引用本文： 劉鵬程, 譚秋雯, 張憶, 王紅, 呂青. 豬脂肪源基質水凝膠輔助游離脂肪移植的應用初探. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(10): 1322-1331. doi: 10.7507/1002-1892.202002126 復制
脂肪移植因填充物來源廣泛，兼具軟組織填充與形態再塑造的效果，是整形外科常用技術之一[1-3]。然而，移植脂肪吸收程度的不可預測性和不可控性是目前亟需解決的問題[4]。相關文獻報道游離脂肪移植存活率為 10%～85%，移植脂肪存活率是影響游離脂肪移植術后效果最重要的因素之一[5-8]。成熟脂肪細胞的物理損傷或組織/血管再生不足，是導致移植脂肪存活率較低的主要原因[9-10]。
組織工程通過構建適宜的微環境促進組織再生。大量研究顯示，來自不同組織的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）可以為組織再生提供不同的微環境[11]，而來源于脂肪組織的脫細胞基質材料在構建成脂誘導微環境上具有優勢[12-16]。在前期研究中，我們制備了豬脂肪源基質水凝膠（hydrogel from acellular porcine adipose tissue，HAPA），并描述了其對脂肪來源干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）的成脂誘導作用及體內、外環境下對血管新生的積極影響[12, 17]。同時，HAPA 為具有溫敏特性的水凝膠材料，以富含水的水凝膠材料為載體，可能減少移植脂肪組織的物理損傷，促進氧氣及營養物質交換，從而提高移植脂肪存活率[18-21]。然而，單純生物源性水凝膠降解速度較快[22]，在較短時間內即可引起較明顯的體積保留率（移植物移植一段時間后殘余體積占原體積的比率，是衡量脂肪移植臨床療效的一個極其重要的指標）變化。因此，在利用生物源性水凝膠輔助脂肪移植時，是否應當考慮單純水凝膠降解對總體體積保留率產生的影響，復合體系中凝膠比例變化導致的移植脂肪組織存活率變化是否最終會引起總體體積保留率（復合移植物移植一段時間后殘余凝膠和脂肪組織體積總和占原體積的比率）的動態變化，均值得進一步研究。
因此，本研究中我們將通過游離脂肪體外培養模型及游離脂肪-HAPA 復合物皮下移植模型，重點探討 HAPA/脂肪體積比對游離脂肪移植存活及體積保留率的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6 周齡 SPF 級雄性裸鼠 42 只，體質量 15～18 g，由南京大學模式動物研究所提供。FBS、L-DMEM 培養基、F12 培養基（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ 型膠原酶、胃蛋白酶（Sigma 公司，美國）；圍脂肪蛋白抗體（Abcam 公司，美國）；DeadEndTM TUNEL 熒光法檢測系統（Promega 公司，美國）；熒光二抗（Jeckson 公司，美國）。全自動正置熒光顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；Philips iU22 型彩色多普勒超聲診斷儀（Philips 公司，荷蘭）。
1.2 HAPA 和游離脂肪顆粒的制備
游離脂肪顆粒制備：從早期乳腺癌患者手術切除的乳腺標本中切取遠離腫瘤的脂肪組織，置于 PBS 緩沖液中，冰浴中 2 h 內送至實驗室。PBS 緩沖液反復沖洗脂肪組織，用眼科鑷剔取脂肪小葉并反復沖洗，用眼科剪剪至勻漿狀，移入 50 mL 離心管中，以 500×g 離心 5 min。用滴管吸出上層油脂，取中間層脂肪，即為游離脂肪顆粒，移入 50 mL 離心管中，冰浴保存，備用。
1.3 HAPA 對游離脂肪組織凋亡及存活影響的體外實驗
將游離脂肪顆粒與 3%HAPA 等體積混合均勻，取 100 μL 接種于 24 孔板內，37℃、5%CO2 孵箱孵育 15～20 min 使 HAPA 成膠，作為實驗組；另取單純脂肪 100 μL 接種于 24 孔板內作為對照組，每組每個時間點 3 個樣本。加入 200 μL 完全培養基（含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基），分別置于 37℃ 常氧（5%CO2）及低氧（1%O2、5%CO2 及 94%N2）孵箱內培養。24 h 及 72 h 后用顯微鑷將脂肪及 HAPA-脂肪復合物從孔板內夾出，4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 厚切片。取一部分切片行 TUNEL 染色，檢測移植脂肪中細胞凋亡情況，于全自動正置熒光顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取 3 個視野（×200），計算單位視野下細胞凋亡率（凋亡細胞占總體細胞比例）。另取一部分切片行圍脂肪蛋白免疫熒光染色，檢測移植脂肪中細胞存活及新生情況。
1.4 HAPA 輔助游離脂肪移植體內實驗
1.4.1 實驗分組及方法
將 HAPA 及游離脂肪顆粒，按照不同體積配比充分混勻，獲得不同體積比的 HAPA-脂肪復合物（表 1）。將 42 只裸鼠隨機分為 6 組（n=7），分別于各組裸鼠背部皮下移植脂肪或 HAPA-脂肪復合物 1 mL。移植后 4 周斷頸處死各組裸鼠后剪開背部皮膚，取出移植脂肪組織，進行以下觀測。見圖 1。
表1
實驗分組及不同體積比 HAPA-脂肪復合物
Table1.
Experimental grouping and different volume ratios of HAPA/adipose tissue complex
圖1
實驗材料及實驗動物模型
a. HAPA；b. 游離脂肪組織；c. 不同體積比的 HAPA-脂肪復合物 從左至右依次為 50%HAPA、40%HAPA、30%HAPA、20%HAPA、10%HAPA；d. 裸鼠背部皮下注射 HAPA-脂肪復合物；e. 術后 4 周取材
Figure1. Experimental materials and animal modelsa. HAPA; b. Adipose tissue; c. HAPA-adipose tissue complex with different volume ratioFrom left to right for 50%HAPA, 40%HAPA, 30%HAPA, 20%HAPA, and 10%HAPA; d. Subcutaneous injection of HAPA-adipose tissue complex into the back of nude mice; e. The grafts harvested after 4 weeks
1.4.2 大體觀察及超聲觀察
① 大體觀察：術后 4 周觀察大鼠生存狀態及注射區炎癥發生情況，采用排水法檢測各組移植物體積大小，并計算體積保留率：移植物殘余體積/原體積×100%。為初步了解 HAPA 對移植物體積維持的作用，以 A 組作為對照，觀察 HAPA-脂肪體積比的動態變化對移植物體積保留率的影響。② 超聲觀察：采用 Philips iU22 型彩色多普勒超聲診斷儀，L12-5 線陣探頭，頻率 5～12 MHz。將裸鼠以 2% 水合氯醛腹腔注射（0.1 mL/10 g）麻醉后平放于操作臺，先進行 B-Mode 超聲檢查，將儀器的增益、焦距、深度等各項參數調節至最佳位置，以獲得最優分辨率的超聲圖像。進行多切面掃查，觀察移植物內部形態及有無明顯液化壞死，記錄并比較移植物內液化壞死區數量及體積。
1.4.3 組織學觀察
術后 4 周各組標本常規固定、包埋及切片后，行以下組織學觀察。①HE 染色：常規 HE 染色觀察，并行半定量評價移植物的結構完整性、囊泡形成及纖維化程度。每個標本連續切片后間隔 10 張取 1 張切片（組織間隔約 50 μm），每張切片于 400 倍鏡下隨機取 3 個視野拍照。參照文獻［23］方法按 0～5 分標準行半定量評分：0 分，無或不存在；1 分，極少存在；2 分，最少至中度存在；3 分，中度存在；4 分，中度至廣泛存在；5 分，廣泛存在。以每組切片隨機視野的評分平均值作為該組樣本的評分結果。② CD31 免疫組織化學染色：各組任取 4 個樣本，切片行 CD31 免疫組織化學染色，每張切片于 200 倍鏡下隨機取 3 個視野拍照，對視野內新生血管數量進行統計。③ 圍脂肪蛋白免疫組織化學染色：同 1.3 方法進行觀察。所有評估均由 2 名作者獨立進行盲法評估。
1.5 統計學方法
采用 SPSS25.0 統計軟件進行分析。正態分布資料以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；非正態分布資料以中位數（四分位數間距）表示，組間比較采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HAPA 對游離脂肪組織凋亡及存活影響的體外實驗
TUNEL 染色示，常氧條件下培養 24 h，實驗組和對照組均可觀察到細胞凋亡，兩組脂肪細胞凋亡率比較差異無統計學意義（t=?0.325，P=0.159）。低氧條件下培養 24 h，對照組脂肪細胞凋亡率較常氧條件時有明顯增加趨勢，但差異無統計學意義（t=?2.706，P=0.240）；實驗組脂肪細胞凋亡率較常氧條件時有所增加，但差異無統計學意義（t=–3.133，P=0.979），較低氧條件下的對照組明顯降低（t=1.409，P=0.002）。見圖 2、表 2。
圖2
TUNEL 免疫熒光染色觀察兩組常氧和低氧條件下培養 24 h 脂肪細胞凋亡情況（熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為對照組和實驗組，箭頭示凋亡細胞 a. 常氧；b. 低氧
Figure2. TUNEL immunofluorescence staining to observe the apoptosis of adipocytes after cultured under normoxic and hypoxic conditions for 24 hours (Fluorescence microscope×200)From left to right for control group and experimental groupa. Normoxia; b. Hypoxia
表2
TUNEL 染色檢測兩組常氧和低氧條件下脂肪細胞凋亡率（n=3，
，%）
Table2.
TUNEL staining to detect apoptosis rate of adipocytes under normoxia and hypoxic conditions (n=3, 
, %)
圍脂肪蛋白免疫熒光染色示，隨著時間推移，各組脂肪細胞逐漸液化壞死。低氧培養 24 h 后，對照組脂肪細胞液化壞死趨勢較實驗組更明顯；72 h 后該趨勢愈發明顯。見圖 3。
圖3
圍脂肪蛋白染色觀察常氧和低氧條件下培養 24、72 h 脂肪細胞存活情況（熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為對照組和實驗組a. 常氧 24 h；b. 低氧 24 h；c. 常氧 72 h；d. 低氧 72 h
Figure3. Perilipin immunofluorescence staining to observe the survival of adipocytes after cultured under normoxic and hypoxic conditions for 24 and 72 hours (Fluorescence microscope×200)From left to right for control group and experimental group a. Normoxia for 24 hours; b. Hypoxia for 24 hours; c. Normoxia for 72 hours; d. Hypoxia for 72 hours
2.2 HAPA 輔助游離脂肪移植體內實驗
2.2.1 大體觀察
術后 4 周各組小鼠多數生存狀態可，注射區域未見皮膚紅腫、皮下積液及炎癥發生；移植物包膜完整，與周圍組織未見明顯粘連。A 組移植物表面未見明顯新生血管形成，而各 HAPA-脂肪復合物組移植物表面均可見明顯新生血管形成。見圖 4。
圖4
術后 4 周移植物大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure4. Gross observation of the grafts at 4 weeks post-transplantationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
術后 4 周各組移植物體積均較注射時縮小，A～F 組移植物體積保留率分別為87%±3%、87%±5%、85%±10%、81%±5%、76%±9% 和 69%±6%，E、F 組移植物體積保留率顯著低于 A～D 組，差異有統計學意義（P<0.05）；E、F 組間和 A～D 組間差異均無統計學意義（P>0.05）。進一步分析發現，隨著初始 HAPA 添加體積的增加，獲得移植物的體積有逐漸降低的趨勢。見圖 5。
圖5
各組 HAPA-脂肪復合物中兩者的體積占比及術后 4 周移植物體積保留率變化模式圖
每組左側為術前，右側為術后 4 周
Figure5. Change pattern diagram of volume ratio and volume contribution ratio in different HAPA-adipose tissue complexesThe data of left and right sides in each group were preoperation and 4 weeks after operation, respectively2.2.2 超聲觀察
術后 4 周各組多數移植物內可見液化灶，大小不一。其中 A 組均可見液化灶，B～E 組有 2 只、F 組有 3 只小鼠移植物內未見液化灶。見圖 6。A～F 組液化灶體積分別為0.45（0.15，0.90）、0.02（0.02，0.10）、0.03（0.01，0.05）、0.02（0.01，0.05）、0.01（0.01，0.16）和 0.02 mL，隨著 HAPA 體積比提高，移植物內液化灶有逐漸縮小的趨勢，但各組間差異無統計學意義（H=3.010，P=0.698）。
圖6
術后 4 周各組大鼠移植物超聲檢查
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure6. Ultrasound examination of the grafts at 4 weeks post-transplantationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
2.2.3 HE 染色
B～F 組復合 HAPA 的移植物內可見未完全降解的 HAPA，HAPA 與移植脂肪組織融合較好，各組移植物內均無明顯纖維分隔形成。A～F 組移植物內均未見明顯炎癥細胞浸潤。見圖 7。
圖7
術后 4 周各組移植物 HE 染色（×100）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure7. HE staining of the grafts at 4 weeks post-transplantation (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
半定量分析結果顯示，隨著移植物中 HAPA 體積比的提高，移植物內部的結構完整性逐漸提高，液化壞死形成的囊泡區逐漸減少，纖維化程度逐漸降低。其中結構完整性方面，B～F 組顯著高于 A 組，E、F 組高于 B、C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；囊泡形成方面，D、E、F 組顯著少于 A 組，F 組少于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；纖維化程度方面，E、F 組顯著少于 A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 8。
圖8
術后 4 周各組移植物結構完整性、囊泡形成、纖維化程度 半定量分析結果
Figure8.
Semi-quantitative analysis results of each graft’s integrity, vacuoles formation, and fibrosis at 4 weeks post-transplantation
2.2.4 CD31 免疫組織化學染色
術后 4 周，隨著 HAPA 體積比增加，單位視野內新生血管數量逐漸增加。見圖 9。A～F 組新生血管數量分別為（8.08±2.90）、（15.25±5.39）、（20.92±8.86）、（24.92±9.28）、（35.00 ±6.43）和（34.33±7.18）個/視野，E、F 組顯著多于 A～D 組，B～D 組顯著高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖9
術后 4 周各組移植物 CD31 免疫組織化學染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure9. CD31 immunohistochemistry staining of the grafts at 4 weeks post-transplantation (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
2.2.5 圍脂肪蛋白免疫熒光染色觀察
B～F 組中活脂肪細胞明顯多于 A 組；隨著 HAPA 體積比的增加，活脂肪細胞逐漸增加，且視野內可見較多新生脂肪細胞。見圖 10。
圖10
術后 4 周各組移植物圍脂肪蛋白免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure10. Perilipin immunofluorescence staining of the grafts at 4 weeks post-transplantation (Fluorescence microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
3 討論
近年來，由天然 ECM 衍生而來的水凝膠因具有可注射性及與不規則缺損部位良好契合，可達到適形填充修復等特點，而成為常用的軟組織填充材料[24-25]。游離脂肪組織因來源廣泛、可微創獲取及植入，亦為常用的軟組織填充材料。從臨床角度看，水凝膠材料輔助游離脂肪移植具有極大意義[26]。理想的生物材料可為組織再生創造營養豐富的微環境，通過提供保護性結構基質來提高移植脂肪的存活。當生物材料與脂肪組織共同移植，生物材料扮演臨時支架材料作用，植入體內后隨著時間推移而逐漸降解為無毒的有機代謝物[12, 15]，最終完全被新生脂肪組織取代[4, 12, 27]。因此，復合脂肪移植的生物材料一方面可以通過提高移植脂肪存活率，使移植脂肪達到較好的體積保留率；另一方面，移植材料的原位促脂肪新生效應可進一步提升脂肪材料復合物的總體體積保留率。此外，這些生物材料一定程度上能緩解自體脂肪容量不足的問題[28]。
多種生物源水凝膠可用于脂肪移植。研究發現，脂肪組織來源的 ECM 材料可為脂肪新生提供獨特的微環境[13-15, 17]。本研究使用的 HAPA 來源于豬脂肪組織的無細胞基質材料，是一種可注射的溫敏水凝膠材料，已被證實可誘導原位脂肪新生，在輔助脂肪移植方面可能具有獨特優勢[12, 17]。盡管前期已有學者對水凝膠復合脂肪移植進行展望[26]，然而迄今為止并無相關研究實施，我們率先采用了 HAPA 水凝膠復合脂肪移植進行探索研究。
改善組織移植后早期低氧微環境可以提高移植組織存活率。目前研究報道的主要措施包括促進早期血管生成[29-33]、增強局部組織攜氧能力[24, 34]及提高移植組織局部氧含量[35-37]。凝膠類材料提供的富水微環境可以給移植脂肪提供更多養分，有利于改善組織移植后的低氧環境，增強組織對體內低氧環境的耐受性[19, 38]。本研究中，隨著復合 HAPA 體積比的增加，移植脂肪出現液化壞死區的可能性及液化壞死區體積有逐漸減少趨勢，組織學結果亦提示 HAPA 能促進移植脂肪重塑，減少液化及纖維化形成。
植入體內的水凝膠主要有 3 種代謝方式，即水解、酶解和溶解[39]。理想情況下，水凝膠降解速率應與組織新生速率相同，為新 ECM 的沉積創造空間，同時在此過程中保持組織穩定性[40]。生物材料降解的產物需要無毒、低免疫原性、不激活免疫反應。天然支架材料的降解產物比合成生物材料的毒性更小，引發的最小免疫反應更小[41]。然而，天然生物材料的降解速度較快[42]。另一方面，水凝膠網狀多孔的疏松結構使其能容納更多水分[40]，進入人體后易被吸收導致體積變小。這些因素均導致天然水凝膠材料在作為組織填充材料時，體積保留率低。本研究中，術后 4 周取材時 10%HAPA 組、20%HAPA 組及 30%HAPA 組與單純脂肪組體積保留率并無明顯差異，而 40%HAPA 組和 50%HAPA 組則具有更低的體積保留率。提示在 40%HAPA 組和 50%HAPA 組，即使復合物體系中 HAPA 比例提高促進了移植脂肪存活，但由于 HAPA 降解快、體積保留率低，不能抵消體系中 HAPA 體積的縮減，從而導致總體體積保留率明顯降低。然而 HAPA/脂肪體積比對移植脂肪總體體積保留率的影響，還需要更長期及更大樣本量的實驗來證實。
探討適宜的 HAPA/脂肪體積比是后期開展深入的基礎研究及臨床研究的基礎。然而，由于具有誘導原位脂肪新生作用，HAPA 與脂肪組織復合后，在組織學層面無法與脂肪組織分開，難以直接量化 HAPA 對提高移植脂肪體積保留率的提升作用。本研究以單純脂肪移植組作為參照，動態觀察隨著移植物中 HAPA 體積比提高，移植物體積保留率的變化情況，發現隨著 HAPA 體積比增加，HAPA 對移植物體積保留率的貢獻逐漸降低，綜合考慮移植物體積維持及所需脂肪組織的體積，30%HAPA 輔助的游離脂肪移植可能是較合適的體積比。然而，該模型通過等比例體積縮放評估兩種組分對移植物體積保留的貢獻，忽略了兩種組分之間的相互作用，較簡單粗糙，后續研究需要開發更準確的模型，評估計算生物材料輔助游離脂肪移植的最佳體積比。
本研究中，通過改變 HAPA/脂肪體積比，一定程度上兼顧了移植脂肪存活程度及移植脂肪體積保留率。結果發現在提高移植物復合物中 HAPA 體積比時，移植脂肪的存活程度得到了提高，然而移植物的體積保留率卻逐漸降低。因此未來的研究應進一步明確 HAPA-脂肪復合物的最佳體積比。
作者貢獻：劉鵬程、譚秋雯、張憶、王紅負責實驗設計、實施及文章撰寫；劉鵬程、張憶、王紅負責數據收集整理；劉鵬程、譚秋雯、張憶負責統計分析；呂青負責對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準（2020072A）。實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2013-026，實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2013-119。
脂肪移植因填充物來源廣泛，兼具軟組織填充與形態再塑造的效果，是整形外科常用技術之一[1-3]。然而，移植脂肪吸收程度的不可預測性和不可控性是目前亟需解決的問題[4]。相關文獻報道游離脂肪移植存活率為 10%～85%，移植脂肪存活率是影響游離脂肪移植術后效果最重要的因素之一[5-8]。成熟脂肪細胞的物理損傷或組織/血管再生不足，是導致移植脂肪存活率較低的主要原因[9-10]。
組織工程通過構建適宜的微環境促進組織再生。大量研究顯示，來自不同組織的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）可以為組織再生提供不同的微環境[11]，而來源于脂肪組織的脫細胞基質材料在構建成脂誘導微環境上具有優勢[12-16]。在前期研究中，我們制備了豬脂肪源基質水凝膠（hydrogel from acellular porcine adipose tissue，HAPA），并描述了其對脂肪來源干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）的成脂誘導作用及體內、外環境下對血管新生的積極影響[12, 17]。同時，HAPA 為具有溫敏特性的水凝膠材料，以富含水的水凝膠材料為載體，可能減少移植脂肪組織的物理損傷，促進氧氣及營養物質交換，從而提高移植脂肪存活率[18-21]。然而，單純生物源性水凝膠降解速度較快[22]，在較短時間內即可引起較明顯的體積保留率（移植物移植一段時間后殘余體積占原體積的比率，是衡量脂肪移植臨床療效的一個極其重要的指標）變化。因此，在利用生物源性水凝膠輔助脂肪移植時，是否應當考慮單純水凝膠降解對總體體積保留率產生的影響，復合體系中凝膠比例變化導致的移植脂肪組織存活率變化是否最終會引起總體體積保留率（復合移植物移植一段時間后殘余凝膠和脂肪組織體積總和占原體積的比率）的動態變化，均值得進一步研究。
因此，本研究中我們將通過游離脂肪體外培養模型及游離脂肪-HAPA 復合物皮下移植模型，重點探討 HAPA/脂肪體積比對游離脂肪移植存活及體積保留率的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6 周齡 SPF 級雄性裸鼠 42 只，體質量 15～18 g，由南京大學模式動物研究所提供。FBS、L-DMEM 培養基、F12 培養基（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ 型膠原酶、胃蛋白酶（Sigma 公司，美國）；圍脂肪蛋白抗體（Abcam 公司，美國）；DeadEndTM TUNEL 熒光法檢測系統（Promega 公司，美國）；熒光二抗（Jeckson 公司，美國）。全自動正置熒光顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；Philips iU22 型彩色多普勒超聲診斷儀（Philips 公司，荷蘭）。
1.2 HAPA 和游離脂肪顆粒的制備
游離脂肪顆粒制備：從早期乳腺癌患者手術切除的乳腺標本中切取遠離腫瘤的脂肪組織，置于 PBS 緩沖液中，冰浴中 2 h 內送至實驗室。PBS 緩沖液反復沖洗脂肪組織，用眼科鑷剔取脂肪小葉并反復沖洗，用眼科剪剪至勻漿狀，移入 50 mL 離心管中，以 500×g 離心 5 min。用滴管吸出上層油脂，取中間層脂肪，即為游離脂肪顆粒，移入 50 mL 離心管中，冰浴保存，備用。
1.3 HAPA 對游離脂肪組織凋亡及存活影響的體外實驗
將游離脂肪顆粒與 3%HAPA 等體積混合均勻，取 100 μL 接種于 24 孔板內，37℃、5%CO2 孵箱孵育 15～20 min 使 HAPA 成膠，作為實驗組；另取單純脂肪 100 μL 接種于 24 孔板內作為對照組，每組每個時間點 3 個樣本。加入 200 μL 完全培養基（含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基），分別置于 37℃ 常氧（5%CO2）及低氧（1%O2、5%CO2 及 94%N2）孵箱內培養。24 h 及 72 h 后用顯微鑷將脂肪及 HAPA-脂肪復合物從孔板內夾出，4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 厚切片。取一部分切片行 TUNEL 染色，檢測移植脂肪中細胞凋亡情況，于全自動正置熒光顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取 3 個視野（×200），計算單位視野下細胞凋亡率（凋亡細胞占總體細胞比例）。另取一部分切片行圍脂肪蛋白免疫熒光染色，檢測移植脂肪中細胞存活及新生情況。
1.4 HAPA 輔助游離脂肪移植體內實驗
1.4.1 實驗分組及方法
將 HAPA 及游離脂肪顆粒，按照不同體積配比充分混勻，獲得不同體積比的 HAPA-脂肪復合物（表 1）。將 42 只裸鼠隨機分為 6 組（n=7），分別于各組裸鼠背部皮下移植脂肪或 HAPA-脂肪復合物 1 mL。移植后 4 周斷頸處死各組裸鼠后剪開背部皮膚，取出移植脂肪組織，進行以下觀測。見圖 1。
表1
實驗分組及不同體積比 HAPA-脂肪復合物
Table1.
Experimental grouping and different volume ratios of HAPA/adipose tissue complex
圖1
實驗材料及實驗動物模型
a. HAPA；b. 游離脂肪組織；c. 不同體積比的 HAPA-脂肪復合物 從左至右依次為 50%HAPA、40%HAPA、30%HAPA、20%HAPA、10%HAPA；d. 裸鼠背部皮下注射 HAPA-脂肪復合物；e. 術后 4 周取材
Figure1. Experimental materials and animal modelsa. HAPA; b. Adipose tissue; c. HAPA-adipose tissue complex with different volume ratioFrom left to right for 50%HAPA, 40%HAPA, 30%HAPA, 20%HAPA, and 10%HAPA; d. Subcutaneous injection of HAPA-adipose tissue complex into the back of nude mice; e. The grafts harvested after 4 weeks
1.4.2 大體觀察及超聲觀察
① 大體觀察：術后 4 周觀察大鼠生存狀態及注射區炎癥發生情況，采用排水法檢測各組移植物體積大小，并計算體積保留率：移植物殘余體積/原體積×100%。為初步了解 HAPA 對移植物體積維持的作用，以 A 組作為對照，觀察 HAPA-脂肪體積比的動態變化對移植物體積保留率的影響。② 超聲觀察：采用 Philips iU22 型彩色多普勒超聲診斷儀，L12-5 線陣探頭，頻率 5～12 MHz。將裸鼠以 2% 水合氯醛腹腔注射（0.1 mL/10 g）麻醉后平放于操作臺，先進行 B-Mode 超聲檢查，將儀器的增益、焦距、深度等各項參數調節至最佳位置，以獲得最優分辨率的超聲圖像。進行多切面掃查，觀察移植物內部形態及有無明顯液化壞死，記錄并比較移植物內液化壞死區數量及體積。
1.4.3 組織學觀察
術后 4 周各組標本常規固定、包埋及切片后，行以下組織學觀察。①HE 染色：常規 HE 染色觀察，并行半定量評價移植物的結構完整性、囊泡形成及纖維化程度。每個標本連續切片后間隔 10 張取 1 張切片（組織間隔約 50 μm），每張切片于 400 倍鏡下隨機取 3 個視野拍照。參照文獻［23］方法按 0～5 分標準行半定量評分：0 分，無或不存在；1 分，極少存在；2 分，最少至中度存在；3 分，中度存在；4 分，中度至廣泛存在；5 分，廣泛存在。以每組切片隨機視野的評分平均值作為該組樣本的評分結果。② CD31 免疫組織化學染色：各組任取 4 個樣本，切片行 CD31 免疫組織化學染色，每張切片于 200 倍鏡下隨機取 3 個視野拍照，對視野內新生血管數量進行統計。③ 圍脂肪蛋白免疫組織化學染色：同 1.3 方法進行觀察。所有評估均由 2 名作者獨立進行盲法評估。
1.5 統計學方法
采用 SPSS25.0 統計軟件進行分析。正態分布資料以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；非正態分布資料以中位數（四分位數間距）表示，組間比較采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HAPA 對游離脂肪組織凋亡及存活影響的體外實驗
TUNEL 染色示，常氧條件下培養 24 h，實驗組和對照組均可觀察到細胞凋亡，兩組脂肪細胞凋亡率比較差異無統計學意義（t=?0.325，P=0.159）。低氧條件下培養 24 h，對照組脂肪細胞凋亡率較常氧條件時有明顯增加趨勢，但差異無統計學意義（t=?2.706，P=0.240）；實驗組脂肪細胞凋亡率較常氧條件時有所增加，但差異無統計學意義（t=–3.133，P=0.979），較低氧條件下的對照組明顯降低（t=1.409，P=0.002）。見圖 2、表 2。
圖2
TUNEL 免疫熒光染色觀察兩組常氧和低氧條件下培養 24 h 脂肪細胞凋亡情況（熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為對照組和實驗組，箭頭示凋亡細胞 a. 常氧；b. 低氧
Figure2. TUNEL immunofluorescence staining to observe the apoptosis of adipocytes after cultured under normoxic and hypoxic conditions for 24 hours (Fluorescence microscope×200)From left to right for control group and experimental groupa. Normoxia; b. Hypoxia
表2
TUNEL 染色檢測兩組常氧和低氧條件下脂肪細胞凋亡率（n=3，，%）
Table2.
TUNEL staining to detect apoptosis rate of adipocytes under normoxia and hypoxic conditions (n=3, , %)
圍脂肪蛋白免疫熒光染色示，隨著時間推移，各組脂肪細胞逐漸液化壞死。低氧培養 24 h 后，對照組脂肪細胞液化壞死趨勢較實驗組更明顯；72 h 后該趨勢愈發明顯。見圖 3。
圖3
圍脂肪蛋白染色觀察常氧和低氧條件下培養 24、72 h 脂肪細胞存活情況（熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為對照組和實驗組a. 常氧 24 h；b. 低氧 24 h；c. 常氧 72 h；d. 低氧 72 h
Figure3. Perilipin immunofluorescence staining to observe the survival of adipocytes after cultured under normoxic and hypoxic conditions for 24 and 72 hours (Fluorescence microscope×200)From left to right for control group and experimental group a. Normoxia for 24 hours; b. Hypoxia for 24 hours; c. Normoxia for 72 hours; d. Hypoxia for 72 hours
2.2 HAPA 輔助游離脂肪移植體內實驗
2.2.1 大體觀察
術后 4 周各組小鼠多數生存狀態可，注射區域未見皮膚紅腫、皮下積液及炎癥發生；移植物包膜完整，與周圍組織未見明顯粘連。A 組移植物表面未見明顯新生血管形成，而各 HAPA-脂肪復合物組移植物表面均可見明顯新生血管形成。見圖 4。
圖4
術后 4 周移植物大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure4. Gross observation of the grafts at 4 weeks post-transplantationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
術后 4 周各組移植物體積均較注射時縮小，A～F 組移植物體積保留率分別為87%±3%、87%±5%、85%±10%、81%±5%、76%±9% 和 69%±6%，E、F 組移植物體積保留率顯著低于 A～D 組，差異有統計學意義（P<0.05）；E、F 組間和 A～D 組間差異均無統計學意義（P>0.05）。進一步分析發現，隨著初始 HAPA 添加體積的增加，獲得移植物的體積有逐漸降低的趨勢。見圖 5。
圖5
各組 HAPA-脂肪復合物中兩者的體積占比及術后 4 周移植物體積保留率變化模式圖
每組左側為術前，右側為術后 4 周
Figure5. Change pattern diagram of volume ratio and volume contribution ratio in different HAPA-adipose tissue complexesThe data of left and right sides in each group were preoperation and 4 weeks after operation, respectively2.2.2 超聲觀察
術后 4 周各組多數移植物內可見液化灶，大小不一。其中 A 組均可見液化灶，B～E 組有 2 只、F 組有 3 只小鼠移植物內未見液化灶。見圖 6。A～F 組液化灶體積分別為0.45（0.15，0.90）、0.02（0.02，0.10）、0.03（0.01，0.05）、0.02（0.01，0.05）、0.01（0.01，0.16）和 0.02 mL，隨著 HAPA 體積比提高，移植物內液化灶有逐漸縮小的趨勢，但各組間差異無統計學意義（H=3.010，P=0.698）。
圖6
術后 4 周各組大鼠移植物超聲檢查
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure6. Ultrasound examination of the grafts at 4 weeks post-transplantationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
2.2.3 HE 染色
B～F 組復合 HAPA 的移植物內可見未完全降解的 HAPA，HAPA 與移植脂肪組織融合較好，各組移植物內均無明顯纖維分隔形成。A～F 組移植物內均未見明顯炎癥細胞浸潤。見圖 7。
圖7
術后 4 周各組移植物 HE 染色（×100）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure7. HE staining of the grafts at 4 weeks post-transplantation (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
半定量分析結果顯示，隨著移植物中 HAPA 體積比的提高，移植物內部的結構完整性逐漸提高，液化壞死形成的囊泡區逐漸減少，纖維化程度逐漸降低。其中結構完整性方面，B～F 組顯著高于 A 組，E、F 組高于 B、C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；囊泡形成方面，D、E、F 組顯著少于 A 組，F 組少于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；纖維化程度方面，E、F 組顯著少于 A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 8。
圖8
術后 4 周各組移植物結構完整性、囊泡形成、纖維化程度 半定量分析結果
Figure8.
Semi-quantitative analysis results of each graft’s integrity, vacuoles formation, and fibrosis at 4 weeks post-transplantation
2.2.4 CD31 免疫組織化學染色
術后 4 周，隨著 HAPA 體積比增加，單位視野內新生血管數量逐漸增加。見圖 9。A～F 組新生血管數量分別為（8.08±2.90）、（15.25±5.39）、（20.92±8.86）、（24.92±9.28）、（35.00 ±6.43）和（34.33±7.18）個/視野，E、F 組顯著多于 A～D 組，B～D 組顯著高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖9
術后 4 周各組移植物 CD31 免疫組織化學染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure9. CD31 immunohistochemistry staining of the grafts at 4 weeks post-transplantation (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
2.2.5 圍脂肪蛋白免疫熒光染色觀察
B～F 組中活脂肪細胞明顯多于 A 組；隨著 HAPA 體積比的增加，活脂肪細胞逐漸增加，且視野內可見較多新生脂肪細胞。見圖 10。
圖10
術后 4 周各組移植物圍脂肪蛋白免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure10. Perilipin immunofluorescence staining of the grafts at 4 weeks post-transplantation (Fluorescence microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
3 討論
近年來，由天然 ECM 衍生而來的水凝膠因具有可注射性及與不規則缺損部位良好契合，可達到適形填充修復等特點，而成為常用的軟組織填充材料[24-25]。游離脂肪組織因來源廣泛、可微創獲取及植入，亦為常用的軟組織填充材料。從臨床角度看，水凝膠材料輔助游離脂肪移植具有極大意義[26]。理想的生物材料可為組織再生創造營養豐富的微環境，通過提供保護性結構基質來提高移植脂肪的存活。當生物材料與脂肪組織共同移植，生物材料扮演臨時支架材料作用，植入體內后隨著時間推移而逐漸降解為無毒的有機代謝物[12, 15]，最終完全被新生脂肪組織取代[4, 12, 27]。因此，復合脂肪移植的生物材料一方面可以通過提高移植脂肪存活率，使移植脂肪達到較好的體積保留率；另一方面，移植材料的原位促脂肪新生效應可進一步提升脂肪材料復合物的總體體積保留率。此外，這些生物材料一定程度上能緩解自體脂肪容量不足的問題[28]。
多種生物源水凝膠可用于脂肪移植。研究發現，脂肪組織來源的 ECM 材料可為脂肪新生提供獨特的微環境[13-15, 17]。本研究使用的 HAPA 來源于豬脂肪組織的無細胞基質材料，是一種可注射的溫敏水凝膠材料，已被證實可誘導原位脂肪新生，在輔助脂肪移植方面可能具有獨特優勢[12, 17]。盡管前期已有學者對水凝膠復合脂肪移植進行展望[26]，然而迄今為止并無相關研究實施，我們率先采用了 HAPA 水凝膠復合脂肪移植進行探索研究。
改善組織移植后早期低氧微環境可以提高移植組織存活率。目前研究報道的主要措施包括促進早期血管生成[29-33]、增強局部組織攜氧能力[24, 34]及提高移植組織局部氧含量[35-37]。凝膠類材料提供的富水微環境可以給移植脂肪提供更多養分，有利于改善組織移植后的低氧環境，增強組織對體內低氧環境的耐受性[19, 38]。本研究中，隨著復合 HAPA 體積比的增加，移植脂肪出現液化壞死區的可能性及液化壞死區體積有逐漸減少趨勢，組織學結果亦提示 HAPA 能促進移植脂肪重塑，減少液化及纖維化形成。
植入體內的水凝膠主要有 3 種代謝方式，即水解、酶解和溶解[39]。理想情況下，水凝膠降解速率應與組織新生速率相同，為新 ECM 的沉積創造空間，同時在此過程中保持組織穩定性[40]。生物材料降解的產物需要無毒、低免疫原性、不激活免疫反應。天然支架材料的降解產物比合成生物材料的毒性更小，引發的最小免疫反應更小[41]。然而，天然生物材料的降解速度較快[42]。另一方面，水凝膠網狀多孔的疏松結構使其能容納更多水分[40]，進入人體后易被吸收導致體積變小。這些因素均導致天然水凝膠材料在作為組織填充材料時，體積保留率低。本研究中，術后 4 周取材時 10%HAPA 組、20%HAPA 組及 30%HAPA 組與單純脂肪組體積保留率并無明顯差異，而 40%HAPA 組和 50%HAPA 組則具有更低的體積保留率。提示在 40%HAPA 組和 50%HAPA 組，即使復合物體系中 HAPA 比例提高促進了移植脂肪存活，但由于 HAPA 降解快、體積保留率低，不能抵消體系中 HAPA 體積的縮減，從而導致總體體積保留率明顯降低。然而 HAPA/脂肪體積比對移植脂肪總體體積保留率的影響，還需要更長期及更大樣本量的實驗來證實。
探討適宜的 HAPA/脂肪體積比是后期開展深入的基礎研究及臨床研究的基礎。然而，由于具有誘導原位脂肪新生作用，HAPA 與脂肪組織復合后，在組織學層面無法與脂肪組織分開，難以直接量化 HAPA 對提高移植脂肪體積保留率的提升作用。本研究以單純脂肪移植組作為參照，動態觀察隨著移植物中 HAPA 體積比提高，移植物體積保留率的變化情況，發現隨著 HAPA 體積比增加，HAPA 對移植物體積保留率的貢獻逐漸降低，綜合考慮移植物體積維持及所需脂肪組織的體積，30%HAPA 輔助的游離脂肪移植可能是較合適的體積比。然而，該模型通過等比例體積縮放評估兩種組分對移植物體積保留的貢獻，忽略了兩種組分之間的相互作用，較簡單粗糙，后續研究需要開發更準確的模型，評估計算生物材料輔助游離脂肪移植的最佳體積比。
本研究中，通過改變 HAPA/脂肪體積比，一定程度上兼顧了移植脂肪存活程度及移植脂肪體積保留率。結果發現在提高移植物復合物中 HAPA 體積比時，移植脂肪的存活程度得到了提高，然而移植物的體積保留率卻逐漸降低。因此未來的研究應進一步明確 HAPA-脂肪復合物的最佳體積比。
作者貢獻：劉鵬程、譚秋雯、張憶、王紅負責實驗設計、實施及文章撰寫；劉鵬程、張憶、王紅負責數據收集整理；劉鵬程、譚秋雯、張憶負責統計分析；呂青負責對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準（2020072A）。實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2013-026，實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2013-119。
