引用本文： 俞莉敏, 馬俊軒, 于濱生. 基因修飾人BMSCs構建組織工程骨的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(12): 1512-1517. doi: 10.7507/1002-1892.20160313 復制
自體骨植骨促進骨組織再生愈合是臨床治療骨缺損和脊柱融合的經典方法，重組BMP蛋白類的骨誘導因子也已廣泛應用于臨床，但自體骨取骨并發癥和來源不足以及重組蛋白的異化致炎性和釋放不可控性等問題常會影響臨床療效，研發促進骨再生的新方法意義重大[1-2]。骨再生需要在局部和特定時間內釋放足量骨誘導因子，同時需要大量細胞對這些誘導因子產生生物應答[3]。基因治療通過將成骨基因導入細胞，在提供大量細胞的同時，實現高活性BMP蛋白因子的持久表達及釋放[4]。為取得更高的安全性，避免病毒載體的高免疫原性及與內源性病毒重組的風險[5]，以及同種異體細胞或異種基因引發的免疫問題，本研究擬將同源性人BMP-2（human BMP-2，hBMP-2）基因以質粒為載體導入自體干細胞，構建穩定表達分泌hBMP-2的組織工程骨，以滿足骨再生修復的3個基本要素，促進骨再生修復。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6周齡裸鼠12只，雌雄不限，體質量18~26 g，由上海實驗動物中心提供。實驗用骨髓及肌肉組織均由2014年9月-12月于北京大學深圳醫院骨科行手術治療患者自愿捐獻。羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）成品載體由蘇州大學材料工程學院提供。
ALP REAGENT試劑盒、總蛋白含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。LK40倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；Bio-Rad凝膠成像系統（Bio-Rad公司，美國）；JSE840掃描電鏡（JEOL公司，日本）。
1.2 人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）的分離培養
取自愿捐髓者骨髓，按文獻[6]方法采用Percoll淋巴細胞分離液梯度離心分離，含20%FBS的DMEM培養基培養；流式細胞儀分析驗證細胞表型CD29、CD34、CD44、CD45抗體表達，并適時傳代備用。以第2代細胞進行后續實驗。
取部分第2代細胞以成骨誘導培養基（含1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL抗壞血酸的DMEM培養基）進行成骨誘導培養，備用。
1.3 hBMP-2全長基因的真核表達載體構建及轉染hBMSCs
根據hBMP-2蛋白全長cDNA的1 188 bp序列，以成人肌肉組織的總RNA為模板，行巢式RT-PCR反應擴增hBMP-2全長基因，T-A克隆連接入pUCmT載體。然后分別將pcDNA3載體和基因pUCmT質粒以核酸內切酶HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后，連接構建pcDNA3-hBMP-2真核質粒，雙酶切電泳鑒定。
取第2代正常培養hBMSCs，以4×105個/孔接種至6孔培養板中，每孔加入以DMEM稀釋的pcD NA3-hBMP-2質粒DNA和脂質體的混和物400 μL，常規培養孵育細胞和DNA-脂質體復合物8 h，然后采用含20%FBS的DMEM培養基培養轉染18 h，作為實驗組。以同上方法建立的脂質體加空pcDNA3質粒載體轉染細胞為陰性對照組，正常培養同代細胞為空白對照組。
1.4 轉染細胞的生物學性狀觀察及其外源基因表達蛋白的檢測
1.4.1 細胞生物學性狀觀察
取上述3組細胞以250 μg/mL G418培養基進行篩選培養，每天采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態和生長情況，篩選培養細胞備用。
1.4.2 細胞ALP比活性測定
取上述3組細胞，在24孔培養板中分別以正常培養和G418篩選培養1周后，各孔經PBS漂洗3次，加0.1%Triton-X 100細胞裂解液、PBS緩沖液、ALP基質液及顯色劑，于紫外分光光度計520 nm處測定吸光度（A）值，行ALP比活性測定。具體步驟按ALP REAGENT試劑盒說明書以及總蛋白含量測定試劑盒說明書進行。
1.4.3 免疫組織化學染色觀察
取1.4.1篩選培養后實驗組及陰性對照組細胞以及正常培養的空白對照組細胞消化，調整細胞濃度為5×105個/mL，以2 mL/孔加入6孔培養板中的多聚賴氨酸浸泡過的蓋玻片上，6 h后細胞爬片貼壁，然后正常培養48 h和3周后，分別行細胞表達和分泌hBMP-2蛋白的免疫組織化學染色，倒置相差顯微鏡觀察，以細胞質呈棕黃色著色為陽性。
1.4.4 RT-PCR檢測細胞hBMP-2 mRNA表達
取1.4.1篩選培養后實驗組及陰性對照組細胞以及正常培養的空白對照組細胞，正常培養48 h和3周后，棄培養液，分別提取細胞總RNA，行RT-PCR后電泳，Bio-Rad凝膠成像系統觀察電泳膠結果，分析瞬時（48 h）和穩定（3周）的轉染基因hBMP-2 mRNA表達程度。
1.4.5 免疫酶斑點（dot-ELISA）測定
取1.4.1篩選培養后實驗組及陰性對照組以及正常培養的空白對照組細胞，正常培養48 h和3周后，吸取細胞培養上清，在半透膜和聚已二醇6000的透析作用下，濃縮上清內蛋白，在硝酸纖維膜上行dot-ELISA測定，根據有無顯色反應判斷結果為陽性或陰性。
1.5 轉染細胞組織工程骨的構建和裸鼠體內誘導成骨觀察
1.5.1 轉染細胞與HA復合培養構建組織工程骨的觀察
取上述3組細胞，在24孔板中以1×106個/100 μL接種至2 mm×2 mm×2 mm HA成品載體上，以含20%FBS的DMEM培養基復合培養。培養3 d后用倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞在HA材料表面的生長狀態。
1.5.2 轉染細胞組織工程骨裸鼠體內誘導成骨觀察
取12只6周齡裸鼠隨機分4組，每組3只。A組取背部正中切口暴露雙側背脊肌，植入2 mm×2 mm×2 mm的hBMP-2轉染細胞與HA培養復合體；B組同上法植入空載質粒轉染細胞與HA培養的復合體；C組于背脊肌內直接注射濃度為1×105個/100 μL的同期培養的轉染細胞懸液100 μL；D組背脊肌內直接注射脂質體與hBMP-2質粒各10 μL的混合液。4周后取材，固定，脫鈣，組織切片，行HE染色和阿爾新藍染色觀察。
1.6 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs培養鑒定
經流式細胞儀分析顯示，分離培養細胞CD29表達率為93.43%，CD44為87.66%，而CD34表達率為4.40%，CD45為5.19%，符合hBMSCs的特性。
2.2 hBMP-2全長基因的真核表達載體構建
采用巢式RT-PCR方法從人肌肉組織內擴增出hBMP-2全長cDNA基因1 188 bp，經基因測序與GenBank的hBMP-2序列完全相符。將pUCmT-hBMP-2質粒與pcDNA3載體以HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后連接，酶切電泳證實成功構建pcDNA3-hBMP-2真核表達載體。見圖 1。
圖1
pcDNA3-hBMP-2轉化陽性克隆菌落，雙酶切電泳驗證（L2、L4成功）L0：100 bpDNA Marker L1~6：pcDNA3-hBMP-2轉化陽性克隆菌落??圖 2?實驗組轉染細胞經G418篩選形成抗性細胞克隆（倒置相差顯微鏡×100）??圖 3?實驗組培養3周免疫組織化學染色呈陽性（倒置相差顯微鏡×100）??圖 4?掃描電鏡觀察實驗組轉染細胞在HA材料表面的生長狀態（×1 000）?細胞貼附于HA表面?部分細胞表面有顆粒狀鈣鹽結晶沉積??圖 5?各組材料植入裸鼠體內4周后HE染色觀察（×100）? A組HA溶解成空白區域（藍箭頭），周邊有骨（綠箭頭）與軟骨細胞及骨基質（黑箭頭）? B組? C組?D組??圖 6?各組材料植入裸鼠體內4周后阿爾新藍染色觀察（×100）? A組? B組?C組? D組
Figure1.
Electrophoresis photo of the positive transfection clone of pcDNA3-hBMP-2 after double enzyme digestion L0: 100 bp DNA marker L1-6: The positive transfection clones of pcDNA3-hBMP-2 ??Fig.2 G418-resistance cell clone of transfected hBMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ??Fig.3 Positive immunohistochemical staining of G418-resistance cell clone (Inverted phase contrast microscope×100) ??Fig.4 The growth state of transfected hBMSCs in experimental group attaching on the surface of HA under scanning electron microscope (×1 000) ? The transfected hBMSCs in experimental group attaching and growing on the surface of HA ? The transfected hBMSCs attaching to the surface of HA with granular calcium salt deposit ??Fig.5 Histological observation of new bone formation in nude mice by HE staining (×100) ? Group A Bone (green arrow) and cartilage cells and bone matrix formation (black arrow) around the ghost area after HA dissolution (blue arrow) ? Group B ? Group C ? Group D ??Fig.6 Histological observation of endochondral ossification in nude mice by alcian blue staining (×100) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D
2.3 轉染細胞生物學性狀觀察及其外源基因表達蛋白的檢測
2.3.1 細胞生物學性狀觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，實驗組及陰性對照組轉染后細胞成簇樣生長聚集，有較多類似鈣結節樣變化形成，經篩選培養2周后得到了抗性細胞克隆（圖 2）；而空白對照組細胞在篩選1周內全部死亡，證明基因轉染成功。
2.3.2 ALP比活性測定
正常培養1周的實驗組、陰性對照組及空白對照組細胞ALP比活性分別為（0.43±0.02）、（0.22±0.02）、（0.24±0.01）U/ mg，實驗組明顯高于其余兩組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。
經篩選培養1周的3組細胞中，除空白對照組細胞全部死亡外，實驗組ALP比活性為（0.77±0.03）U/ mg，明顯高于陰性對照組的（0.25±0.01）U/mg，比較差異有統計學意義（t=38.10，P=0.00）；且高于正常培養條件下的實驗組，差異有統計學意義（t=-19.17，P=0.00）。
2.3.3 免疫組織化學染色觀察
免疫組織化學染色顯示，實驗組轉染細胞篩選培養后成簇樣生長并形成類似鈣結節，經培養48 h和3周后，細胞質內均出現強陽性表達棕色顆粒樣結果（圖 3）。陰性對照組及空白對照組均未見陽性表達。
2.3.4 RT-PCR和dot-ELISA檢測
實驗組培養48 h和3周后，經RT-PCR和dot-ELISA檢測均能轉錄和表達hBMP-2，通過對RT-PCR陽性表達的電泳條帶灰度和dot-ELISA的顯色反應強度比較，顯示48 h瞬時的hBMP-2 mRNA轉錄表達程度較3周時更強；而陰性對照組和空白對照組細胞RT-PCR和dot-ELISA檢測均為陰性表達。
2.4 轉染細胞組織工程骨的構建和裸鼠體內誘導成骨觀察
2.4.1 轉染細胞與HA復合培養觀察
倒置相差顯微鏡及掃描電鏡觀察示，復合培養3 d后實驗組及陰性對照組轉染細胞良好貼附于HA表面，多為單層結構，有數個突起，部分細胞在HA表面伸展并深入到HA材料的孔隙內（圖 4a），也有部分細胞在微孔附近連接成片，細胞表面多數有顆粒狀鈣鹽結晶沉積（圖 4b），細胞間有較多絮狀細胞外基質產生。實驗組細胞與空白對照組正常細胞在HA材料上的貼附及形態、增殖方面無明顯差異。
2.4.2 轉染細胞組織工程骨裸鼠體內誘導成骨觀察
HE染色及阿爾新藍染色示，A組植入4周后，3只裸鼠6側背脊肌內，4側（66.67%）有明顯的新骨形成，HA材料被脫鈣處理后溶解形成空白區域，在該區域周邊可見少部分板狀成熟骨組織，周圍軟骨細胞及其基質較多；軟骨細胞分泌酸性黏多糖，阿爾新藍染色呈陽性。B組植入后，僅1只雙側（33.33%）有新骨形成，周邊有少量藍染陽性的軟骨細胞及基質正在形成；C組植入轉染細胞懸液后，3只6側背脊肌中可見部分間充質細胞聚集，均未見成骨或成軟骨表現；D組注射脂質體和hBMP-2質粒混合液后，僅1只1側（16.67%）可見少許骨形成，周邊可見少許軟骨基質。見圖 5、6。
3 討論
骨的修復和融合過程是一個復雜而高度有序的過程，期間有大量細胞和生長因子的系統性參與和協調作用，最終在待修復局部形成新骨融合。在成骨修復過程中有3個基本要素：能分化的原始骨祖細胞、足量的骨誘導因子以及骨生長的傳導性物質。目前國內外臨床為促進骨修復和脊柱融合，應用較多的是自體骨、同種異體骨和異種骨移植以及重組成骨因子，然而自體骨的有限性、同種異體及異種骨的免疫原性，以及重組因子體內釋放模式的非生理性，都在臨床應用上產生了較大限制。實驗研究中，重組蛋白的異化致炎性和釋放不可控性、人與動物之間蛋白基因的非完全同源性、逆轉錄病毒載體轉染基因表達的不可控性，以及單一組織工程材料免疫原性和成骨不確定性等因素，也一直困擾著研究者[7-8]。基因組織工程骨進行下一步臨床試用的前提，必須是由人類基因修飾表達的人類細胞構建成的組織工程骨（人與動物之間蛋白基因非完全同源性，人類細胞表達分泌的蛋白應選擇同源性的人基因構建）。我們的實驗以骨科及脊柱外科臨床應用為目標，采用擴增于人肌肉組織的hBMP-2基因，通過質粒載體轉染hBMSCs，構建可穩定表達良好活性的hBMP-2蛋白的骨種子細胞。并且與HA復合培養構建可用于人體的組織工程骨，實現成骨因子緩釋的同時，提供足量可誘導成骨分化的骨前體細胞和骨傳導支架，滿足骨再生修復的3個基本要素，達到解決以上問題，利于基礎實驗成果向臨床應用轉化，促進骨再生修復的目的。裸鼠體內實驗表明，轉染hBMP-2的hBMSCs復合HA材料后可顯著促進新骨再生，其軟骨細胞的形成聚集和新骨生成均優于空載質粒轉染的hBMSCs復合HA材料，提示hBMP-2的穩定表達分泌在促進骨再生的過程中是十分必要和有效的。實驗為降低下一步臨床應用的風險，通過一系列設計操作的優化，比如脂質體質粒載體相對病毒載體更低的免疫原性和更低的基因失控表達的風險性，以及同源基因在同源細胞中表達同源蛋白的非免疫原性，使基因治療結合組織工程的方法更安全以及更接近臨床轉化應用。在實驗驗證后，對于臨床極為復雜且目前極難解決的個體病例，可在征得患者同意及倫理審批下，采用患者自體hBMSCs及自體組織擴增hBMP-2基因構建的可穩定表達hBMP-2的基因組織工程骨試用于臨床。
hBMP-2誘導細胞成骨分化，促進骨組織再生已得到大量研究證實[9-10]。本研究中，hBMP-2基因質粒轉染hBMSCs后，RT-PCR和免疫組織化學染色顯示48 h和3周的轉染細胞均能轉錄和表達hBMP-2，且48 h瞬時的hBMP-2 mRNA轉錄表達程度較3周時穩定表達時更強，hBMSCs的成骨分化標志ALP染色水平顯著增高，細胞上清的dot-ELISA檢測結果也證實hBMP-2表達良好并可分泌到細胞外。質粒作為載體介導的基因轉染為瞬時轉染，所導入的基因表達時間相對有限。本研究發現，質粒介導hBMP-2轉染hBMSCs后，3周時hBMP-2的表達水平雖然相對于轉染48 h后逐漸變弱，但仍能穩定表達，質粒作為基因載體雖無法像逆轉錄病毒載體轉染實現基因的持久性表達，但也仍能滿足體外誘導MSCs成骨分化，體內促進新骨生成。同時，逆轉錄病毒載體轉染基因的失控性和無限期表達在實際應用上存在更多風險及并發癥，因此質粒作為基因載體具有更明顯的安全性和優越性[11-12]。
MSCs分化為成骨細胞依賴于細胞的黏附和細胞外基質的分泌[13-15]，本研究在hBMP-2基因轉染的hBMSCs與HA材料復合培養3 d后，用掃描電鏡及倒置相差顯微鏡對其表面進行評價，發現hBMSCs在HA表面具有良好的黏附生長特性，同時hBM SCs可在HA表面合成細胞外基質，此結果與既往研究一致[16]。單純植入hBMP-2轉染細胞時，由于hBMP-2細胞植入體內缺乏相應支架介導細胞黏附并合成細胞外基質，因此難以促進裸鼠肌肉組織成骨。此外HA材料由于其表面釋放的鈣離子可直接促進細胞成骨分化，也可能是其中一個重要影響因素[17-19]。
來自于外源性基因表達產物、基因載體以及BMSCs的免疫原性是組織工程及基因治療臨床轉化的重要障礙[20-21]。我們研究聯合應用基因工程和組織工程降低風險，將同源性hBMP-2基因導入hBM SCs構建穩定表達分泌hBMP-2的組織工程骨，人體細胞轉染人源基因，表達分泌人源蛋白，相對降低種源之間的免疫原性；采用質粒作為基因轉染的載體相對病毒載體免疫原性更低，在體外完成hBM SCs的轉染后再植入體內，相對于直接將質粒導入體內進一步降低了免疫反應風險。本研究通過一系列優化，在提供骨再生修復3個基本要素的同時，使基因治療結合組織工程的方法更為安全、更接近于臨床轉化應用。但裸鼠體內驗證成骨的實驗還處于臨床應用前的初步階段，臨床轉化還需要基于此的靈長類大動物實驗和臨床試用進一步驗證。
自體骨植骨促進骨組織再生愈合是臨床治療骨缺損和脊柱融合的經典方法，重組BMP蛋白類的骨誘導因子也已廣泛應用于臨床，但自體骨取骨并發癥和來源不足以及重組蛋白的異化致炎性和釋放不可控性等問題常會影響臨床療效，研發促進骨再生的新方法意義重大[1-2]。骨再生需要在局部和特定時間內釋放足量骨誘導因子，同時需要大量細胞對這些誘導因子產生生物應答[3]。基因治療通過將成骨基因導入細胞，在提供大量細胞的同時，實現高活性BMP蛋白因子的持久表達及釋放[4]。為取得更高的安全性，避免病毒載體的高免疫原性及與內源性病毒重組的風險[5]，以及同種異體細胞或異種基因引發的免疫問題，本研究擬將同源性人BMP-2（human BMP-2，hBMP-2）基因以質粒為載體導入自體干細胞，構建穩定表達分泌hBMP-2的組織工程骨，以滿足骨再生修復的3個基本要素，促進骨再生修復。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6周齡裸鼠12只，雌雄不限，體質量18~26 g，由上海實驗動物中心提供。實驗用骨髓及肌肉組織均由2014年9月-12月于北京大學深圳醫院骨科行手術治療患者自愿捐獻。羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）成品載體由蘇州大學材料工程學院提供。
ALP REAGENT試劑盒、總蛋白含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。LK40倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；Bio-Rad凝膠成像系統（Bio-Rad公司，美國）；JSE840掃描電鏡（JEOL公司，日本）。
1.2 人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）的分離培養
取自愿捐髓者骨髓，按文獻[6]方法采用Percoll淋巴細胞分離液梯度離心分離，含20%FBS的DMEM培養基培養；流式細胞儀分析驗證細胞表型CD29、CD34、CD44、CD45抗體表達，并適時傳代備用。以第2代細胞進行后續實驗。
取部分第2代細胞以成骨誘導培養基（含1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL抗壞血酸的DMEM培養基）進行成骨誘導培養，備用。
1.3 hBMP-2全長基因的真核表達載體構建及轉染hBMSCs
根據hBMP-2蛋白全長cDNA的1 188 bp序列，以成人肌肉組織的總RNA為模板，行巢式RT-PCR反應擴增hBMP-2全長基因，T-A克隆連接入pUCmT載體。然后分別將pcDNA3載體和基因pUCmT質粒以核酸內切酶HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后，連接構建pcDNA3-hBMP-2真核質粒，雙酶切電泳鑒定。
取第2代正常培養hBMSCs，以4×105個/孔接種至6孔培養板中，每孔加入以DMEM稀釋的pcD NA3-hBMP-2質粒DNA和脂質體的混和物400 μL，常規培養孵育細胞和DNA-脂質體復合物8 h，然后采用含20%FBS的DMEM培養基培養轉染18 h，作為實驗組。以同上方法建立的脂質體加空pcDNA3質粒載體轉染細胞為陰性對照組，正常培養同代細胞為空白對照組。
1.4 轉染細胞的生物學性狀觀察及其外源基因表達蛋白的檢測
1.4.1 細胞生物學性狀觀察
取上述3組細胞以250 μg/mL G418培養基進行篩選培養，每天采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態和生長情況，篩選培養細胞備用。
1.4.2 細胞ALP比活性測定
取上述3組細胞，在24孔培養板中分別以正常培養和G418篩選培養1周后，各孔經PBS漂洗3次，加0.1%Triton-X 100細胞裂解液、PBS緩沖液、ALP基質液及顯色劑，于紫外分光光度計520 nm處測定吸光度（A）值，行ALP比活性測定。具體步驟按ALP REAGENT試劑盒說明書以及總蛋白含量測定試劑盒說明書進行。
1.4.3 免疫組織化學染色觀察
取1.4.1篩選培養后實驗組及陰性對照組細胞以及正常培養的空白對照組細胞消化，調整細胞濃度為5×105個/mL，以2 mL/孔加入6孔培養板中的多聚賴氨酸浸泡過的蓋玻片上，6 h后細胞爬片貼壁，然后正常培養48 h和3周后，分別行細胞表達和分泌hBMP-2蛋白的免疫組織化學染色，倒置相差顯微鏡觀察，以細胞質呈棕黃色著色為陽性。
1.4.4 RT-PCR檢測細胞hBMP-2 mRNA表達
取1.4.1篩選培養后實驗組及陰性對照組細胞以及正常培養的空白對照組細胞，正常培養48 h和3周后，棄培養液，分別提取細胞總RNA，行RT-PCR后電泳，Bio-Rad凝膠成像系統觀察電泳膠結果，分析瞬時（48 h）和穩定（3周）的轉染基因hBMP-2 mRNA表達程度。
1.4.5 免疫酶斑點（dot-ELISA）測定
取1.4.1篩選培養后實驗組及陰性對照組以及正常培養的空白對照組細胞，正常培養48 h和3周后，吸取細胞培養上清，在半透膜和聚已二醇6000的透析作用下，濃縮上清內蛋白，在硝酸纖維膜上行dot-ELISA測定，根據有無顯色反應判斷結果為陽性或陰性。
1.5 轉染細胞組織工程骨的構建和裸鼠體內誘導成骨觀察
1.5.1 轉染細胞與HA復合培養構建組織工程骨的觀察
取上述3組細胞，在24孔板中以1×106個/100 μL接種至2 mm×2 mm×2 mm HA成品載體上，以含20%FBS的DMEM培養基復合培養。培養3 d后用倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞在HA材料表面的生長狀態。
1.5.2 轉染細胞組織工程骨裸鼠體內誘導成骨觀察
取12只6周齡裸鼠隨機分4組，每組3只。A組取背部正中切口暴露雙側背脊肌，植入2 mm×2 mm×2 mm的hBMP-2轉染細胞與HA培養復合體；B組同上法植入空載質粒轉染細胞與HA培養的復合體；C組于背脊肌內直接注射濃度為1×105個/100 μL的同期培養的轉染細胞懸液100 μL；D組背脊肌內直接注射脂質體與hBMP-2質粒各10 μL的混合液。4周后取材，固定，脫鈣，組織切片，行HE染色和阿爾新藍染色觀察。
1.6 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs培養鑒定
經流式細胞儀分析顯示，分離培養細胞CD29表達率為93.43%，CD44為87.66%，而CD34表達率為4.40%，CD45為5.19%，符合hBMSCs的特性。
2.2 hBMP-2全長基因的真核表達載體構建
采用巢式RT-PCR方法從人肌肉組織內擴增出hBMP-2全長cDNA基因1 188 bp，經基因測序與GenBank的hBMP-2序列完全相符。將pUCmT-hBMP-2質粒與pcDNA3載體以HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后連接，酶切電泳證實成功構建pcDNA3-hBMP-2真核表達載體。見圖 1。
圖1
pcDNA3-hBMP-2轉化陽性克隆菌落，雙酶切電泳驗證（L2、L4成功）L0：100 bpDNA Marker L1~6：pcDNA3-hBMP-2轉化陽性克隆菌落??圖 2?實驗組轉染細胞經G418篩選形成抗性細胞克隆（倒置相差顯微鏡×100）??圖 3?實驗組培養3周免疫組織化學染色呈陽性（倒置相差顯微鏡×100）??圖 4?掃描電鏡觀察實驗組轉染細胞在HA材料表面的生長狀態（×1 000）?細胞貼附于HA表面?部分細胞表面有顆粒狀鈣鹽結晶沉積??圖 5?各組材料植入裸鼠體內4周后HE染色觀察（×100）? A組HA溶解成空白區域（藍箭頭），周邊有骨（綠箭頭）與軟骨細胞及骨基質（黑箭頭）? B組? C組?D組??圖 6?各組材料植入裸鼠體內4周后阿爾新藍染色觀察（×100）? A組? B組?C組? D組
Figure1.
Electrophoresis photo of the positive transfection clone of pcDNA3-hBMP-2 after double enzyme digestion L0: 100 bp DNA marker L1-6: The positive transfection clones of pcDNA3-hBMP-2 ??Fig.2 G418-resistance cell clone of transfected hBMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ??Fig.3 Positive immunohistochemical staining of G418-resistance cell clone (Inverted phase contrast microscope×100) ??Fig.4 The growth state of transfected hBMSCs in experimental group attaching on the surface of HA under scanning electron microscope (×1 000) ? The transfected hBMSCs in experimental group attaching and growing on the surface of HA ? The transfected hBMSCs attaching to the surface of HA with granular calcium salt deposit ??Fig.5 Histological observation of new bone formation in nude mice by HE staining (×100) ? Group A Bone (green arrow) and cartilage cells and bone matrix formation (black arrow) around the ghost area after HA dissolution (blue arrow) ? Group B ? Group C ? Group D ??Fig.6 Histological observation of endochondral ossification in nude mice by alcian blue staining (×100) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D
2.3 轉染細胞生物學性狀觀察及其外源基因表達蛋白的檢測
2.3.1 細胞生物學性狀觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，實驗組及陰性對照組轉染后細胞成簇樣生長聚集，有較多類似鈣結節樣變化形成，經篩選培養2周后得到了抗性細胞克隆（圖 2）；而空白對照組細胞在篩選1周內全部死亡，證明基因轉染成功。
2.3.2 ALP比活性測定
正常培養1周的實驗組、陰性對照組及空白對照組細胞ALP比活性分別為（0.43±0.02）、（0.22±0.02）、（0.24±0.01）U/ mg，實驗組明顯高于其余兩組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。
經篩選培養1周的3組細胞中，除空白對照組細胞全部死亡外，實驗組ALP比活性為（0.77±0.03）U/ mg，明顯高于陰性對照組的（0.25±0.01）U/mg，比較差異有統計學意義（t=38.10，P=0.00）；且高于正常培養條件下的實驗組，差異有統計學意義（t=-19.17，P=0.00）。
2.3.3 免疫組織化學染色觀察
免疫組織化學染色顯示，實驗組轉染細胞篩選培養后成簇樣生長并形成類似鈣結節，經培養48 h和3周后，細胞質內均出現強陽性表達棕色顆粒樣結果（圖 3）。陰性對照組及空白對照組均未見陽性表達。
2.3.4 RT-PCR和dot-ELISA檢測
實驗組培養48 h和3周后，經RT-PCR和dot-ELISA檢測均能轉錄和表達hBMP-2，通過對RT-PCR陽性表達的電泳條帶灰度和dot-ELISA的顯色反應強度比較，顯示48 h瞬時的hBMP-2 mRNA轉錄表達程度較3周時更強；而陰性對照組和空白對照組細胞RT-PCR和dot-ELISA檢測均為陰性表達。
2.4 轉染細胞組織工程骨的構建和裸鼠體內誘導成骨觀察
2.4.1 轉染細胞與HA復合培養觀察
倒置相差顯微鏡及掃描電鏡觀察示，復合培養3 d后實驗組及陰性對照組轉染細胞良好貼附于HA表面，多為單層結構，有數個突起，部分細胞在HA表面伸展并深入到HA材料的孔隙內（圖 4a），也有部分細胞在微孔附近連接成片，細胞表面多數有顆粒狀鈣鹽結晶沉積（圖 4b），細胞間有較多絮狀細胞外基質產生。實驗組細胞與空白對照組正常細胞在HA材料上的貼附及形態、增殖方面無明顯差異。
2.4.2 轉染細胞組織工程骨裸鼠體內誘導成骨觀察
HE染色及阿爾新藍染色示，A組植入4周后，3只裸鼠6側背脊肌內，4側（66.67%）有明顯的新骨形成，HA材料被脫鈣處理后溶解形成空白區域，在該區域周邊可見少部分板狀成熟骨組織，周圍軟骨細胞及其基質較多；軟骨細胞分泌酸性黏多糖，阿爾新藍染色呈陽性。B組植入后，僅1只雙側（33.33%）有新骨形成，周邊有少量藍染陽性的軟骨細胞及基質正在形成；C組植入轉染細胞懸液后，3只6側背脊肌中可見部分間充質細胞聚集，均未見成骨或成軟骨表現；D組注射脂質體和hBMP-2質粒混合液后，僅1只1側（16.67%）可見少許骨形成，周邊可見少許軟骨基質。見圖 5、6。
3 討論
骨的修復和融合過程是一個復雜而高度有序的過程，期間有大量細胞和生長因子的系統性參與和協調作用，最終在待修復局部形成新骨融合。在成骨修復過程中有3個基本要素：能分化的原始骨祖細胞、足量的骨誘導因子以及骨生長的傳導性物質。目前國內外臨床為促進骨修復和脊柱融合，應用較多的是自體骨、同種異體骨和異種骨移植以及重組成骨因子，然而自體骨的有限性、同種異體及異種骨的免疫原性，以及重組因子體內釋放模式的非生理性，都在臨床應用上產生了較大限制。實驗研究中，重組蛋白的異化致炎性和釋放不可控性、人與動物之間蛋白基因的非完全同源性、逆轉錄病毒載體轉染基因表達的不可控性，以及單一組織工程材料免疫原性和成骨不確定性等因素，也一直困擾著研究者[7-8]。基因組織工程骨進行下一步臨床試用的前提，必須是由人類基因修飾表達的人類細胞構建成的組織工程骨（人與動物之間蛋白基因非完全同源性，人類細胞表達分泌的蛋白應選擇同源性的人基因構建）。我們的實驗以骨科及脊柱外科臨床應用為目標，采用擴增于人肌肉組織的hBMP-2基因，通過質粒載體轉染hBMSCs，構建可穩定表達良好活性的hBMP-2蛋白的骨種子細胞。并且與HA復合培養構建可用于人體的組織工程骨，實現成骨因子緩釋的同時，提供足量可誘導成骨分化的骨前體細胞和骨傳導支架，滿足骨再生修復的3個基本要素，達到解決以上問題，利于基礎實驗成果向臨床應用轉化，促進骨再生修復的目的。裸鼠體內實驗表明，轉染hBMP-2的hBMSCs復合HA材料后可顯著促進新骨再生，其軟骨細胞的形成聚集和新骨生成均優于空載質粒轉染的hBMSCs復合HA材料，提示hBMP-2的穩定表達分泌在促進骨再生的過程中是十分必要和有效的。實驗為降低下一步臨床應用的風險，通過一系列設計操作的優化，比如脂質體質粒載體相對病毒載體更低的免疫原性和更低的基因失控表達的風險性，以及同源基因在同源細胞中表達同源蛋白的非免疫原性，使基因治療結合組織工程的方法更安全以及更接近臨床轉化應用。在實驗驗證后，對于臨床極為復雜且目前極難解決的個體病例，可在征得患者同意及倫理審批下，采用患者自體hBMSCs及自體組織擴增hBMP-2基因構建的可穩定表達hBMP-2的基因組織工程骨試用于臨床。
hBMP-2誘導細胞成骨分化，促進骨組織再生已得到大量研究證實[9-10]。本研究中，hBMP-2基因質粒轉染hBMSCs后，RT-PCR和免疫組織化學染色顯示48 h和3周的轉染細胞均能轉錄和表達hBMP-2，且48 h瞬時的hBMP-2 mRNA轉錄表達程度較3周時穩定表達時更強，hBMSCs的成骨分化標志ALP染色水平顯著增高，細胞上清的dot-ELISA檢測結果也證實hBMP-2表達良好并可分泌到細胞外。質粒作為載體介導的基因轉染為瞬時轉染，所導入的基因表達時間相對有限。本研究發現，質粒介導hBMP-2轉染hBMSCs后，3周時hBMP-2的表達水平雖然相對于轉染48 h后逐漸變弱，但仍能穩定表達，質粒作為基因載體雖無法像逆轉錄病毒載體轉染實現基因的持久性表達，但也仍能滿足體外誘導MSCs成骨分化，體內促進新骨生成。同時，逆轉錄病毒載體轉染基因的失控性和無限期表達在實際應用上存在更多風險及并發癥，因此質粒作為基因載體具有更明顯的安全性和優越性[11-12]。
MSCs分化為成骨細胞依賴于細胞的黏附和細胞外基質的分泌[13-15]，本研究在hBMP-2基因轉染的hBMSCs與HA材料復合培養3 d后，用掃描電鏡及倒置相差顯微鏡對其表面進行評價，發現hBMSCs在HA表面具有良好的黏附生長特性，同時hBM SCs可在HA表面合成細胞外基質，此結果與既往研究一致[16]。單純植入hBMP-2轉染細胞時，由于hBMP-2細胞植入體內缺乏相應支架介導細胞黏附并合成細胞外基質，因此難以促進裸鼠肌肉組織成骨。此外HA材料由于其表面釋放的鈣離子可直接促進細胞成骨分化，也可能是其中一個重要影響因素[17-19]。
來自于外源性基因表達產物、基因載體以及BMSCs的免疫原性是組織工程及基因治療臨床轉化的重要障礙[20-21]。我們研究聯合應用基因工程和組織工程降低風險，將同源性hBMP-2基因導入hBM SCs構建穩定表達分泌hBMP-2的組織工程骨，人體細胞轉染人源基因，表達分泌人源蛋白，相對降低種源之間的免疫原性；采用質粒作為基因轉染的載體相對病毒載體免疫原性更低，在體外完成hBM SCs的轉染后再植入體內，相對于直接將質粒導入體內進一步降低了免疫反應風險。本研究通過一系列優化，在提供骨再生修復3個基本要素的同時，使基因治療結合組織工程的方法更為安全、更接近于臨床轉化應用。但裸鼠體內驗證成骨的實驗還處于臨床應用前的初步階段，臨床轉化還需要基于此的靈長類大動物實驗和臨床試用進一步驗證。
