引用本文： 陳林, 許明卿, 劉洋, 段浩, 華聞達, 何飛. 組織界面剛度變化對大鼠BMSCs成骨分化的影響. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(12): 1524-1531. doi: 10.7507/1002-1892.20160315 復制
仿生學是利用生物的結構和功能原理模仿生物特性并研究發展各種新技術的科學，是醫學組織工程中一個重要領域[1]。利用仿生學原理最大程度模擬細胞微環境，構建具備力學特性優勢的微環境界面，進而實現細胞修復及缺損器官組織的快速更新，是近年來組織工程學的一個研究熱點[2]。目前研發的大部分組織工程支架材料，其設計僅滿足了宏觀需求，不具備微觀納米級層次的仿生特點。隨著表征成像技術的進步，人們對機體組織的認識已深入到微觀層次[3-4]。利用原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）可表征骨小梁與細胞界面的形貌和剛度，骨小梁表面由層疊的膠原纖維網絡和其他蛋白、多糖構成板層狀復合物，骨小梁與細胞之間形成了特殊的骨與細胞界面，該界面具有不同于宏觀骨表面的剛度和形貌特征[5]；其化學組成和表面形貌已被證實對骨形成和骨誘導有直接影響[6]，但力學特性的相關研究較少。有研究發現大鼠BMSCs生物學行為不僅受到生物化學因素的影響，傳導力學信號的生物物理因素的影響也至關重要[7-9]。隨著接觸界面剛度的增加，大鼠BMSCs有較為明顯的從成軟骨到成骨分化趨勢，可以假設存在一個適宜的剛度范圍，與此剛度相應的骨組織工程材料具有理想的骨引導和骨誘導能力[9-11]。本研究從生物力學角度出發，以彈性模量作為剛度指標，仿生不同剛度的凝膠界面，研究界面剛度對大鼠BMSCs生物學行為的影響，旨在探索促進干細胞成骨分化的剛度區間，進一步明確界面剛度變化對大鼠BMSCs增殖、成骨分化的調節作用，也為組織工程支架材料設計提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4周齡SPF級雄性SD大鼠6只，體質量60~90 g，由昆明醫科大學SPF動物房提供。
DMEM/F12培養基、胰蛋白酶-EDTA、鼠尾Ⅰ型膠原（GIBCO公司，美國）；FBS（Invitrogen公司，美國）；羅丹明-鬼筆環肽（Life Technologies公司，美國）；多聚甲醛、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）、交聯劑sulfo-SANPAH（Pierce Biotechnology公司，美國）；FITC標記的小鼠抗大鼠CD44抗體、PE標記的小鼠抗大鼠CD45抗體、APC標記的小鼠抗大鼠CD90抗體（Ebioscience公司，美國）；Trizol總RNA提取試劑盒、ALP定量試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、茜素紅染液（南京建成生物技術有限公司）；大鼠肌動蛋白（F-actin）、鈣黏蛋白-E（E-cadherin）Western blot試劑盒（Santa Cruz公司，美國）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。
5500 AFM（Agilent公司，美國）；CSG11/tipless微懸臂（NT-MDT公司，俄羅斯）；TE2000U倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；CX23光學顯微鏡（Olympus公司，日本）；T100 Thermal Cycler PCR儀、Mini-Protean Tetra蛋白電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；FACS Vantage流式細胞儀（Becton-Dickinson公司，美國）；Infinite M200 Pro熒光酶標儀（Tecan公司，瑞士）；BHC-1300IIA/B2超凈工作臺（蘇州凈化工作臺設備有限公司）；Multifuge x1高速冷凍離心機、HERAcell 2401細胞培養箱（Thermo Scientific公司，美國）。
1.2 BMSCs分離培養及鑒定
取6只SD大鼠脫頸處死，分離股骨和脛骨，用完全培養基（含10%FBS的DMEM/F12）沖洗骨髓腔，以離心半徑3?cm、1 000 r/min離心15 min，棄上清，完全培養基重懸細胞后，種植于培養瓶中，置于37℃、5%CO2及80%相對濕度條件下培養，2~3 d后完全培養基全量換液1次，待細胞接近80%~90%匯合時，以1：3比例傳代培養。
取第2代BMSCs消化均勻，PBS重懸細胞后計數，調整密度為5×109個/mL，EP管中加入1 mL懸液，以離心半徑3 cm、1 000 r/min離心4 min；去除上清，每管中分別加入50 μL PBS，再分別加入FITC標記的小鼠抗大鼠CD44抗體、PE標記的小鼠抗大鼠CD45抗體、APC標記的小鼠抗大鼠CD90抗體各3 μL，室溫下避光孵育30?min，流式細胞儀檢測。
1.3 不同剛度聚丙烯酰胺水凝膠（polyacrylamide hydrophilic gel，PA）的制備及觀測
1.3.1 PA制備
參照Beningo等[12]研究方法，按照不同比例取Acrylamide和2%Bis-Acrylamide，制備彈性模量分別為1、4、10、40、80 kPa的PA用于實驗研究，見表 1。將制備的PA基底浸泡于三蒸水中，紫外光照射6 h消毒后，加入適量交聯劑sulfo-SANPAH，365 nm紫外光照射15 min，用0.02?mol/L鼠尾Ⅰ型膠原蛋白修飾PA基底6 h，備用。
表1
不同剛度PA的配制比例
Table1.
Preparation proportion of PA with different stiffness
1.3.2 PA觀測
①實際彈性模量測定：將AFM與倒置熒光顯微鏡集成為生物型AFM。利用生物型AFM的自動控制，將無針尖的微懸臂自動逼近涂有紫外固化膠的蓋玻片表面，在生物型AFM微懸臂頂端蘸取適量凝膠（圖 1a），抬起微懸臂。置換帶有分散良好的7 μm聚丙烯小球的蓋玻片，通過光鏡選取合適小球，生物型AFM自動控制微懸臂逼近并接觸小球（圖 1b），再利用380 nm波長紫外光照射懸臂，使凝膠固化[13]。取制備的PA，每塊凝膠隨機選取5個點，用小球修飾的探針進行力曲線測定實驗。彈性模量的計算公式參考Hertz模型[14]：。其中，F為所施加的力，E為所求彈性模量；δ為壓入深度（δ=300 nm），R為針尖的曲率半徑，v為泊松比（樣本假定不可壓縮，ν=0.5）。
圖1
AFM探針修飾小球示意圖?懸臂頂端蘸膠?光固化粘球??圖 2?光鏡下第2代BMSCs形態觀察（×100）?培養24 h ?培養72 h ??圖 3?流式細胞術鑒定體外培養第2代BMSCs表面標志物? CD45 ? CD44 ? CD90 ??圖 4?光鏡觀察BMSCs在不同剛度PA基底上的形態（×100）?普通培養皿? 1 kPa PA ? 4 kPa PA ? 10 kPa PA ? 40 kPa PA ? 80 kPa PA
Figure1.
Modifying atomic force microscope cantilever with a bead ? Cantilever tip dipping ? Light curing adhesive ball ??Fig.2 The typical morphology of the second passage BMSCs under light microscope (×100) ? At 24 hours ? At 72 hours ??Fig.3 Molecular markers of the second passage BMSCs in vitro by flow cytometry ? CD45 ? CD44 ? CD90 ??Fig.4 Morphology observation of BMSCs cultured on PA with different stiffness (×100) ? Common culture dish ? PA elastic modulus of 1 kPa ? PA elastic modulus of 4 kPa ? PA elastic modulus of 10 kPa ? PA elastic modulus of 40 kPa ? PA elastic modulus of 80 kPa
②細胞鋪展觀察：取第3代BMSCs，按1× 105個/ mL密度接種于覆蓋彈性模量分別為1、4、10、40、80?kPa PA的普通培養皿（細胞接種于PA基底上），以普通培養皿（界面彈性模量75 MPa）作為對照。培養6?h后在光鏡（×100）下，以微分干涉（dic）技術增加對比度，觀察細胞在不同剛度PA上的鋪展狀態，采用Image J軟件分析細胞鋪展面積。根據細胞鋪展狀態以及鋪展面積選擇后續實驗用PA。
1.4 實驗分組
根據1.3.2實驗結果，選擇彈性模量為4、10、40?kPa的PA作為研究對象。取第3代BMSCs，按1×106?個/ mL密度接種于覆蓋彈性模量分別為4、10、40?kPa PA的普通培養皿（細胞接種于PA基底上），以普通培養皿（界面彈性模量75 MPa）作為對照加入適量完全培養基，置于37℃、5%CO2及80%相對濕度的培養箱中培養，2~3 d換液1次。
1.5 觀測指標
1.5.1 BMSCs生長觀察
各組每隔24?h取BMSCs采用CCK-8法消化計數取均值，連續監測5 d，繪制BMSCs生長曲線。
1.5.2 ELISA法檢測ALP濃度
培養10 d，各組取BMSCs依照大鼠ALP定量試劑盒說明書，于波長450 nm酶標儀上檢測ALP濃度。
1.5.3 茜素紅染色檢測鈣沉積
培養10 d，各組行茜素紅染色，光鏡（×100）下觀察鈣結節染色情況；各組隨機選取3個視野，按以下公式計算鈣結節百分比，鈣結節百分比=視野內鈣結節染色細胞數/視野內總細胞數×100%。
1.5.4 實時熒光定量PCR檢測骨鈣素（bone gla protein，BGP）、Runx2及Ⅰ型膠原mRNA表達
培養10 d，各組收集細胞，Trizol提取總RNA，以兩步法進行RT-PCR分析，采用2-ΔΔCt法[15]定量分析BGP、Runx2及Ⅰ型膠原mRNA相對表達量。引物序列見表 2。
表2
實時熒光定量PCR引物序列
Table2.
Primers for real-time quantitative PCR
1.6 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs分離培養及鑒定
鏡下觀察第2代BMSCs不同融合程度的典型形態，貼壁細胞部分呈多角形，少量呈類橢圓短梭形外觀，鏡下少數視野內可見細胞集落，集落多由6至數十個細胞組成（圖 2）。
流式細胞儀檢測分離培養細胞CD45低表達，表達率1.65%；CD44、CD90高表達，表達率分別為94.1%和95.8%（圖 3），符合BMSCs典型生物學特征。
2.2 不同剛度PA觀測
2.2.1 實際彈性模量測定
彈性模量為1、4、10、40、80 kPa的PA，其實際彈性模量分別為（1.0±0.1）（4.0±0.4）、（10.0±1.2）、（40.0±3.2）（80.0±6.8）kPa，復測值接近理論值。
2.2.2 細胞鋪展觀察
隨著PA剛度的提升，BMSCs鋪展面積逐漸增加，尤其在10、40 kPa PA基底上BMSCs鋪展較好（圖 4）；1、4、10、40、80 kPa PA上細胞鋪展面積分別是（4.6±0.5）、（5.7±0.6）、（8.9±1.2）、（11.0±1.3）、（12.2±1.9）μm2，除1、4 kPa組間以及40、80 kPa組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）外，其余組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.3 細胞增殖觀察
BMSCs生長曲線顯示，培養1、2 d，A、B、C、D組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。3~5 d，B、C組細胞增殖明顯優于A、D組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；5 d時C組優于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）；其余各時間點各組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 5。
圖5
各組BMSCs生長曲線??圖 6?各組茜素紅染色觀察（×100）? A組? B組? C組? D組??圖 7?實時熒光定量PCR檢測各組BMSCs成骨分化因子mRNA表達? BGP ? Ⅰ型膠原? Runx2
Figure5.
BMSCs growth curve of 4 groups ??Fig.6 Alizarin red staining of BMSCs in each group ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D ??Fig.7 The mRNA expression levels of BGP, collagen type Ⅰ, and Runx2 of BMSCs in each group by real-time quantitative PCR ? BGP ? Collagen type Ⅰ ? Runx2
2.4 ALP濃度測定
A、B、C、D組ALP濃度分別為（53.69±0.89）、（97.30±1.57）、（126.60±14.54）、（12.93±0.58）U/gprot。A、B、C組ALP活性顯著高于D組，C組顯著高于A、B組，B組顯著高于A組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.5 茜素紅染色檢測鈣沉積狀況
培養10 d后，A、B、D組細胞大部分呈多角形、梭形，少量呈類橢圓短梭形，可見由數個至數十個細胞組成細胞集落；C組細胞復層生長，呈立方形、多角形，細胞質顏色變深，可見不透光團塊狀礦化結節形成（圖 6）。茜素紅染色示，A、B、D組未出現明顯PA鈣結節染色，C組鈣結節百分比為20.07%±4.24%，顯著高于其余3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。
2.6 BMSCs成骨分化因子mRNA表達
A、B、C組BGP、Ⅰ型膠原mRNA相對表達量均顯著高于D組，C組顯著高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。B、C組Runx2 mRNA相對表達量顯著高于D組，C組高于B組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；A、D組間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 7。
3 討論
MSCs是目前組織工程、再生醫學中被廣泛研究的細胞[16]，具有高度增殖、自我更新以及多向分化的能力，以及對機體損傷小、生物相容性好、組織修復能力強等特點，是較為理想的種子細胞[17]。研究表明，BMSCs體外分化除受到化學誘導因子的控制，基底剛度對其生物學行為也具有重要影響[18-19]。在材料力學中，彈性模量可視為衡量材料產生彈性變形難易程度的指標，彈性模量與相應截面幾何性質的乘積表示為各類剛度，如EI為彎曲剛度、EA為拉壓剛度。由關系式可以得到，在相應截面幾何性質不變的情況下，剛度與彈性模量成正比，其值越大，材料剛度越大。本研究中平鋪的PA截面幾何性質相同，故選擇通過彈性模量大小來表征PA剛度高低，彈性模量越小剛度越低，反之剛度越大。通過觀察不同剛度PA對大鼠BMSCs細胞行為的影響，發現在1~80?kPa范圍內，隨著PA基底剛度的提升，BMSCs鋪展面積逐漸增加，Image J軟件分析細胞鋪展面積顯示，低剛度（彈性模量1 kPa）PA基底上細胞鋪展面積僅達高剛度（彈性模量80 kPa）PA基底上的38.8%左右。在4~40?kPa范圍內，培養3~5?d B、C組細胞增殖情況明顯優于A、D組，C組5?d時細胞增殖情況優于B組。說明在10~40?kPa范圍內，PA剛度越高，BMSCs鋪展面積越大、增殖越快；PA剛度過低（彈性模量4?kPa）和過高（彈性模量75?MPa）均不影響BMSCs增殖。
BMSCs成骨分化過程中會表達特異性基因及成骨分化產物。ALP是成骨細胞表面標志性酶，是成骨細胞分化和功能的標志；Ⅰ型膠原是成骨細胞分泌的特異性膠原蛋白，是其礦化功能實現的前提；BGP由成骨細胞分泌，其來源及本身性質均較穩定，常與成骨細胞礦化同時出現。本研究選擇觀測ALP濃度、鈣沉積及成骨分化相關因子BGP、Ⅰ型膠原、Runx2 mRNA的表達水平，以間接反映BMSCs是否成骨分化。
在培養10?d時，10~40 kPa范圍內隨著PA剛度提升，BMSCs的鈣結節百分比升高，ALP濃度升高，BGP、Ⅰ型膠原和Runx2的mRNA表達水平逐漸增強，差異均有統計學意義（P < 0.05），且C組明顯優于其他組，差異有統計學意義（P < 0.05）。說明PA彈性模量在10~40 kPa范圍時，其能促進BMSCs成骨分化，而且剛度越高，作用越強。
研究顯示細胞能感受到其與接觸界面間的剛度[20-21]。細胞對于基底剛度的感知依賴于自身的力感知機制[22]，即細胞通過拉伸基底探測到基底的抵抗反應，進而感知基底的剛度。細胞對基底的作用力大部分源于細胞內肌動-肌球蛋白網絡，主要通過跨膜蛋白整合素傳遞至細胞外基質（基底、界面）。這決定了細胞感受到的不是整個骨組織的剛度，而是細胞與骨表面間幾百納米到幾微米的細胞外基質剛度。細胞外基質主要由交聯層疊網狀膠原纖維、蛋白、多糖構成的板層狀復合物，加上所有無機、有機成分礦化后的復雜結構而成，這些層疊的膠原纖維網絡使骨與細胞界面具有不同于宏觀骨表面的剛度，數值跨度可從千帕到幾兆帕[9]，基底對細胞發出的力學信號主要來自這層結構的力學特性。因此，仿生骨與細胞外基質界面剛度更高時，對BMSCs的生物學行為影響更大。Winer等[23]的研究模擬了不同力學性質的骨髓，發現材料基底剛度較低時，BMSCs處于細胞周期停滯的靜止狀態，但轉移至剛度較高基底后，細胞重新進入細胞循環周期并啟動分化，說明基底剛度能夠維持干細胞干性并能影響其增殖及分化。本研究結果也發現，40 kPa PA能明顯促進大鼠BMSCs增殖及成骨分化。
細胞外基質、整合素、局部黏附蛋白和細胞骨架網絡構成了一個完善的張力整合系統[24]。大鼠BMSCs通過細胞表面活化的整合素與基底相結合，并在結合位點產生張力，引起基底的形變，其幅度隨基底剛度的變化而變化，細胞可感知區分這種力學信號差異，一方面導致細胞骨架重排、微絲蛋白構象改變，最終與染色體接觸引起細胞功能改變[25]；另一方面觸發激酶（如FAK）活化、啟動其下游信號轉導途徑，使得相應信號分子胞內運輸和受體配體結合強度等改變，進而調控細胞的增殖、分化[26-27]。McBeath等[28]認為不完全鋪展呈圓形的MSCs易向脂肪細胞分化，而充分黏附、平鋪伸展的MSCs更傾向于成骨分化。Park等[29]研究發現MSCs基底剛度降低，改變小G蛋白Rho活性，抑制細胞骨架的組裝和應力纖維的完成，從而使其鋪展面積減小、應力纖維數量減少、增殖率降低。以上研究表明，基底剛度可導致BMSCs骨架重排，應力纖維改變，產生生物化學信號的改變，最終影響其生物學行為（生長、增殖、分化）。本研究發現，在10~40?kPa范圍內，隨著PA剛度提升，大鼠BMSCs鋪展面積越大、增殖越快、成骨分化越明顯，這可能與剛度高的基底能使BMSCs自身蛋白骨架發生重排，細胞肌動蛋白纖維增多、增粗，細胞張力增大[30]有關。在4?kPa與極限剛度（彈性模量75 MPa）條件下均未發現BMSCs在增殖、成骨分化上有差異，提示過高和過低剛度均不能影響大鼠BMSCs的增殖及成骨分化，可能是過低或過高剛度上力學信號都不能轉化為促進大鼠BMSCs增殖及成骨的化學信號。
本研究從生物力學研究角度出發，制備了不同剛度PA，并接種大鼠BMSCs，觀察BMSCs鋪展、生長增殖情況，最終選取了4~40 kPa PA進行成骨分化的部分關鍵蛋白、標志基因檢測，發現10~40?kPa PA能促進大鼠BMSCs增殖與分化，并且40?kPa PA作用最強。本研究結果對認識BMSCs與周圍力學微環境的關聯性，為進一步明確界面剛度變化對BMSCs成骨分化關鍵信號通路、蛋白的調節，闡述其內在分子機制的研究奠定了一定基礎。
仿生學是利用生物的結構和功能原理模仿生物特性并研究發展各種新技術的科學，是醫學組織工程中一個重要領域[1]。利用仿生學原理最大程度模擬細胞微環境，構建具備力學特性優勢的微環境界面，進而實現細胞修復及缺損器官組織的快速更新，是近年來組織工程學的一個研究熱點[2]。目前研發的大部分組織工程支架材料，其設計僅滿足了宏觀需求，不具備微觀納米級層次的仿生特點。隨著表征成像技術的進步，人們對機體組織的認識已深入到微觀層次[3-4]。利用原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）可表征骨小梁與細胞界面的形貌和剛度，骨小梁表面由層疊的膠原纖維網絡和其他蛋白、多糖構成板層狀復合物，骨小梁與細胞之間形成了特殊的骨與細胞界面，該界面具有不同于宏觀骨表面的剛度和形貌特征[5]；其化學組成和表面形貌已被證實對骨形成和骨誘導有直接影響[6]，但力學特性的相關研究較少。有研究發現大鼠BMSCs生物學行為不僅受到生物化學因素的影響，傳導力學信號的生物物理因素的影響也至關重要[7-9]。隨著接觸界面剛度的增加，大鼠BMSCs有較為明顯的從成軟骨到成骨分化趨勢，可以假設存在一個適宜的剛度范圍，與此剛度相應的骨組織工程材料具有理想的骨引導和骨誘導能力[9-11]。本研究從生物力學角度出發，以彈性模量作為剛度指標，仿生不同剛度的凝膠界面，研究界面剛度對大鼠BMSCs生物學行為的影響，旨在探索促進干細胞成骨分化的剛度區間，進一步明確界面剛度變化對大鼠BMSCs增殖、成骨分化的調節作用，也為組織工程支架材料設計提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4周齡SPF級雄性SD大鼠6只，體質量60~90 g，由昆明醫科大學SPF動物房提供。
DMEM/F12培養基、胰蛋白酶-EDTA、鼠尾Ⅰ型膠原（GIBCO公司，美國）；FBS（Invitrogen公司，美國）；羅丹明-鬼筆環肽（Life Technologies公司，美國）；多聚甲醛、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）、交聯劑sulfo-SANPAH（Pierce Biotechnology公司，美國）；FITC標記的小鼠抗大鼠CD44抗體、PE標記的小鼠抗大鼠CD45抗體、APC標記的小鼠抗大鼠CD90抗體（Ebioscience公司，美國）；Trizol總RNA提取試劑盒、ALP定量試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、茜素紅染液（南京建成生物技術有限公司）；大鼠肌動蛋白（F-actin）、鈣黏蛋白-E（E-cadherin）Western blot試劑盒（Santa Cruz公司，美國）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。
5500 AFM（Agilent公司，美國）；CSG11/tipless微懸臂（NT-MDT公司，俄羅斯）；TE2000U倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；CX23光學顯微鏡（Olympus公司，日本）；T100 Thermal Cycler PCR儀、Mini-Protean Tetra蛋白電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；FACS Vantage流式細胞儀（Becton-Dickinson公司，美國）；Infinite M200 Pro熒光酶標儀（Tecan公司，瑞士）；BHC-1300IIA/B2超凈工作臺（蘇州凈化工作臺設備有限公司）；Multifuge x1高速冷凍離心機、HERAcell 2401細胞培養箱（Thermo Scientific公司，美國）。
1.2 BMSCs分離培養及鑒定
取6只SD大鼠脫頸處死，分離股骨和脛骨，用完全培養基（含10%FBS的DMEM/F12）沖洗骨髓腔，以離心半徑3?cm、1 000 r/min離心15 min，棄上清，完全培養基重懸細胞后，種植于培養瓶中，置于37℃、5%CO2及80%相對濕度條件下培養，2~3 d后完全培養基全量換液1次，待細胞接近80%~90%匯合時，以1：3比例傳代培養。
取第2代BMSCs消化均勻，PBS重懸細胞后計數，調整密度為5×109個/mL，EP管中加入1 mL懸液，以離心半徑3 cm、1 000 r/min離心4 min；去除上清，每管中分別加入50 μL PBS，再分別加入FITC標記的小鼠抗大鼠CD44抗體、PE標記的小鼠抗大鼠CD45抗體、APC標記的小鼠抗大鼠CD90抗體各3 μL，室溫下避光孵育30?min，流式細胞儀檢測。
1.3 不同剛度聚丙烯酰胺水凝膠（polyacrylamide hydrophilic gel，PA）的制備及觀測
1.3.1 PA制備
參照Beningo等[12]研究方法，按照不同比例取Acrylamide和2%Bis-Acrylamide，制備彈性模量分別為1、4、10、40、80 kPa的PA用于實驗研究，見表 1。將制備的PA基底浸泡于三蒸水中，紫外光照射6 h消毒后，加入適量交聯劑sulfo-SANPAH，365 nm紫外光照射15 min，用0.02?mol/L鼠尾Ⅰ型膠原蛋白修飾PA基底6 h，備用。
表1
不同剛度PA的配制比例
Table1.
Preparation proportion of PA with different stiffness
1.3.2 PA觀測
①實際彈性模量測定：將AFM與倒置熒光顯微鏡集成為生物型AFM。利用生物型AFM的自動控制，將無針尖的微懸臂自動逼近涂有紫外固化膠的蓋玻片表面，在生物型AFM微懸臂頂端蘸取適量凝膠（圖 1a），抬起微懸臂。置換帶有分散良好的7 μm聚丙烯小球的蓋玻片，通過光鏡選取合適小球，生物型AFM自動控制微懸臂逼近并接觸小球（圖 1b），再利用380 nm波長紫外光照射懸臂，使凝膠固化[13]。取制備的PA，每塊凝膠隨機選取5個點，用小球修飾的探針進行力曲線測定實驗。彈性模量的計算公式參考Hertz模型[14]：。其中，F為所施加的力，E為所求彈性模量；δ為壓入深度（δ=300 nm），R為針尖的曲率半徑，v為泊松比（樣本假定不可壓縮，ν=0.5）。
圖1
AFM探針修飾小球示意圖?懸臂頂端蘸膠?光固化粘球??圖 2?光鏡下第2代BMSCs形態觀察（×100）?培養24 h ?培養72 h ??圖 3?流式細胞術鑒定體外培養第2代BMSCs表面標志物? CD45 ? CD44 ? CD90 ??圖 4?光鏡觀察BMSCs在不同剛度PA基底上的形態（×100）?普通培養皿? 1 kPa PA ? 4 kPa PA ? 10 kPa PA ? 40 kPa PA ? 80 kPa PA
Figure1.
Modifying atomic force microscope cantilever with a bead ? Cantilever tip dipping ? Light curing adhesive ball ??Fig.2 The typical morphology of the second passage BMSCs under light microscope (×100) ? At 24 hours ? At 72 hours ??Fig.3 Molecular markers of the second passage BMSCs in vitro by flow cytometry ? CD45 ? CD44 ? CD90 ??Fig.4 Morphology observation of BMSCs cultured on PA with different stiffness (×100) ? Common culture dish ? PA elastic modulus of 1 kPa ? PA elastic modulus of 4 kPa ? PA elastic modulus of 10 kPa ? PA elastic modulus of 40 kPa ? PA elastic modulus of 80 kPa
②細胞鋪展觀察：取第3代BMSCs，按1× 105個/ mL密度接種于覆蓋彈性模量分別為1、4、10、40、80?kPa PA的普通培養皿（細胞接種于PA基底上），以普通培養皿（界面彈性模量75 MPa）作為對照。培養6?h后在光鏡（×100）下，以微分干涉（dic）技術增加對比度，觀察細胞在不同剛度PA上的鋪展狀態，采用Image J軟件分析細胞鋪展面積。根據細胞鋪展狀態以及鋪展面積選擇后續實驗用PA。
1.4 實驗分組
根據1.3.2實驗結果，選擇彈性模量為4、10、40?kPa的PA作為研究對象。取第3代BMSCs，按1×106?個/ mL密度接種于覆蓋彈性模量分別為4、10、40?kPa PA的普通培養皿（細胞接種于PA基底上），以普通培養皿（界面彈性模量75 MPa）作為對照加入適量完全培養基，置于37℃、5%CO2及80%相對濕度的培養箱中培養，2~3 d換液1次。
1.5 觀測指標
1.5.1 BMSCs生長觀察
各組每隔24?h取BMSCs采用CCK-8法消化計數取均值，連續監測5 d，繪制BMSCs生長曲線。
1.5.2 ELISA法檢測ALP濃度
培養10 d，各組取BMSCs依照大鼠ALP定量試劑盒說明書，于波長450 nm酶標儀上檢測ALP濃度。
1.5.3 茜素紅染色檢測鈣沉積
培養10 d，各組行茜素紅染色，光鏡（×100）下觀察鈣結節染色情況；各組隨機選取3個視野，按以下公式計算鈣結節百分比，鈣結節百分比=視野內鈣結節染色細胞數/視野內總細胞數×100%。
1.5.4 實時熒光定量PCR檢測骨鈣素（bone gla protein，BGP）、Runx2及Ⅰ型膠原mRNA表達
培養10 d，各組收集細胞，Trizol提取總RNA，以兩步法進行RT-PCR分析，采用2-ΔΔCt法[15]定量分析BGP、Runx2及Ⅰ型膠原mRNA相對表達量。引物序列見表 2。
表2
實時熒光定量PCR引物序列
Table2.
Primers for real-time quantitative PCR
1.6 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs分離培養及鑒定
鏡下觀察第2代BMSCs不同融合程度的典型形態，貼壁細胞部分呈多角形，少量呈類橢圓短梭形外觀，鏡下少數視野內可見細胞集落，集落多由6至數十個細胞組成（圖 2）。
流式細胞儀檢測分離培養細胞CD45低表達，表達率1.65%；CD44、CD90高表達，表達率分別為94.1%和95.8%（圖 3），符合BMSCs典型生物學特征。
2.2 不同剛度PA觀測
2.2.1 實際彈性模量測定
彈性模量為1、4、10、40、80 kPa的PA，其實際彈性模量分別為（1.0±0.1）（4.0±0.4）、（10.0±1.2）、（40.0±3.2）（80.0±6.8）kPa，復測值接近理論值。
2.2.2 細胞鋪展觀察
隨著PA剛度的提升，BMSCs鋪展面積逐漸增加，尤其在10、40 kPa PA基底上BMSCs鋪展較好（圖 4）；1、4、10、40、80 kPa PA上細胞鋪展面積分別是（4.6±0.5）、（5.7±0.6）、（8.9±1.2）、（11.0±1.3）、（12.2±1.9）μm2，除1、4 kPa組間以及40、80 kPa組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）外，其余組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.3 細胞增殖觀察
BMSCs生長曲線顯示，培養1、2 d，A、B、C、D組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。3~5 d，B、C組細胞增殖明顯優于A、D組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；5 d時C組優于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）；其余各時間點各組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 5。
圖5
各組BMSCs生長曲線??圖 6?各組茜素紅染色觀察（×100）? A組? B組? C組? D組??圖 7?實時熒光定量PCR檢測各組BMSCs成骨分化因子mRNA表達? BGP ? Ⅰ型膠原? Runx2
Figure5.
BMSCs growth curve of 4 groups ??Fig.6 Alizarin red staining of BMSCs in each group ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D ??Fig.7 The mRNA expression levels of BGP, collagen type Ⅰ, and Runx2 of BMSCs in each group by real-time quantitative PCR ? BGP ? Collagen type Ⅰ ? Runx2
2.4 ALP濃度測定
A、B、C、D組ALP濃度分別為（53.69±0.89）、（97.30±1.57）、（126.60±14.54）、（12.93±0.58）U/gprot。A、B、C組ALP活性顯著高于D組，C組顯著高于A、B組，B組顯著高于A組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.5 茜素紅染色檢測鈣沉積狀況
培養10 d后，A、B、D組細胞大部分呈多角形、梭形，少量呈類橢圓短梭形，可見由數個至數十個細胞組成細胞集落；C組細胞復層生長，呈立方形、多角形，細胞質顏色變深，可見不透光團塊狀礦化結節形成（圖 6）。茜素紅染色示，A、B、D組未出現明顯PA鈣結節染色，C組鈣結節百分比為20.07%±4.24%，顯著高于其余3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。
2.6 BMSCs成骨分化因子mRNA表達
A、B、C組BGP、Ⅰ型膠原mRNA相對表達量均顯著高于D組，C組顯著高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。B、C組Runx2 mRNA相對表達量顯著高于D組，C組高于B組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；A、D組間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 7。
3 討論
MSCs是目前組織工程、再生醫學中被廣泛研究的細胞[16]，具有高度增殖、自我更新以及多向分化的能力，以及對機體損傷小、生物相容性好、組織修復能力強等特點，是較為理想的種子細胞[17]。研究表明，BMSCs體外分化除受到化學誘導因子的控制，基底剛度對其生物學行為也具有重要影響[18-19]。在材料力學中，彈性模量可視為衡量材料產生彈性變形難易程度的指標，彈性模量與相應截面幾何性質的乘積表示為各類剛度，如EI為彎曲剛度、EA為拉壓剛度。由關系式可以得到，在相應截面幾何性質不變的情況下，剛度與彈性模量成正比，其值越大，材料剛度越大。本研究中平鋪的PA截面幾何性質相同，故選擇通過彈性模量大小來表征PA剛度高低，彈性模量越小剛度越低，反之剛度越大。通過觀察不同剛度PA對大鼠BMSCs細胞行為的影響，發現在1~80?kPa范圍內，隨著PA基底剛度的提升，BMSCs鋪展面積逐漸增加，Image J軟件分析細胞鋪展面積顯示，低剛度（彈性模量1 kPa）PA基底上細胞鋪展面積僅達高剛度（彈性模量80 kPa）PA基底上的38.8%左右。在4~40?kPa范圍內，培養3~5?d B、C組細胞增殖情況明顯優于A、D組，C組5?d時細胞增殖情況優于B組。說明在10~40?kPa范圍內，PA剛度越高，BMSCs鋪展面積越大、增殖越快；PA剛度過低（彈性模量4?kPa）和過高（彈性模量75?MPa）均不影響BMSCs增殖。
BMSCs成骨分化過程中會表達特異性基因及成骨分化產物。ALP是成骨細胞表面標志性酶，是成骨細胞分化和功能的標志；Ⅰ型膠原是成骨細胞分泌的特異性膠原蛋白，是其礦化功能實現的前提；BGP由成骨細胞分泌，其來源及本身性質均較穩定，常與成骨細胞礦化同時出現。本研究選擇觀測ALP濃度、鈣沉積及成骨分化相關因子BGP、Ⅰ型膠原、Runx2 mRNA的表達水平，以間接反映BMSCs是否成骨分化。
在培養10?d時，10~40 kPa范圍內隨著PA剛度提升，BMSCs的鈣結節百分比升高，ALP濃度升高，BGP、Ⅰ型膠原和Runx2的mRNA表達水平逐漸增強，差異均有統計學意義（P < 0.05），且C組明顯優于其他組，差異有統計學意義（P < 0.05）。說明PA彈性模量在10~40 kPa范圍時，其能促進BMSCs成骨分化，而且剛度越高，作用越強。
研究顯示細胞能感受到其與接觸界面間的剛度[20-21]。細胞對于基底剛度的感知依賴于自身的力感知機制[22]，即細胞通過拉伸基底探測到基底的抵抗反應，進而感知基底的剛度。細胞對基底的作用力大部分源于細胞內肌動-肌球蛋白網絡，主要通過跨膜蛋白整合素傳遞至細胞外基質（基底、界面）。這決定了細胞感受到的不是整個骨組織的剛度，而是細胞與骨表面間幾百納米到幾微米的細胞外基質剛度。細胞外基質主要由交聯層疊網狀膠原纖維、蛋白、多糖構成的板層狀復合物，加上所有無機、有機成分礦化后的復雜結構而成，這些層疊的膠原纖維網絡使骨與細胞界面具有不同于宏觀骨表面的剛度，數值跨度可從千帕到幾兆帕[9]，基底對細胞發出的力學信號主要來自這層結構的力學特性。因此，仿生骨與細胞外基質界面剛度更高時，對BMSCs的生物學行為影響更大。Winer等[23]的研究模擬了不同力學性質的骨髓，發現材料基底剛度較低時，BMSCs處于細胞周期停滯的靜止狀態，但轉移至剛度較高基底后，細胞重新進入細胞循環周期并啟動分化，說明基底剛度能夠維持干細胞干性并能影響其增殖及分化。本研究結果也發現，40 kPa PA能明顯促進大鼠BMSCs增殖及成骨分化。
細胞外基質、整合素、局部黏附蛋白和細胞骨架網絡構成了一個完善的張力整合系統[24]。大鼠BMSCs通過細胞表面活化的整合素與基底相結合，并在結合位點產生張力，引起基底的形變，其幅度隨基底剛度的變化而變化，細胞可感知區分這種力學信號差異，一方面導致細胞骨架重排、微絲蛋白構象改變，最終與染色體接觸引起細胞功能改變[25]；另一方面觸發激酶（如FAK）活化、啟動其下游信號轉導途徑，使得相應信號分子胞內運輸和受體配體結合強度等改變，進而調控細胞的增殖、分化[26-27]。McBeath等[28]認為不完全鋪展呈圓形的MSCs易向脂肪細胞分化，而充分黏附、平鋪伸展的MSCs更傾向于成骨分化。Park等[29]研究發現MSCs基底剛度降低，改變小G蛋白Rho活性，抑制細胞骨架的組裝和應力纖維的完成，從而使其鋪展面積減小、應力纖維數量減少、增殖率降低。以上研究表明，基底剛度可導致BMSCs骨架重排，應力纖維改變，產生生物化學信號的改變，最終影響其生物學行為（生長、增殖、分化）。本研究發現，在10~40?kPa范圍內，隨著PA剛度提升，大鼠BMSCs鋪展面積越大、增殖越快、成骨分化越明顯，這可能與剛度高的基底能使BMSCs自身蛋白骨架發生重排，細胞肌動蛋白纖維增多、增粗，細胞張力增大[30]有關。在4?kPa與極限剛度（彈性模量75 MPa）條件下均未發現BMSCs在增殖、成骨分化上有差異，提示過高和過低剛度均不能影響大鼠BMSCs的增殖及成骨分化，可能是過低或過高剛度上力學信號都不能轉化為促進大鼠BMSCs增殖及成骨的化學信號。
本研究從生物力學研究角度出發，制備了不同剛度PA，并接種大鼠BMSCs，觀察BMSCs鋪展、生長增殖情況，最終選取了4~40 kPa PA進行成骨分化的部分關鍵蛋白、標志基因檢測，發現10~40?kPa PA能促進大鼠BMSCs增殖與分化，并且40?kPa PA作用最強。本研究結果對認識BMSCs與周圍力學微環境的關聯性，為進一步明確界面剛度變化對BMSCs成骨分化關鍵信號通路、蛋白的調節，闡述其內在分子機制的研究奠定了一定基礎。
