引用本文： 吳彬, 陳磊, 李相晨, 于洪濤, 楊海, 梁相辰, 孫建華, 董金波. KLD-12多肽/重組人BMP-2凝膠誘導兔BMSCs成骨活性的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(12): 1518-1523. doi: 10.7507/1002-1892.20160314 復制
腰部疼痛是影響人們正常生活及工作的常見疾病，其中下腰椎不穩多見。下腰椎不穩的治療關鍵是椎管減壓和椎體融合，以為腰椎提供良好穩定性，有效緩解腰背部疼痛[1-3]。目前，自體骨移植是椎體間融合術中常用植骨方式，但自體骨移植手術時間長、出血量多，容易發生供區疼痛、感染及皮神經炎等并發癥[4-5]。為了解決自體骨移植相關問題，同種異體骨、人工骨等已廣泛應用于臨床，并取得了一定臨床療效[6-7]。但此類骨質缺乏誘導活性、成骨性差，骨不愈合率高[8]。迄今為止尚無理想的骨材料能替代自體骨移植。本實驗擬利用KLD-12多肽作為支架材料，復合細胞生長因子重組人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）誘導BMSCs向成骨細胞分化，探討其作為自體骨替代材料的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3月齡雄性新西蘭大白兔1只，體質量1.5 kg，由石河子大學醫學院實驗動物中心提供。L-DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；FBS、胰蛋白酶（HyClone公司，美國）；KLD-12多肽凍干粉（純度98.148%）、PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司）；rhBMP-2（PeproTech公司，美國）；骨鈣蛋白ELISA試劑盒（Cloud-Clone公司，美國）；ALP試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Ⅰ型膠原抗體（Abcam公司，美國）；TRizol（Invitrogen公司，美國）；反轉錄試劑盒（Thermo公司，美國）；快速定量PCR試劑組（Qiagen公司，德國）。5%CO2培養箱、實時熒光定量PCR儀（Thermo公司，美國)；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Zeiss公司，德國）；酶標儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 BMSCs分離培養
采用密度梯度法分離培養BMSCs。將新西蘭大白兔經耳緣靜脈注射10%水合氯醛麻醉后，以股骨大粗隆為進針點，于雙側骨髓腔內抽出骨髓共8?mL。將注射器至于超凈臺中進行操作，將骨髓與等量L-DMEM培養基在離心管中吹打混勻。另取一離心管加入3 mL Percoll細胞分離液，將骨髓培養基混合液緩緩加至其上，以離心半徑13 cm，2?000?r/ min離心15 min；離心后用移液器吸取中間單核細胞層于另一離心管中，加入適量L-DMEM培養基，混勻，以離心半徑13 cm，1 000 r/min離心5 min；棄上清，加入3 mL L-DMEM培養基，混勻，以離心半徑13 cm，1?000 r/min離心5 min；棄上清后，將細胞按1×105個/ cm2接種于培養皿中，加入含12%FBS的L-DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。48 h首次換液，以后每3天全量換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞生長至80%~90%融合時傳代。取3代細胞進行實驗。
1.3 實驗分組及方法
根據BMSCs培養方法不同，實驗分為兩組，實驗組應用KLD-12多肽/rhBMP-2凝膠三維培養，對照組應用KLD-12多肽培養。實驗組：將rhBMP-2（0.01 μg/μL）溶解于10%蔗糖溶液中，再將KLD-12多肽凍干粉劑溶于含有rhBMP-2的10%庶糖溶液中，震蕩30 min，配制成濃度為0.56%（W/V）的KLD/12多肽/rhBMP-2溶液。取第3代BMSCs，采用胰蛋白酶消化，制備成密度為1×107個/mL的細胞懸液，將細胞懸液滴加入KLD-12/多肽rhBMP-2溶液中，形成KLD-12多肽/rhBMP-2/BMSCs懸液復合物，KLD-12多肽溶液終濃度為0.5%，rhBMP-2終濃度為300 ng/mL。PBS緩沖液誘發KLD-12多肽/rhBMP-2/BMSCs懸液自組裝（37℃，20 min），棄除PBS，置于37℃、5%CO2及飽和培養箱中培養。
對照組：將KLD-12多肽凍干粉溶于10%蔗糖中，震蕩30 min，配成KLD-12多肽培養BMSCs，37℃、5%CO2培養箱中培養。
1.4 觀測指標
1.4.1 細胞形態觀察
將實驗組KLD-12多肽/rh BMP-2/BMSCs凝膠及對照組KLD-12多肽/BMSCs凝膠置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養，每2天更換1次培養基。培養7 d倒置相差顯微鏡觀察兩組細胞在凝膠內的大體形態。
1.4.2 ALP活性及骨鈣蛋白含量檢測
將實驗組KLD-12多肽/rhBMP-2/BMSCs凝膠及對照組KLD-12多肽∕BMSCs凝膠置于96孔培養板，每孔30?μL凝膠，每組6復孔。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養，每2天更換1次培養基。培養后3、7、10、14、21 d，采用ALP試劑盒檢測培養基中ALP活性，ELISA法測量骨鈣蛋白含量。
1.4.3 Ⅰ型膠原免疫熒光染色觀察
將實驗組KLD-12多肽/rhBMP-2/BMSCs凝膠及對照組KLD-12多肽∕BMSCs凝膠置于激光共聚焦培養皿內，每組3個培養皿。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養，每2天更換1次培養基。培養14 d行Ⅰ型膠原免疫熒光染色，對細胞核行碘化丙啶染色[9]，染色在避光條件下進行。激光共聚焦顯微鏡下觀察BMSCsⅠ型膠原表達情況，細胞質呈綠色熒光、細胞核呈紅色熒光為表達陽性。
1.4.4 實時熒光定量PCR檢測
將實驗組KLD-12多肽/rhBMP-2/BMSCs凝膠及對照組KLD-12多肽/BMSCs凝膠置于6孔培養板，每組3復孔；每2天更換1次培養基。培養14 d后，收集兩組BMSCs檢測Ⅰ型膠原和骨鈣蛋白基因表達。TRizol法提取細胞mRNA，反轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA。反應總體系20 μL；反應條件：預變性95℃、2 min；95℃、5?s，60℃、10 s，40個循環。以β-actin為內參對照，基因擴增引物序列見表 1。采用2-ΔΔCt標準化法計算各目的基因相對表達量。實驗重復3次。
表1
各基因引物序列及產物大小
Table1.
Primers sequences and product size of related genes
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs分離培養觀察
倒置相差顯微鏡下觀察，BMSCs多呈圓形或橢圓形，大量懸浮在培養基中。3~5 h后細胞貼壁，呈橢圓形，極少數細胞呈短梭形，散在分布；72 h可見梭形細胞逐漸增多，出現集落樣分布；7~10 d細胞明顯增殖，集落之間發生融合；10~14 d細胞融合至80%~90%，細胞主要呈梭形，核大、核仁明顯，呈旋渦狀或輻射狀生長。傳代后細胞生長均勻，增殖迅速，4~5 d即可傳1代；傳至第3代，細胞形態均一，呈梭形，分布均勻。見圖 1。
圖1
BMSCs形態觀察（倒置相差顯微鏡×10）?原代培養14 d ?第3代細胞??圖 2?培養7 d凝膠內BMSCs觀察（倒置相差顯微鏡×40）?實驗組 ?對照組??圖 3?各時間點兩組細胞培養基中ALP表達量??圖 4?各時間點兩組細胞培養基中骨鈣蛋白含量??圖 5?培養14 d Ⅰ型膠原免疫熒光染色觀察（激光共聚焦顯微鏡×200）?對照組?實驗組
Figure1.
Morphological observation of BMSCs (Inverted phase contrast microscope×10) ?Primary cells at 14 days ?The third generation cells ??Fig.2 Observation of BMSCs in the gel at 7 days (Inverted phase contrast microscope×40) ? Experimental group ? Control group ??Fig.3 ALP expression in cell culture medium of 2 groups at different time points ??Fig.4 Osteocalcin content in cell culture medium of 2 groups at different time points ??Fig.5 Observation of collagen type I immunofluorescence staining at 14 days (Laser scanning confocal microscope×200) ? Control group ? Experimental group
2.2 凝膠內細胞形態觀察
倒置相差顯微鏡下觀察，培養7 d實驗組與對照組凝膠內BMSCs均呈圓形，分布均勻，并有部分細胞增殖，呈團簇狀，細胞生長良好。見圖 2。
2.3 ALP活性及骨鈣蛋白含量測定
2.3.1 ALP
兩組細胞培養基中ALP表達量均隨時間延長呈升高趨勢，于14 d時達峰值，之后保持穩定水平。實驗組培養各時間點間比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。對照組培養3、7 d間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；10、14、21 d間比較差異有統計學意義（P < 0.05）；3、7 d與10、14、21 d比較差異有統計學意義（P < 0.05）。兩組3、7 d時ALP表達量比較差異無統計學意義（P > 0.05）；10~21 d實驗組ALP表達量明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3。
2.3.2 骨鈣蛋白
隨時間延長，實驗組骨鈣蛋白含量呈逐漸增高趨勢，培養3、7 d間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；10~21 d間比較差異有統計學意義（P < 0.05），且顯著高于3、7 d時，比較差異亦有統計學意義（P < 0.05）。對照組各時間點骨鈣蛋白含量無顯著變化，培養3、7、10 d間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；14、21 d間比較差異有統計學意義（P < 0.05）；3、7、10 d與14、21 d比較差異有統計學意義（P < 0.05）。各時間點實驗組骨鈣蛋白含量均高于對照組，除3、7?d差異無統計學意義（P > 0.05）外，10~21 d比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。
2.4 Ⅰ型膠原免疫熒光染色觀察
激光共聚焦顯微鏡觀察示，培養14 d實驗組Ⅰ型膠原分布于細胞質中，細胞核周圍Ⅰ型膠原較多；對照組細胞中Ⅰ型膠原表達量較少。見圖 5。
2.5 實時熒光定量PCR檢測
培養14 d實驗組Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白基因相對表達量分別為3.124±0.230、2.259±0.167，均顯著高于對照組的1.001±0.024、1.001±0.016，比較差異有統計學意義（t=15.902，P=.0000；t=12.998，P=0.000）。
3 討論
種子細胞、生長因子及細胞支架是組織工程的三大核心內容，BMSCs是存在于骨組織內的原始細胞，來源廣泛，是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，在不同誘導條件下能轉化為成骨細胞、軟骨細胞、髓核樣細胞等[10-12]，是骨、軟骨、韌帶等組織修復再生相關研究的重要種子細胞。本實驗利用BMSCs具有分化為成骨細胞的特性[13]，誘導BMSCs成骨，從而為椎體間發生融合提供實驗依據。BMP屬于TGF-β家族，因具有骨誘導活性而受到廣泛關注，目前發現的BMP家族成員已超過20種[14-15]。其中BMP-2研究最深入，其誘導成骨作用已得到證實[16]。研究表明[16-18]，rhBMP-2有促進BMSCs增殖的能力，并誘導和維持BMSCs成骨細胞表型。盡管rhBMP-2能誘導BMSCs向成骨細胞分化，在脊柱融合實驗中效果良好，但rhBMP-2復合在生物支架中能否發揮其誘導效應，進而減少因rhBMP-2劑量及濃度所致的并發癥[19-21]，還有待進一步研究。
目前，骨組織工程研究中采用的細胞支架可分為3類，分別為鈣磷陶瓷、天然高分子材料、人工合成的高分子多聚物。它們單獨使用時均存在不同缺點，如可塑性差、生物降解速度慢、可能引起免疫排斥反應及細胞吸附力差等。KLD-12多肽是由氨基酸構成的多肽結構，其親水基和疏水基交替排列，緊密結合成堅固的分子結構，被激發的KLD-12多肽自組裝后能夠緊密結合并維持一定形態，多肽表面具有一定彈性，內部多孔特性能夠促進營養物質擴散及細胞基質分泌。相關研究將軟骨細胞植入KLD-12多肽中進行體外三維培養，結果顯示KLD-12多肽能夠促進細胞外基質的分泌[22]。Sun等[23]將BMSCs復合于KLD-12多肽進行體外培養，結果顯示BMSCs在KLD-12多肽內生長良好，提示KLD-12多肽可以作為椎間盤組織工程中的支架材料。另外研究還發現，KLD-12多肽及其降解產物不誘導宿主發生免疫排斥反應及溶血反應，不影響種子細胞BMSCs的生物活性，具有良好生物相容性[24]。Bian等[25]研究表明，KLD-12多肽/TGF-β1明顯促進MSCs向髓核樣細胞分化，髓核樣細胞特異性細胞外基質表達明顯增高，以上研究為本實驗奠定了理論基礎。
本實驗以BMSCs為種子細胞，KLD-12多肽/rhBMP-2凝膠作為支架材料，研究BMSCs在KLD-12多肽/rhBMP-2凝膠內體外三維培養后的生長、分化及表型情況。培養7 d，倒置相差顯微鏡下觀察兩組凝膠內細胞生長狀況良好，分布均勻；活細胞形態以圓形為主。實驗組ALP活性與骨鈣蛋白含量均隨時間延長而逐漸增高，可能與KLD-12多肽的緩釋作用有關，KLD-12多肽緩慢釋放成骨誘導因子rhBMP-2，使得BMSCs的成骨細胞表型及功能穩定且持久。免疫熒光染色顯示，實驗組凝膠內細胞經誘導能大量分泌Ⅰ型膠原，與對照組相比綠色熒光范圍大、亮度強。實時熒光定量PCR觀測結果表明，實驗組Ⅰ型膠原和骨鈣蛋白表達水平較對照組明顯增高，提示rhBMP-2能顯著增加BMSCs向成骨細胞分化的生物活性，促進BMSCs向成骨細胞定向分化。ALP、Ⅰ型膠原及骨鈣蛋白是細胞誘導成骨后的特異性標志，ALP及Ⅰ型膠原在成骨早期分泌表達，而骨鈣蛋白是成骨細胞分化晚期的標志[26-27]，以上實驗特異性標志物表達的先后順序符合了成骨細胞礦化成骨過程。
綜上述，KLD-12多肽為BMSCs的生長提供了良好三維立體環境，凝膠內的BMSCs維持了正常細胞形態，并能夠正常增殖；KLD-12多肽/rhBMP-2凝膠內的BMSCs向成骨細胞分化，KLD-12多肽的緩釋及多孔特性使得rhBMP-2緩慢釋放且與BMSCs充分結合作用，保證了在基因及分子水平BMSCs骨誘導生物活性的持續、穩定表達。
腰部疼痛是影響人們正常生活及工作的常見疾病，其中下腰椎不穩多見。下腰椎不穩的治療關鍵是椎管減壓和椎體融合，以為腰椎提供良好穩定性，有效緩解腰背部疼痛[1-3]。目前，自體骨移植是椎體間融合術中常用植骨方式，但自體骨移植手術時間長、出血量多，容易發生供區疼痛、感染及皮神經炎等并發癥[4-5]。為了解決自體骨移植相關問題，同種異體骨、人工骨等已廣泛應用于臨床，并取得了一定臨床療效[6-7]。但此類骨質缺乏誘導活性、成骨性差，骨不愈合率高[8]。迄今為止尚無理想的骨材料能替代自體骨移植。本實驗擬利用KLD-12多肽作為支架材料，復合細胞生長因子重組人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）誘導BMSCs向成骨細胞分化，探討其作為自體骨替代材料的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3月齡雄性新西蘭大白兔1只，體質量1.5 kg，由石河子大學醫學院實驗動物中心提供。L-DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；FBS、胰蛋白酶（HyClone公司，美國）；KLD-12多肽凍干粉（純度98.148%）、PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司）；rhBMP-2（PeproTech公司，美國）；骨鈣蛋白ELISA試劑盒（Cloud-Clone公司，美國）；ALP試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Ⅰ型膠原抗體（Abcam公司，美國）；TRizol（Invitrogen公司，美國）；反轉錄試劑盒（Thermo公司，美國）；快速定量PCR試劑組（Qiagen公司，德國）。5%CO2培養箱、實時熒光定量PCR儀（Thermo公司，美國)；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Zeiss公司，德國）；酶標儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 BMSCs分離培養
采用密度梯度法分離培養BMSCs。將新西蘭大白兔經耳緣靜脈注射10%水合氯醛麻醉后，以股骨大粗隆為進針點，于雙側骨髓腔內抽出骨髓共8?mL。將注射器至于超凈臺中進行操作，將骨髓與等量L-DMEM培養基在離心管中吹打混勻。另取一離心管加入3 mL Percoll細胞分離液，將骨髓培養基混合液緩緩加至其上，以離心半徑13 cm，2?000?r/ min離心15 min；離心后用移液器吸取中間單核細胞層于另一離心管中，加入適量L-DMEM培養基，混勻，以離心半徑13 cm，1 000 r/min離心5 min；棄上清，加入3 mL L-DMEM培養基，混勻，以離心半徑13 cm，1?000 r/min離心5 min；棄上清后，將細胞按1×105個/ cm2接種于培養皿中，加入含12%FBS的L-DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。48 h首次換液，以后每3天全量換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞生長至80%~90%融合時傳代。取3代細胞進行實驗。
1.3 實驗分組及方法
根據BMSCs培養方法不同，實驗分為兩組，實驗組應用KLD-12多肽/rhBMP-2凝膠三維培養，對照組應用KLD-12多肽培養。實驗組：將rhBMP-2（0.01 μg/μL）溶解于10%蔗糖溶液中，再將KLD-12多肽凍干粉劑溶于含有rhBMP-2的10%庶糖溶液中，震蕩30 min，配制成濃度為0.56%（W/V）的KLD/12多肽/rhBMP-2溶液。取第3代BMSCs，采用胰蛋白酶消化，制備成密度為1×107個/mL的細胞懸液，將細胞懸液滴加入KLD-12/多肽rhBMP-2溶液中，形成KLD-12多肽/rhBMP-2/BMSCs懸液復合物，KLD-12多肽溶液終濃度為0.5%，rhBMP-2終濃度為300 ng/mL。PBS緩沖液誘發KLD-12多肽/rhBMP-2/BMSCs懸液自組裝（37℃，20 min），棄除PBS，置于37℃、5%CO2及飽和培養箱中培養。
對照組：將KLD-12多肽凍干粉溶于10%蔗糖中，震蕩30 min，配成KLD-12多肽培養BMSCs，37℃、5%CO2培養箱中培養。
1.4 觀測指標
1.4.1 細胞形態觀察
將實驗組KLD-12多肽/rh BMP-2/BMSCs凝膠及對照組KLD-12多肽/BMSCs凝膠置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養，每2天更換1次培養基。培養7 d倒置相差顯微鏡觀察兩組細胞在凝膠內的大體形態。
1.4.2 ALP活性及骨鈣蛋白含量檢測
將實驗組KLD-12多肽/rhBMP-2/BMSCs凝膠及對照組KLD-12多肽∕BMSCs凝膠置于96孔培養板，每孔30?μL凝膠，每組6復孔。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養，每2天更換1次培養基。培養后3、7、10、14、21 d，采用ALP試劑盒檢測培養基中ALP活性，ELISA法測量骨鈣蛋白含量。
1.4.3 Ⅰ型膠原免疫熒光染色觀察
將實驗組KLD-12多肽/rhBMP-2/BMSCs凝膠及對照組KLD-12多肽∕BMSCs凝膠置于激光共聚焦培養皿內，每組3個培養皿。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養，每2天更換1次培養基。培養14 d行Ⅰ型膠原免疫熒光染色，對細胞核行碘化丙啶染色[9]，染色在避光條件下進行。激光共聚焦顯微鏡下觀察BMSCsⅠ型膠原表達情況，細胞質呈綠色熒光、細胞核呈紅色熒光為表達陽性。
1.4.4 實時熒光定量PCR檢測
將實驗組KLD-12多肽/rhBMP-2/BMSCs凝膠及對照組KLD-12多肽/BMSCs凝膠置于6孔培養板，每組3復孔；每2天更換1次培養基。培養14 d后，收集兩組BMSCs檢測Ⅰ型膠原和骨鈣蛋白基因表達。TRizol法提取細胞mRNA，反轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA。反應總體系20 μL；反應條件：預變性95℃、2 min；95℃、5?s，60℃、10 s，40個循環。以β-actin為內參對照，基因擴增引物序列見表 1。采用2-ΔΔCt標準化法計算各目的基因相對表達量。實驗重復3次。
表1
各基因引物序列及產物大小
Table1.
Primers sequences and product size of related genes
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs分離培養觀察
倒置相差顯微鏡下觀察，BMSCs多呈圓形或橢圓形，大量懸浮在培養基中。3~5 h后細胞貼壁，呈橢圓形，極少數細胞呈短梭形，散在分布；72 h可見梭形細胞逐漸增多，出現集落樣分布；7~10 d細胞明顯增殖，集落之間發生融合；10~14 d細胞融合至80%~90%，細胞主要呈梭形，核大、核仁明顯，呈旋渦狀或輻射狀生長。傳代后細胞生長均勻，增殖迅速，4~5 d即可傳1代；傳至第3代，細胞形態均一，呈梭形，分布均勻。見圖 1。
圖1
BMSCs形態觀察（倒置相差顯微鏡×10）?原代培養14 d ?第3代細胞??圖 2?培養7 d凝膠內BMSCs觀察（倒置相差顯微鏡×40）?實驗組 ?對照組??圖 3?各時間點兩組細胞培養基中ALP表達量??圖 4?各時間點兩組細胞培養基中骨鈣蛋白含量??圖 5?培養14 d Ⅰ型膠原免疫熒光染色觀察（激光共聚焦顯微鏡×200）?對照組?實驗組
Figure1.
Morphological observation of BMSCs (Inverted phase contrast microscope×10) ?Primary cells at 14 days ?The third generation cells ??Fig.2 Observation of BMSCs in the gel at 7 days (Inverted phase contrast microscope×40) ? Experimental group ? Control group ??Fig.3 ALP expression in cell culture medium of 2 groups at different time points ??Fig.4 Osteocalcin content in cell culture medium of 2 groups at different time points ??Fig.5 Observation of collagen type I immunofluorescence staining at 14 days (Laser scanning confocal microscope×200) ? Control group ? Experimental group
2.2 凝膠內細胞形態觀察
倒置相差顯微鏡下觀察，培養7 d實驗組與對照組凝膠內BMSCs均呈圓形，分布均勻，并有部分細胞增殖，呈團簇狀，細胞生長良好。見圖 2。
2.3 ALP活性及骨鈣蛋白含量測定
2.3.1 ALP
兩組細胞培養基中ALP表達量均隨時間延長呈升高趨勢，于14 d時達峰值，之后保持穩定水平。實驗組培養各時間點間比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。對照組培養3、7 d間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；10、14、21 d間比較差異有統計學意義（P < 0.05）；3、7 d與10、14、21 d比較差異有統計學意義（P < 0.05）。兩組3、7 d時ALP表達量比較差異無統計學意義（P > 0.05）；10~21 d實驗組ALP表達量明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3。
2.3.2 骨鈣蛋白
隨時間延長，實驗組骨鈣蛋白含量呈逐漸增高趨勢，培養3、7 d間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；10~21 d間比較差異有統計學意義（P < 0.05），且顯著高于3、7 d時，比較差異亦有統計學意義（P < 0.05）。對照組各時間點骨鈣蛋白含量無顯著變化，培養3、7、10 d間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；14、21 d間比較差異有統計學意義（P < 0.05）；3、7、10 d與14、21 d比較差異有統計學意義（P < 0.05）。各時間點實驗組骨鈣蛋白含量均高于對照組，除3、7?d差異無統計學意義（P > 0.05）外，10~21 d比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。
2.4 Ⅰ型膠原免疫熒光染色觀察
激光共聚焦顯微鏡觀察示，培養14 d實驗組Ⅰ型膠原分布于細胞質中，細胞核周圍Ⅰ型膠原較多；對照組細胞中Ⅰ型膠原表達量較少。見圖 5。
2.5 實時熒光定量PCR檢測
培養14 d實驗組Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白基因相對表達量分別為3.124±0.230、2.259±0.167，均顯著高于對照組的1.001±0.024、1.001±0.016，比較差異有統計學意義（t=15.902，P=.0000；t=12.998，P=0.000）。
3 討論
種子細胞、生長因子及細胞支架是組織工程的三大核心內容，BMSCs是存在于骨組織內的原始細胞，來源廣泛，是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，在不同誘導條件下能轉化為成骨細胞、軟骨細胞、髓核樣細胞等[10-12]，是骨、軟骨、韌帶等組織修復再生相關研究的重要種子細胞。本實驗利用BMSCs具有分化為成骨細胞的特性[13]，誘導BMSCs成骨，從而為椎體間發生融合提供實驗依據。BMP屬于TGF-β家族，因具有骨誘導活性而受到廣泛關注，目前發現的BMP家族成員已超過20種[14-15]。其中BMP-2研究最深入，其誘導成骨作用已得到證實[16]。研究表明[16-18]，rhBMP-2有促進BMSCs增殖的能力，并誘導和維持BMSCs成骨細胞表型。盡管rhBMP-2能誘導BMSCs向成骨細胞分化，在脊柱融合實驗中效果良好，但rhBMP-2復合在生物支架中能否發揮其誘導效應，進而減少因rhBMP-2劑量及濃度所致的并發癥[19-21]，還有待進一步研究。
目前，骨組織工程研究中采用的細胞支架可分為3類，分別為鈣磷陶瓷、天然高分子材料、人工合成的高分子多聚物。它們單獨使用時均存在不同缺點，如可塑性差、生物降解速度慢、可能引起免疫排斥反應及細胞吸附力差等。KLD-12多肽是由氨基酸構成的多肽結構，其親水基和疏水基交替排列，緊密結合成堅固的分子結構，被激發的KLD-12多肽自組裝后能夠緊密結合并維持一定形態，多肽表面具有一定彈性，內部多孔特性能夠促進營養物質擴散及細胞基質分泌。相關研究將軟骨細胞植入KLD-12多肽中進行體外三維培養，結果顯示KLD-12多肽能夠促進細胞外基質的分泌[22]。Sun等[23]將BMSCs復合于KLD-12多肽進行體外培養，結果顯示BMSCs在KLD-12多肽內生長良好，提示KLD-12多肽可以作為椎間盤組織工程中的支架材料。另外研究還發現，KLD-12多肽及其降解產物不誘導宿主發生免疫排斥反應及溶血反應，不影響種子細胞BMSCs的生物活性，具有良好生物相容性[24]。Bian等[25]研究表明，KLD-12多肽/TGF-β1明顯促進MSCs向髓核樣細胞分化，髓核樣細胞特異性細胞外基質表達明顯增高，以上研究為本實驗奠定了理論基礎。
本實驗以BMSCs為種子細胞，KLD-12多肽/rhBMP-2凝膠作為支架材料，研究BMSCs在KLD-12多肽/rhBMP-2凝膠內體外三維培養后的生長、分化及表型情況。培養7 d，倒置相差顯微鏡下觀察兩組凝膠內細胞生長狀況良好，分布均勻；活細胞形態以圓形為主。實驗組ALP活性與骨鈣蛋白含量均隨時間延長而逐漸增高，可能與KLD-12多肽的緩釋作用有關，KLD-12多肽緩慢釋放成骨誘導因子rhBMP-2，使得BMSCs的成骨細胞表型及功能穩定且持久。免疫熒光染色顯示，實驗組凝膠內細胞經誘導能大量分泌Ⅰ型膠原，與對照組相比綠色熒光范圍大、亮度強。實時熒光定量PCR觀測結果表明，實驗組Ⅰ型膠原和骨鈣蛋白表達水平較對照組明顯增高，提示rhBMP-2能顯著增加BMSCs向成骨細胞分化的生物活性，促進BMSCs向成骨細胞定向分化。ALP、Ⅰ型膠原及骨鈣蛋白是細胞誘導成骨后的特異性標志，ALP及Ⅰ型膠原在成骨早期分泌表達，而骨鈣蛋白是成骨細胞分化晚期的標志[26-27]，以上實驗特異性標志物表達的先后順序符合了成骨細胞礦化成骨過程。
綜上述，KLD-12多肽為BMSCs的生長提供了良好三維立體環境，凝膠內的BMSCs維持了正常細胞形態，并能夠正常增殖；KLD-12多肽/rhBMP-2凝膠內的BMSCs向成骨細胞分化，KLD-12多肽的緩釋及多孔特性使得rhBMP-2緩慢釋放且與BMSCs充分結合作用，保證了在基因及分子水平BMSCs骨誘導生物活性的持續、穩定表達。
