑發揮膠質瘢痕形成抑制作用，后續將進一步探討。
綜上述，應用 GL 抑制 HMGB1 可抑制大鼠 SCI 后脊髓膠質瘢痕的形成，促進大鼠后肢運動功能的恢復。而 GL 可能通過抑制 HMGB1/NF-κB 途徑發揮膠質瘢痕抑制作用。
作者貢獻：賀亞軍負責文章撰寫、實驗設計及實施、數據收集；李季聲、王志強負責實驗設計及實施、數據收集；張楠指導數據統計分析；孫麟、馮皓宇指導實驗并對文章內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究及文章撰寫中不存在相關利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點及對實驗數據客觀結果的統計分析及報道。
機構倫理問題：研究方案經山西醫科大學實驗動物福利倫理委員會批準（2018012013），實驗動物使用許可證號：SYXK（晉）2019-0008。實驗過程中動物處置均符合 2006 年科學技術部發布的《實驗動物保健與使用指導意見》要求。
