目的探討KLD-12多肽復合重組人BMP-2(recombinant human BMP-2,rhBMP-2)誘導兔BMSCs成骨活性的影響。 方法取3月齡新西蘭大白兔骨髓,采用密度梯度法分離培養BMSCs。取第3代BMSCs分別采用KLD-12多肽/rhBMP-2凝膠三維培養(實驗組)和KLD-12多肽凝膠培養(對照組)。培養7 d倒置相差顯微鏡下觀察實驗組細胞在凝膠內的形態;3、7、10、14、21 d檢測兩組細胞培養基中ALP及骨鈣蛋白含量;培養14 d兩組行Ⅰ型膠原免疫熒光染色觀察,實時熒光定量PCR檢測Ⅰ型膠原和骨鈣蛋白基因相對表達量。 結果倒置相差顯微鏡下觀察,培養7 d實驗組及對照組凝膠內BMSCs呈圓形,分布均勻。兩組培養3、7 d時ALP表達量及骨鈣蛋白含量比較差異無統計學意義(P>0.05),10~21 d實驗組以上指標均明顯高于對照組(P<0.05)。培養14 d,激光共聚焦顯微鏡觀察示,實驗組Ⅰ型膠原免疫熒光染色陽性,且熒光強度較對照組高;實時熒光定量PCR檢測實驗組Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白基因相對表達量均顯著高于對照組,比較差異有統計學意義(t=15.902,P=0.000;t=12.998,P=0.000)。 結論BMSCs在KLD-12多肽內正常生長并增殖,KLD-12多肽/rhBMP-2凝膠誘導BMSCs向成骨細胞分化的生物活性良好。
大段骨缺損修復一直是骨科領域亟待解決的一大難題,骨修復材料是解決這一難題切實可行的方法。近年,骨修復材料發展迅速,已經從自體骨、同種異體骨、惰性材料發展到高活性、多功能的骨組織工程支架材料。通過廣泛回顧文獻,從骨修復材料活性機制、骨修復材料的應用及新型骨修復材料的探索三方面,總結骨修復材料研究現狀與進展,并展望發展方向。
目的觀察淫羊藿苷對 Masquelet 技術治療大鼠脛骨骨缺損后誘導膜內血管化及其相關生物活性因子 TGF-β1 和 bFGF 表達的影響,探討淫羊藿苷在 Masquelet 技術修復骨缺損中的作用。方法將 60 只 3 月齡 Wistar 雄性大鼠隨機分為 3 組,每組 20 只,建立右后肢 6 mm 長脛骨骨缺損模型。空白組(A 組)骨缺損處不作處理;對照組(B 組)和實驗組(C 組)將處于拉絲期的去甲萬古霉素抗生素骨水泥填充于骨缺損處,待骨水泥完全凝固。C 組從術后第 1 天開始每天給予淫羊藿總黃酮注射液稀釋液(10 μmol/L)灌胃 1 次(0.3 mL),A、B 組予以等量生理鹽水灌胃。觀察實驗動物術后恢復及切口愈合情況;術后 4 周攝 X 線片觀察脛骨近端骨缺損處恢復情況;術后 6 周大體觀察骨缺損處情況,并取材觀察肉芽組織及誘導膜組織形態變化及其血管化程度,免疫組織化學染色觀察及 ELISA 檢測 TGF-β1、bFGF 表達。結果3 組大鼠骨缺損模型均造模成功,術后無異常,切口均Ⅰ期愈合。術后 4 周脛骨近端骨缺損處 X 線片示 A 組有明顯空隙,B、C 組為骨水泥充填、克氏針固定良好。術后 6 周大體觀察示,A 組可見缺損區被肉芽組織充填;B、C 組可見透明薄膜形成,部分區域可見微血管,且 C 組薄膜及微血管明顯多于 B 組。免疫組織化學染色示 A 組 TGF-β1、bFGF 表達均為陰性,B、C 組均有表達且 B 組表達明顯少于 C 組。ELISA 檢測示,C 組 TGF-β1、bFGF 表達水平顯著高于 A、B 組(P<0.05);A、B 組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。結論淫羊藿苷在大鼠脛骨骨缺損模型形成誘導膜時可顯著提高 TGF-β1 及 bFGF 的表達,加速成骨過程,有利于骨質塑形與改建。
目的探討脫鈣骨基質(demineralized bone matrix,DBM)中 BMP-2 含量與其體內/外成骨活性的相關性,以期選擇一種簡易、便捷的評價 DBM 成骨活性的方法。方法取 9 具人尸體左側股骨中段組織,采用動態脫鈣工藝制備 DBM(S1~S9),同時制備滅活 DBM(對照)。分別采用蛋白酶抑制劑法、膠原酶法、鹽酸胍/EDTA 法、RIPA 裂解液法提取 S1~S9 以及滅活 DBM 中 BMP-2,測量比較不同 DBM 間 BMP-2 含量差異。取 S1~S9 以及滅活 DBM,分別與小鼠胚胎成骨細胞 MC3T3-E1 共培養,采用 MTT 法及熒光染色檢測細胞增殖,同時檢測 ALP 活性。取 30 只 BALB/c 雄性裸小鼠分為 10 組,分別為 S1~S9 DBM 組(S1~S9 組)以及滅活 DBM 組(對照組),每組 3 只。于各組小鼠雙側后肢大腿中部制備肌袋,植入對應 DBM 材料,術后 4 周取材行 HE 染色觀察并半定量評價(新骨形成評分)。結果不同供體骨制備的 DBM,其 BMP-2 含量存在差異;同一供體骨制備的 DBM,經不同提取方法獲得的 BMP-2 含量也不同,其中鹽酸胍/EDTA 法提取效率最高。體外成骨性能評價,共培養后各時間點 S4、S6 組細胞增殖、ALP 活性均較其他組明顯增高(P<0.05),且 7 d 時 S4 組細胞增殖最顯著(P<0.05);熒光染色示各組成骨細胞狀態均良好,但 S1、S2、S3、S4、S6 組成骨細胞多于其他組。體內異位成骨誘導實驗示,術后 4 周 S1~S6 組植骨區域均可見軟骨和新骨生成,并且隨著 BMP-2 含量增加,材料誘導新骨生成越多,新骨形成評分較高(P<0.05);其中 S4、S6 組骨新生區域含有大量軟骨細胞和成骨細胞。結論BMP-2 定量檢測結合體外成骨細胞增殖分化實驗可用于評估 DBM 成骨活性。