引用本文： 劉鋒, 方易冰, 熊琪, 羅良琴, 周銳, 廖斌. TBX3 及 TBX18 在人源誘導多能干細胞向竇房結樣細胞富集分化中的作用. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(4): 497-506. doi: 10.7507/1002-1892.201812009 復制
病態竇房結綜合征（sick sinus syndrome，SSS）是一系列因心臟起搏器竇房結功能紊亂所引起的相關疾病的統稱。SSS 可通過引發竇房結功能衰竭進而導致循環衰竭。目前，對 SSS 的治療主要依賴于人造電子心臟起搏器的植入。該方法在一定程度上很好地改善了上述癥狀，但仍存在對機體激素刺激不敏感、感染、電池失效、血栓形成等不足[1]。這些問題有望通過多能干細胞制備的“生物起搏器”得到解決。
2006 年 Takahashi 等[2]將 OCT4、SOX2、C-MYC 和 KIF4 等 4 個轉錄因子導入小鼠成纖維細胞中，成功獲得了誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）。隨后 Huangfu 等[3]在 2007 年利用相同方式將人皮膚成纖維細胞（human fibroblasts，HFB）重編程為多能干細胞，即人源 iPS（human derived iPS，HiPS）。近年來，也有研究報道將脂肪干細胞、人羊膜間充質干細胞誘導為韌帶成纖維細胞、肝細胞等多種體細胞[4-5]。HiPS 具有和胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）相似的多向分化潛能，可誘導分化為幾乎所有類型的體細胞，包括心肌細胞、神經細胞等終末分化細胞）[6-7]。有研究顯示，通過瞬時激活 Wnt 通路后瞬時抑制 Wnt 通路，可以實現 HiPS 向心肌細胞高效分化[8]。然而，該方案獲得的心肌細胞為混合細胞，其中以心室肌細胞為主、心房細胞為輔，而竇房結細胞所占比例極低。據報道，TBX18（T-box18）基因是竇房結早期從頭部合成的關鍵基因，而且可以重編程房室心肌向竇房結細胞轉化，而 TBX3（T-box3）基因在體內整個竇房結發育過程中持續表達[9-10]；提示上述轉錄因子可能在竇房結細胞分化中發揮重要作用。目前尚未見在 HiPS 單層培養誘導為心肌細胞基礎上，過表達 TBX3 或 TBX18 定向誘導分化為竇房結細胞的報道。本研究擬在 HiPS 誘導為心肌細胞的中胚層階段通過慢病毒轉染 TBX3 或 TBX18 轉錄因子，探索其在竇房結樣細胞富集分化中的作用。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
HiPS 系（LHPB-YaabC3）、HiPS 維持培養基（PM1 培養基）、人 ESCs（human ESCs，hESCs）系（HN4）（廣州皓昇萊生物制藥有限公司）；HFB（美國 ATCC 細胞庫）；TBX3、TBX18 過表達慢病毒（上海和元生物技術股份有限公司）；Wnt 通路激活劑 CHIR-99021、Wnt 通路抑制劑 IWP-2（Selleck 公司，美國）；鼠抗 α-輔肌動蛋白（α-actinin）抗體（Sigma-Aldrich 公司，美國）；鼠抗 NKX2-5（NK2 homeobox 5）、兔抗心肌細胞特異性收縮蛋白肌球蛋白（cardiac troponin，cTnT）、鼠抗心房肌球蛋白輕鏈（myosin light chain 2A，MLC-2A）、兔抗心室肌球蛋白輕鏈（myosin light chain 2V，MLC-2V）抗體（Abcam 公司，美國）；DAPI、兔抗 OCT3/4 單克隆抗體、兔抗 NANOG 單克隆抗體、鼠抗 SSEA4 單克隆抗體、鼠抗 TRA-1-60 單克隆抗體、Alexa Fluor488 標記抗兔二抗、Alexa Fluor594 標記抗兔二抗、Alexa Fluor488 標記抗鼠二抗（Cell Signaling Technology 公司，美國）；Toyobo 逆轉錄試劑盒、QuantiTect SYBR? Green PCR 試劑盒、實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒（Thermo Fisher 公司，美國）；RNA 提取試劑 Nucleo Zol（Invitrogen 公司，美國）。
細胞培養箱（SANYO 公司，日本）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；RT-PCR 儀（Thermo Fisher 公司，美國）；紫外分光光度儀（NanoDrop 公司，德國）。
1.2 HiPS培養及鑒定
1.2.1 HiPS培養
取 HiPS 系（LHPB-YaabC3），用 PM1 培養基于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養，培養 3 d 取融合度達 70%～80% 且處于對數生長期的細胞用于后續實驗，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。
1.2.2 qRT-PCR檢測干性標記物表達
取 HiPS、HFB、hESCs，采用 qRT-PCR 法檢測各細胞干性標記物 OCT3/4、SOX2、NANOG 基因表達。使用 Nucleo Zol 按照操作說明書對細胞樣品進行 RNA 提取，用 Nanodrop 測量 RNA 濃度，Toyobo 逆轉錄試劑盒制備 cDNA。采用 QuantiTect SYBR? Green PCR 試劑盒檢測各基因表達，以人源 GAPDH 作為內參。PCR 反應程序：94℃ 預變性 2 min，94℃ 變性 5 s，60℃ 退火/延伸 15 s，40 個熱循環。溶解曲線：95℃、2 min，60℃、20 s，95℃、15 s，從 60℃ 緩慢加熱到 99℃。采用 2-ΔΔCt計算各基因相對表達量，各基因引物序列見表 1。
表1
qRT-PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of qRT-PCR genes
1.2.3 免疫熒光染色觀察干性標記物表達
取 HiPS 以 4% 多聚甲醛固定 15 min，0.5%Triton X-100 通透 15 min；牛血清白蛋白封閉 30 min，加入一抗［兔抗 OCT3/4 單克隆抗體（1∶50）、兔抗 NANOG 單克隆抗體（1∶50）、鼠抗 SSEA4 單克隆抗體（1∶50）、鼠抗 TRA-1-60 單克隆抗體（1∶50）］4℃ 過夜，二抗［Alexa Fluor594 抗兔二抗、Alexa Fluor488 抗兔二抗、Alexa Fluor488 抗鼠二抗（1∶500）］，室溫避光 1 h。DAPI 復染，熒光顯微鏡觀察。
1.3 HiPS向心肌細胞定向分化及檢測
1.3.1 定向分化
取 HiPS 以 1.2×105個/孔密度接種于 12 孔板，融合度達 100% 時（記為 0 d），以 6 μmol/L CHIR-99021 作用 24 h；更換 PM1 培養基培養 48 h，加入 5 μmol/L IWP-2 作用 48 h，換液；分化第 7 天后每 3 天換液 1 次，各時間點進行以下檢測。
1.3.2 qRT-PCR檢測心肌細胞特異性標記物表達
分別于分化 0、3、5、7、21、28 d 取出細胞，同 1.2.2 方法檢測心肌前體細胞特異性基因 ISL1（ISL LIM homeobox 1）、NKX2-5，以及心肌細胞特異標記物 ACTN1（actinin alpha 1）、TNNT2（troponin T2，cardiac type）基因表達，以成人心肌細胞（human adult cardiomyocytes，hACM）作為陽性對照，用 2-ΔΔCt法計算其倍數變化關系作為各基因相對表達量。各基因引物序列見表 1。
1.3.3 免疫熒光染色觀察心肌細胞特異性標記物
分化 21 d 取出細胞，同 1.2.3 方法，采用免疫熒光染色法檢測心肌前體細胞特異核轉錄因子 NKX2-5，cTnT、α-actinin，以及心房、心室特異表達蛋白 MLC-2A 和 MLC-2V 的表達。
1.3.4 細胞流式術檢測
取 HiPS 按照 1.3.1 方法向心肌細胞定向分化作為實驗組，自分化細胞作為對照組。培養 21 d 以 4% 多聚甲醛固定 15 min，0.2%Triton X-100 通透 15 min；牛血清白蛋白封閉 15 min，加入一抗（鼠抗 α-actinin 抗體，1∶100）4℃ 過夜，二抗（Alexa Fluor488 抗鼠二抗，1∶500）室溫避光 30 min，采用流式細胞儀檢測各組 α-actinin 陽性率。
1.3.5 誘導心肌細胞的形態和功能檢測
同 1.3.4 方法分組，培養 21 d 采用倒置相差顯微鏡觀察兩組細胞形態。培養過程中注意觀察細胞初始搏動時間，并計算 21 d 時細胞搏動頻率和細胞搏動比例。
1.4 病毒轉染HiPS相關觀測
1.4.1 最佳轉染復數（multiplicity of infection，MOI）確定
取 HiPS 按照 1.3.1 方法向心肌細胞定向分化，第 3 天（中胚層階段）用增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）空白病毒分別以 MOI 為 5、25、50、75 轉染，于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養，靜置轉染 8 h，換液，繼續培養至 48 h 后用熒光顯微鏡觀察其轉染效率，篩選出最佳 MOI。
1.4.2 實驗分組
實驗設置 TBX3 過表達組、TBX18 過表達組和對照組。取 HiPS 按照 1.3.1 方法向心肌細胞定向分化，第 3 天通過慢病毒以最佳 MOI 轉染分別實現 TBX3、TBX18 過表達，空白病毒轉染作為對照組，繼續培養至 21 d 時進行以下檢測。
1.4.3 qRT-PCR檢測竇房結細胞標記物表達
取各組細胞，同 1.2.2 方法采用 qRT-PCR 檢測過表達 TBX3 組和對應的對照組 TBX18、SHOX2、NKX2-5、HCN4、HCN1 基因相對表達量；檢測過表達 TBX18 組和對應的對照組 TBX3、SHOX2、NKX2-5、HCN4、HCN1 基因相對表達量。各基因引物序列見表 1。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HiPS形態學觀察及鑒定
2.1.1 形態學觀察
培養 3 d 倒置相差顯微鏡觀察示，細胞排列致密，克隆邊緣規整；高倍鏡下細胞呈圓形，核質比高且核仁明顯。見圖 1。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察HiPS形態
a. ×4；b. ×20
Figure1. Morphology observation of HiPS under inverted phase contrast microscopea. ×4; b. ×20
2.1.2 qRT-PCR檢測干性標記物表達
HiPS 特異轉錄因子 OCT3/4、SOX2、NANOG 在 HiPS 和 hESCs 中均高表達，各基因相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）；各基因在 HFB 中不表達。見圖 2。
圖2
qRT-PCR檢測各細胞干性標記物表達
a. OCT3/4；b. SOX2；c. NANOG
Figure2. Detection of stemness markers by qRT-PCR methoda. OCT3/4; b. SOX2; c. NANOG
2.1.3 免疫熒光染色觀察干性標記物表達
熒光顯微鏡觀察示，OCT3/4 和 NANOG 在 HiPS 中特異分布于細胞核中，且呈現強陽性信號；SSEA4 和 TRA-1-60 在 HiPS 中高表達，且在細胞膜上呈強陽性信號，該信號與細胞核特異染料 DAPI 信號不重疊。見圖 3。
圖3
免疫熒光染色觀察HiPS干性標記物表達（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為 DAPI 核染色、熒光染色、二者重疊 a. OCT3/4；b. NANOG；c. SSEA4；d. TRA-1-60
Figure3. Detection of stemness markers of HiPS by immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)From left to right for DAPI nucleus staining, fluorescence staining, and merge a. OCT3/4; b. NANOG; c. SSEA4; d. TRA-1-60
2.2 HiPS向心肌細胞定向分化
2.2.1 qRT-PCR檢測心肌細胞特異性標記物表達
hACM 基因相對表達量為 1。ISL1 和 NKX2-5 于 HiPS 分化第 3 天出現表達，分別于第 5、7 天達峰值，隨后逐漸下降。分化第 5、7、21、28 天 ISL1 基因以及分化第 7、21、28 天 NKX2-5 基因相對表達量均顯著高于 hACM 基因相對表達量，差異有統計學意義（P<0.05）。ACTN1 和 TNNT2 基因隨分化時間延長，相對表達量呈遞增趨勢。分化第 3、5、7、21 天 ACTN1 和 TNNT2 基因相對表達量均顯著低于 hACM 基因相對表達量，差異有統計學意義（P<0.05）；分化第 28 天 ACTN1 和 TNNT2 基因相對表達量與 hACM 基因相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
qRT-PCR檢測分化各時間點心肌細胞特異性標記物表達
a. ISL1；b. NKX2-5；c. ACTN1；d. TNNT2
Figure4. Detection of cardiomyocyte markers after differentiation at different time points by qRT-PCR methoda. ISL1; b. NKX2-5; c. ACTN1; d. TNNT2
2.2.2 免疫熒光染色觀察心肌細胞特異性標記物表達
熒光顯微鏡觀察示，絕大部分細胞核中含有 NKX2-5 蛋白表達，且信號強，同核特異染料 DAPI 可以完全重疊。cTnT、α-actinin 和 MLC-2A、MLC-2V 信號定位于細胞質中，并且初步呈現出肌小結紋理樣結構。見圖 5。
圖5
分化21 d免疫熒光染色觀察心肌細胞特異性標記物表達（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為 DAPI 核染色、熒光染色、二者重疊 a. NKX2-5；b. cTnT；c. α-actinin；d. MLC-2A；e. MLC-2V
Figure5. Detection of cardiomyocyte markers of HiPS by immunofluorescence method at 21 days after differentiation (Fluorescence microscope×40)From left to right for DAPI nucleus staining, fluorescence staining, and merge a. NKX2-5; b. cTnT; c. α-actinin; d. MLC-2A; e. MLC-2V
2.2.3 流式細胞術檢測
實驗組細胞中 α-actinin 陽性率為 78.5%，對照組為 3.2%，提示 HiPS 向心肌細胞誘導分化成功。見圖 6。
圖6
分化21 d流式細胞術檢測兩組α-actinin陽性率
a. 對照組；b. 實驗組
Figure6. Detection of positive ratio of α-actinin at 21 days after differentiation by flow cytometry methoda. Control group; b. Experimental group
2.2.4 誘導心肌細胞的形態和功能檢測
實驗組分化第 9 天細胞開始搏動；隨著分化時間延長，細胞逐漸成熟，排列緊密，呈魚群狀或漩渦狀生長；21 d 細胞搏動頻率為 40～90 次/min，細胞搏動比在 70% 以上。對照組培養過程中均未出現心肌細胞的形態特征改變，也未觀察到搏動的細胞。見圖 7。
圖7
HiPS向心肌細胞分化21 d后細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×10）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure7. Morphological observation of HiPS differentiated into cardiomyocytes at 21 days (Inverted phase contrast microscope×10)a. Control group; b. Experimental group
2.3 病毒轉染HiPS
2.3.1 最佳MOI確定
熒光顯微鏡觀察示，隨著 MOI 值的增加，病毒轉染效率呈遞增趨勢。MOI 為 50 和 75 時的病毒轉染效率類似，但 MOI 為 75 時細胞形態出現一定損傷，故選取 50 作為最佳 MOI 進行后續實驗。見圖 8。
圖8
不同MOI轉染細胞48 h后轉染效率觀察（熒光顯微鏡×10）
a. MOI: 5；b. MOI: 25；c. MOI: 50；d. MOI: 75
Figure8. Observation on transfection efficiency of different MOI transfected cells at 48 hours (Fluorescence microscope×10)a. MOI: 5; b. MOI: 25; c. MOI: 50; d. MOI: 75
2.3.2 qRT-PCR檢測竇房結細胞標記物表達
過表達 TBX3 組中，除 SHOX2 基因相對表達量顯著高于相應對照組（P<0.05）外，TBX18、NKX2-5、HCN4、HCN1 基因相對表達量與對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。過表達 TBX18 組中，TBX3、SHOX2、NKX2-5、HCN4、HCN1 基因相對表達量與相應對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 9、10。
圖9
qRT-PCR檢測TBX3過表達組與相應對照組竇房結細胞標記物表達
a. TBX18；b. SHOX2；c. NKX2-5；d. HCN4；e. HCN1
Figure9. Comparison of sinus node markers expressions by qRT-PCR method between TBX3-over group and control groupa. TBX18; b. SHOX2; c. NKX2-5; d. HCN4; e. HCN1
圖10
qRT-PCR檢測TBX18過表達組與相應對照組竇房結細胞標記物表達
a. TBX3；b. SHOX2；c. NKX2-5；d. HCN4；e. HCN1
Figure10. Comparison of sinus node markers expressions by qRT-PCR method between TBX18-over group and control groupa. TBX3; b. SHOX2; c. NKX2-5; d. HCN4; e. HCN1
3 討論
近年來，干細胞作為心肌再生研究的種子細胞，是一種極具潛力的未來治療策略。但 ESCs 涉及倫理、免疫排斥等問題；成體 MSCs 心肌再生能力極低。Huangfu 等[3]研究用聯合多能轉錄因子的方法，成功將 HFB 誘導為 HiPS，HiPS 可由成體細胞重編程而來，來源廣泛，容易獲取，另外很好地解決了 ESCs 存在的倫理爭議和免疫排斥等問題。故本實驗選用 HiPS 作為研究細胞。HiPS 與 ESCs 具有相似的干細胞特異標記物表達[11-12]。HiPS 經過連續傳代后仍具有原代 HiPS 的形態學特征。另外，本實驗對傳代的細胞進行了相關干性標記物（OCT3/4、NANOG、SSEA4、TRA-1-60）的檢測，結果與既往研究一致，提示本研究所使用的 HiPS 具有同 ESCs 及其類似的 HiPS 的特征。
近年來，研究者分別利用擬胚體法和共培養法，成功將 HiPS 誘導分化出具有收縮功能的心肌細胞[13-16]，但分化效率均不高。隨后研究發現早期激活、晚期抑制 Wnt 通路，有助于心肌細胞高效率分化[8]。本研究采用同樣的方法，即在分化初始通過 CHIR-99021 作用 24 h 進而短暫激活 Wnt 通路，第 3 天加入 Wnt 通路抑制劑 IWP-2 作用 48 h，通過瞬時短暫激活和隨后抑制 Wnt 信號通路得以實現高效的心肌細胞誘導分化。流式細胞術顯示實驗組心肌細胞特異標記物 α-actinin 陽性率為 78.5%，提示該方法高效的分化效率。qRT-PCR 結果進一步表明，HiPS 誘導分化的細胞高水平表達一系列心肌前體和心肌特異細胞標記物，其表達水平接近于 hACM 水平。免疫熒光染色檢測示，泛心肌細胞特異標記物 NKX2-5、cTnT、α-actinin 呈現高比例且強陽性信號，心房、心室特異標物 MLC-2A、MLC-2V 染色結果則初步提示分化的心肌細胞中以心室和心房肌細胞為主。
T-BOX 家族的相關基因，如 TBX1、TBX2、TBX3、TBX5、TBX18 和 TBX20，被認為與心臟的胚胎發育相關[17]。其中 TBX3 和 TBX18 被認為與竇房結的發育密切相關[18]。研究顯示，過表達 TBX3、TBX18 能夠促進竇房結樣細胞的特異性分化[13, 19]。本研究將 HiPS 向心肌細胞誘導分化 3 d，即處于中胚層階段時，采用慢病毒轉染方法過表達 TBX3 和 TBX18，繼續培養至 21 d 后，qRT-PCR 結果顯示，關于竇房結特異轉錄因子，過表達 TBX3 顯著上調了 SHOX2 的水平（P<0.05），TBX18 呈現一定上調趨勢但差異無統計學意義；竇房結特異離子通道基因 HCN1 也呈現出上調趨勢（P>0.05）；此外，TBX3 對阻礙竇房結細胞分化的心肌前體細胞標記物 NKX2-5 的表達也呈現出一定的下調趨勢。上述結果提示 TBX3 在 HiPS 向竇房結細胞富集分化過程中可能發揮一定的促進趨勢，而過表達 TBX18 促進 HiPS 向竇房結樣細胞富集分化的作用不明顯。針對以上結果我們分析其原因如下：① 可能需要更加精準的基因導入時間節點，本研究只探索了第 3 天 1 個時間點，嘗試更早或者更晚的時間點可能會有不一樣的效果。② 文獻報道[20]胚胎心臟發育過程中 TBX18 主要作用于竇房結頭部區域的形成，而 TBX3 主要參與尾部的形成，二者在竇房結發育分化過程中分別在不同時空發揮作用，因此聯合轉染過表達 TBX3 和 TBX18 可能是一個有效的促進竇房結分化的策略。此外，本實驗對于誘導分化的細胞檢測方法僅局限在核酸水平，考慮到細胞內存在轉錄后修飾和翻譯后修飾，因此在未來研究中還需加入蛋白水平檢測。
綜上述，本研究對于過表達 TBX3、TBX18 誘導 HiPS 向竇房結細胞特異性分化方面做了初步探索，結果提示在 HiPS 的心肌誘導中胚層階段過表達 TBX3 呈現出一定的竇房結細胞富集分化趨勢，但不顯著。通過對 TBX 家族轉錄因子基因導入時間點以及聯合導入等方法進行改進和嘗試，有望在未來實現顯著高效的 HiPS 向竇房結樣細胞的誘導分化，進而為未來生物起搏器制備所需的大量起搏樣細胞提供理論和技術基礎。
病態竇房結綜合征（sick sinus syndrome，SSS）是一系列因心臟起搏器竇房結功能紊亂所引起的相關疾病的統稱。SSS 可通過引發竇房結功能衰竭進而導致循環衰竭。目前，對 SSS 的治療主要依賴于人造電子心臟起搏器的植入。該方法在一定程度上很好地改善了上述癥狀，但仍存在對機體激素刺激不敏感、感染、電池失效、血栓形成等不足[1]。這些問題有望通過多能干細胞制備的“生物起搏器”得到解決。
2006 年 Takahashi 等[2]將 OCT4、SOX2、C-MYC 和 KIF4 等 4 個轉錄因子導入小鼠成纖維細胞中，成功獲得了誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）。隨后 Huangfu 等[3]在 2007 年利用相同方式將人皮膚成纖維細胞（human fibroblasts，HFB）重編程為多能干細胞，即人源 iPS（human derived iPS，HiPS）。近年來，也有研究報道將脂肪干細胞、人羊膜間充質干細胞誘導為韌帶成纖維細胞、肝細胞等多種體細胞[4-5]。HiPS 具有和胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）相似的多向分化潛能，可誘導分化為幾乎所有類型的體細胞，包括心肌細胞、神經細胞等終末分化細胞）[6-7]。有研究顯示，通過瞬時激活 Wnt 通路后瞬時抑制 Wnt 通路，可以實現 HiPS 向心肌細胞高效分化[8]。然而，該方案獲得的心肌細胞為混合細胞，其中以心室肌細胞為主、心房細胞為輔，而竇房結細胞所占比例極低。據報道，TBX18（T-box18）基因是竇房結早期從頭部合成的關鍵基因，而且可以重編程房室心肌向竇房結細胞轉化，而 TBX3（T-box3）基因在體內整個竇房結發育過程中持續表達[9-10]；提示上述轉錄因子可能在竇房結細胞分化中發揮重要作用。目前尚未見在 HiPS 單層培養誘導為心肌細胞基礎上，過表達 TBX3 或 TBX18 定向誘導分化為竇房結細胞的報道。本研究擬在 HiPS 誘導為心肌細胞的中胚層階段通過慢病毒轉染 TBX3 或 TBX18 轉錄因子，探索其在竇房結樣細胞富集分化中的作用。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
HiPS 系（LHPB-YaabC3）、HiPS 維持培養基（PM1 培養基）、人 ESCs（human ESCs，hESCs）系（HN4）（廣州皓昇萊生物制藥有限公司）；HFB（美國 ATCC 細胞庫）；TBX3、TBX18 過表達慢病毒（上海和元生物技術股份有限公司）；Wnt 通路激活劑 CHIR-99021、Wnt 通路抑制劑 IWP-2（Selleck 公司，美國）；鼠抗 α-輔肌動蛋白（α-actinin）抗體（Sigma-Aldrich 公司，美國）；鼠抗 NKX2-5（NK2 homeobox 5）、兔抗心肌細胞特異性收縮蛋白肌球蛋白（cardiac troponin，cTnT）、鼠抗心房肌球蛋白輕鏈（myosin light chain 2A，MLC-2A）、兔抗心室肌球蛋白輕鏈（myosin light chain 2V，MLC-2V）抗體（Abcam 公司，美國）；DAPI、兔抗 OCT3/4 單克隆抗體、兔抗 NANOG 單克隆抗體、鼠抗 SSEA4 單克隆抗體、鼠抗 TRA-1-60 單克隆抗體、Alexa Fluor488 標記抗兔二抗、Alexa Fluor594 標記抗兔二抗、Alexa Fluor488 標記抗鼠二抗（Cell Signaling Technology 公司，美國）；Toyobo 逆轉錄試劑盒、QuantiTect SYBR? Green PCR 試劑盒、實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒（Thermo Fisher 公司，美國）；RNA 提取試劑 Nucleo Zol（Invitrogen 公司，美國）。
細胞培養箱（SANYO 公司，日本）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；RT-PCR 儀（Thermo Fisher 公司，美國）；紫外分光光度儀（NanoDrop 公司，德國）。
1.2 HiPS培養及鑒定
1.2.1 HiPS培養
取 HiPS 系（LHPB-YaabC3），用 PM1 培養基于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養，培養 3 d 取融合度達 70%～80% 且處于對數生長期的細胞用于后續實驗，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。
1.2.2 qRT-PCR檢測干性標記物表達
取 HiPS、HFB、hESCs，采用 qRT-PCR 法檢測各細胞干性標記物 OCT3/4、SOX2、NANOG 基因表達。使用 Nucleo Zol 按照操作說明書對細胞樣品進行 RNA 提取，用 Nanodrop 測量 RNA 濃度，Toyobo 逆轉錄試劑盒制備 cDNA。采用 QuantiTect SYBR? Green PCR 試劑盒檢測各基因表達，以人源 GAPDH 作為內參。PCR 反應程序：94℃ 預變性 2 min，94℃ 變性 5 s，60℃ 退火/延伸 15 s，40 個熱循環。溶解曲線：95℃、2 min，60℃、20 s，95℃、15 s，從 60℃ 緩慢加熱到 99℃。采用 2-ΔΔCt計算各基因相對表達量，各基因引物序列見表 1。
表1
qRT-PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of qRT-PCR genes
1.2.3 免疫熒光染色觀察干性標記物表達
取 HiPS 以 4% 多聚甲醛固定 15 min，0.5%Triton X-100 通透 15 min；牛血清白蛋白封閉 30 min，加入一抗［兔抗 OCT3/4 單克隆抗體（1∶50）、兔抗 NANOG 單克隆抗體（1∶50）、鼠抗 SSEA4 單克隆抗體（1∶50）、鼠抗 TRA-1-60 單克隆抗體（1∶50）］4℃ 過夜，二抗［Alexa Fluor594 抗兔二抗、Alexa Fluor488 抗兔二抗、Alexa Fluor488 抗鼠二抗（1∶500）］，室溫避光 1 h。DAPI 復染，熒光顯微鏡觀察。
1.3 HiPS向心肌細胞定向分化及檢測
1.3.1 定向分化
取 HiPS 以 1.2×105個/孔密度接種于 12 孔板，融合度達 100% 時（記為 0 d），以 6 μmol/L CHIR-99021 作用 24 h；更換 PM1 培養基培養 48 h，加入 5 μmol/L IWP-2 作用 48 h，換液；分化第 7 天后每 3 天換液 1 次，各時間點進行以下檢測。
1.3.2 qRT-PCR檢測心肌細胞特異性標記物表達
分別于分化 0、3、5、7、21、28 d 取出細胞，同 1.2.2 方法檢測心肌前體細胞特異性基因 ISL1（ISL LIM homeobox 1）、NKX2-5，以及心肌細胞特異標記物 ACTN1（actinin alpha 1）、TNNT2（troponin T2，cardiac type）基因表達，以成人心肌細胞（human adult cardiomyocytes，hACM）作為陽性對照，用 2-ΔΔCt法計算其倍數變化關系作為各基因相對表達量。各基因引物序列見表 1。
1.3.3 免疫熒光染色觀察心肌細胞特異性標記物
分化 21 d 取出細胞，同 1.2.3 方法，采用免疫熒光染色法檢測心肌前體細胞特異核轉錄因子 NKX2-5，cTnT、α-actinin，以及心房、心室特異表達蛋白 MLC-2A 和 MLC-2V 的表達。
1.3.4 細胞流式術檢測
取 HiPS 按照 1.3.1 方法向心肌細胞定向分化作為實驗組，自分化細胞作為對照組。培養 21 d 以 4% 多聚甲醛固定 15 min，0.2%Triton X-100 通透 15 min；牛血清白蛋白封閉 15 min，加入一抗（鼠抗 α-actinin 抗體，1∶100）4℃ 過夜，二抗（Alexa Fluor488 抗鼠二抗，1∶500）室溫避光 30 min，采用流式細胞儀檢測各組 α-actinin 陽性率。
1.3.5 誘導心肌細胞的形態和功能檢測
同 1.3.4 方法分組，培養 21 d 采用倒置相差顯微鏡觀察兩組細胞形態。培養過程中注意觀察細胞初始搏動時間，并計算 21 d 時細胞搏動頻率和細胞搏動比例。
1.4 病毒轉染HiPS相關觀測
1.4.1 最佳轉染復數（multiplicity of infection，MOI）確定
取 HiPS 按照 1.3.1 方法向心肌細胞定向分化，第 3 天（中胚層階段）用增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）空白病毒分別以 MOI 為 5、25、50、75 轉染，于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養，靜置轉染 8 h，換液，繼續培養至 48 h 后用熒光顯微鏡觀察其轉染效率，篩選出最佳 MOI。
1.4.2 實驗分組
實驗設置 TBX3 過表達組、TBX18 過表達組和對照組。取 HiPS 按照 1.3.1 方法向心肌細胞定向分化，第 3 天通過慢病毒以最佳 MOI 轉染分別實現 TBX3、TBX18 過表達，空白病毒轉染作為對照組，繼續培養至 21 d 時進行以下檢測。
1.4.3 qRT-PCR檢測竇房結細胞標記物表達
取各組細胞，同 1.2.2 方法采用 qRT-PCR 檢測過表達 TBX3 組和對應的對照組 TBX18、SHOX2、NKX2-5、HCN4、HCN1 基因相對表達量；檢測過表達 TBX18 組和對應的對照組 TBX3、SHOX2、NKX2-5、HCN4、HCN1 基因相對表達量。各基因引物序列見表 1。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HiPS形態學觀察及鑒定
2.1.1 形態學觀察
培養 3 d 倒置相差顯微鏡觀察示，細胞排列致密，克隆邊緣規整；高倍鏡下細胞呈圓形，核質比高且核仁明顯。見圖 1。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察HiPS形態
a. ×4；b. ×20
Figure1. Morphology observation of HiPS under inverted phase contrast microscopea. ×4; b. ×20
2.1.2 qRT-PCR檢測干性標記物表達
HiPS 特異轉錄因子 OCT3/4、SOX2、NANOG 在 HiPS 和 hESCs 中均高表達，各基因相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）；各基因在 HFB 中不表達。見圖 2。
圖2
qRT-PCR檢測各細胞干性標記物表達
a. OCT3/4；b. SOX2；c. NANOG
Figure2. Detection of stemness markers by qRT-PCR methoda. OCT3/4; b. SOX2; c. NANOG
2.1.3 免疫熒光染色觀察干性標記物表達
熒光顯微鏡觀察示，OCT3/4 和 NANOG 在 HiPS 中特異分布于細胞核中，且呈現強陽性信號；SSEA4 和 TRA-1-60 在 HiPS 中高表達，且在細胞膜上呈強陽性信號，該信號與細胞核特異染料 DAPI 信號不重疊。見圖 3。
圖3
免疫熒光染色觀察HiPS干性標記物表達（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為 DAPI 核染色、熒光染色、二者重疊 a. OCT3/4；b. NANOG；c. SSEA4；d. TRA-1-60
Figure3. Detection of stemness markers of HiPS by immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)From left to right for DAPI nucleus staining, fluorescence staining, and merge a. OCT3/4; b. NANOG; c. SSEA4; d. TRA-1-60
2.2 HiPS向心肌細胞定向分化
2.2.1 qRT-PCR檢測心肌細胞特異性標記物表達
hACM 基因相對表達量為 1。ISL1 和 NKX2-5 于 HiPS 分化第 3 天出現表達，分別于第 5、7 天達峰值，隨后逐漸下降。分化第 5、7、21、28 天 ISL1 基因以及分化第 7、21、28 天 NKX2-5 基因相對表達量均顯著高于 hACM 基因相對表達量，差異有統計學意義（P<0.05）。ACTN1 和 TNNT2 基因隨分化時間延長，相對表達量呈遞增趨勢。分化第 3、5、7、21 天 ACTN1 和 TNNT2 基因相對表達量均顯著低于 hACM 基因相對表達量，差異有統計學意義（P<0.05）；分化第 28 天 ACTN1 和 TNNT2 基因相對表達量與 hACM 基因相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
qRT-PCR檢測分化各時間點心肌細胞特異性標記物表達
a. ISL1；b. NKX2-5；c. ACTN1；d. TNNT2
Figure4. Detection of cardiomyocyte markers after differentiation at different time points by qRT-PCR methoda. ISL1; b. NKX2-5; c. ACTN1; d. TNNT2
2.2.2 免疫熒光染色觀察心肌細胞特異性標記物表達
熒光顯微鏡觀察示，絕大部分細胞核中含有 NKX2-5 蛋白表達，且信號強，同核特異染料 DAPI 可以完全重疊。cTnT、α-actinin 和 MLC-2A、MLC-2V 信號定位于細胞質中，并且初步呈現出肌小結紋理樣結構。見圖 5。
圖5
分化21 d免疫熒光染色觀察心肌細胞特異性標記物表達（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為 DAPI 核染色、熒光染色、二者重疊 a. NKX2-5；b. cTnT；c. α-actinin；d. MLC-2A；e. MLC-2V
Figure5. Detection of cardiomyocyte markers of HiPS by immunofluorescence method at 21 days after differentiation (Fluorescence microscope×40)From left to right for DAPI nucleus staining, fluorescence staining, and merge a. NKX2-5; b. cTnT; c. α-actinin; d. MLC-2A; e. MLC-2V
2.2.3 流式細胞術檢測
實驗組細胞中 α-actinin 陽性率為 78.5%，對照組為 3.2%，提示 HiPS 向心肌細胞誘導分化成功。見圖 6。
圖6
分化21 d流式細胞術檢測兩組α-actinin陽性率
a. 對照組；b. 實驗組
Figure6. Detection of positive ratio of α-actinin at 21 days after differentiation by flow cytometry methoda. Control group; b. Experimental group
2.2.4 誘導心肌細胞的形態和功能檢測
實驗組分化第 9 天細胞開始搏動；隨著分化時間延長，細胞逐漸成熟，排列緊密，呈魚群狀或漩渦狀生長；21 d 細胞搏動頻率為 40～90 次/min，細胞搏動比在 70% 以上。對照組培養過程中均未出現心肌細胞的形態特征改變，也未觀察到搏動的細胞。見圖 7。
圖7
HiPS向心肌細胞分化21 d后細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×10）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure7. Morphological observation of HiPS differentiated into cardiomyocytes at 21 days (Inverted phase contrast microscope×10)a. Control group; b. Experimental group
2.3 病毒轉染HiPS
2.3.1 最佳MOI確定
熒光顯微鏡觀察示，隨著 MOI 值的增加，病毒轉染效率呈遞增趨勢。MOI 為 50 和 75 時的病毒轉染效率類似，但 MOI 為 75 時細胞形態出現一定損傷，故選取 50 作為最佳 MOI 進行后續實驗。見圖 8。
圖8
不同MOI轉染細胞48 h后轉染效率觀察（熒光顯微鏡×10）
a. MOI: 5；b. MOI: 25；c. MOI: 50；d. MOI: 75
Figure8. Observation on transfection efficiency of different MOI transfected cells at 48 hours (Fluorescence microscope×10)a. MOI: 5; b. MOI: 25; c. MOI: 50; d. MOI: 75
2.3.2 qRT-PCR檢測竇房結細胞標記物表達
過表達 TBX3 組中，除 SHOX2 基因相對表達量顯著高于相應對照組（P<0.05）外，TBX18、NKX2-5、HCN4、HCN1 基因相對表達量與對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。過表達 TBX18 組中，TBX3、SHOX2、NKX2-5、HCN4、HCN1 基因相對表達量與相應對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 9、10。
圖9
qRT-PCR檢測TBX3過表達組與相應對照組竇房結細胞標記物表達
a. TBX18；b. SHOX2；c. NKX2-5；d. HCN4；e. HCN1
Figure9. Comparison of sinus node markers expressions by qRT-PCR method between TBX3-over group and control groupa. TBX18; b. SHOX2; c. NKX2-5; d. HCN4; e. HCN1
圖10
qRT-PCR檢測TBX18過表達組與相應對照組竇房結細胞標記物表達
a. TBX3；b. SHOX2；c. NKX2-5；d. HCN4；e. HCN1
Figure10. Comparison of sinus node markers expressions by qRT-PCR method between TBX18-over group and control groupa. TBX3; b. SHOX2; c. NKX2-5; d. HCN4; e. HCN1
3 討論
近年來，干細胞作為心肌再生研究的種子細胞，是一種極具潛力的未來治療策略。但 ESCs 涉及倫理、免疫排斥等問題；成體 MSCs 心肌再生能力極低。Huangfu 等[3]研究用聯合多能轉錄因子的方法，成功將 HFB 誘導為 HiPS，HiPS 可由成體細胞重編程而來，來源廣泛，容易獲取，另外很好地解決了 ESCs 存在的倫理爭議和免疫排斥等問題。故本實驗選用 HiPS 作為研究細胞。HiPS 與 ESCs 具有相似的干細胞特異標記物表達[11-12]。HiPS 經過連續傳代后仍具有原代 HiPS 的形態學特征。另外，本實驗對傳代的細胞進行了相關干性標記物（OCT3/4、NANOG、SSEA4、TRA-1-60）的檢測，結果與既往研究一致，提示本研究所使用的 HiPS 具有同 ESCs 及其類似的 HiPS 的特征。
近年來，研究者分別利用擬胚體法和共培養法，成功將 HiPS 誘導分化出具有收縮功能的心肌細胞[13-16]，但分化效率均不高。隨后研究發現早期激活、晚期抑制 Wnt 通路，有助于心肌細胞高效率分化[8]。本研究采用同樣的方法，即在分化初始通過 CHIR-99021 作用 24 h 進而短暫激活 Wnt 通路，第 3 天加入 Wnt 通路抑制劑 IWP-2 作用 48 h，通過瞬時短暫激活和隨后抑制 Wnt 信號通路得以實現高效的心肌細胞誘導分化。流式細胞術顯示實驗組心肌細胞特異標記物 α-actinin 陽性率為 78.5%，提示該方法高效的分化效率。qRT-PCR 結果進一步表明，HiPS 誘導分化的細胞高水平表達一系列心肌前體和心肌特異細胞標記物，其表達水平接近于 hACM 水平。免疫熒光染色檢測示，泛心肌細胞特異標記物 NKX2-5、cTnT、α-actinin 呈現高比例且強陽性信號，心房、心室特異標物 MLC-2A、MLC-2V 染色結果則初步提示分化的心肌細胞中以心室和心房肌細胞為主。
T-BOX 家族的相關基因，如 TBX1、TBX2、TBX3、TBX5、TBX18 和 TBX20，被認為與心臟的胚胎發育相關[17]。其中 TBX3 和 TBX18 被認為與竇房結的發育密切相關[18]。研究顯示，過表達 TBX3、TBX18 能夠促進竇房結樣細胞的特異性分化[13, 19]。本研究將 HiPS 向心肌細胞誘導分化 3 d，即處于中胚層階段時，采用慢病毒轉染方法過表達 TBX3 和 TBX18，繼續培養至 21 d 后，qRT-PCR 結果顯示，關于竇房結特異轉錄因子，過表達 TBX3 顯著上調了 SHOX2 的水平（P<0.05），TBX18 呈現一定上調趨勢但差異無統計學意義；竇房結特異離子通道基因 HCN1 也呈現出上調趨勢（P>0.05）；此外，TBX3 對阻礙竇房結細胞分化的心肌前體細胞標記物 NKX2-5 的表達也呈現出一定的下調趨勢。上述結果提示 TBX3 在 HiPS 向竇房結細胞富集分化過程中可能發揮一定的促進趨勢，而過表達 TBX18 促進 HiPS 向竇房結樣細胞富集分化的作用不明顯。針對以上結果我們分析其原因如下：① 可能需要更加精準的基因導入時間節點，本研究只探索了第 3 天 1 個時間點，嘗試更早或者更晚的時間點可能會有不一樣的效果。② 文獻報道[20]胚胎心臟發育過程中 TBX18 主要作用于竇房結頭部區域的形成，而 TBX3 主要參與尾部的形成，二者在竇房結發育分化過程中分別在不同時空發揮作用，因此聯合轉染過表達 TBX3 和 TBX18 可能是一個有效的促進竇房結分化的策略。此外，本實驗對于誘導分化的細胞檢測方法僅局限在核酸水平，考慮到細胞內存在轉錄后修飾和翻譯后修飾，因此在未來研究中還需加入蛋白水平檢測。
綜上述，本研究對于過表達 TBX3、TBX18 誘導 HiPS 向竇房結細胞特異性分化方面做了初步探索，結果提示在 HiPS 的心肌誘導中胚層階段過表達 TBX3 呈現出一定的竇房結細胞富集分化趨勢，但不顯著。通過對 TBX 家族轉錄因子基因導入時間點以及聯合導入等方法進行改進和嘗試，有望在未來實現顯著高效的 HiPS 向竇房結樣細胞的誘導分化，進而為未來生物起搏器制備所需的大量起搏樣細胞提供理論和技術基礎。
