引用本文： 任小梅, 錢宏, 肖正華, 龍海燕, 郭應強, 楊剛. 基于轉谷氨酰胺酶交聯明膠水凝膠的脂肪干細胞培養研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(12): 1532-1537. doi: 10.7507/1002-1892.20160316 復制
脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是從脂肪組織中分離獲得的具有多向分化潛能的多能干細胞，其在體外能穩定增殖且衰亡率低[1-2]，在一定條件下可以分化成脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞及內皮細胞等[3]。Vallières等[4]研究表明ADSCs具有良好的力學性能和適當的內皮化能力。此外，由于ADSCs具有來源豐富、容易獲取等特性，已廣泛用于再生醫學相關研究[5]。但目前研究主要在二維環境進行細胞培養，獲得的細胞因離開了體內細胞外基質（extracellular matrix，ECM）構成的三維立體環境，表現的生物學行為與體內環境中存在較大差異。水凝膠具有與組織ECM相似的結構體系，但是天然水凝膠具有高度水解性，為了提高其穩定性，本研究采用轉谷氨酰胺酶（microbial transglutaminase，mTG）交聯明膠水凝膠，構建三維培養體系，探討mTG交聯明膠水凝膠用于ADSCs三維培養的可行性，為構建ADSCs三維培養的組織工程支架材料提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
40日齡雌性SD大鼠1只，體質量150 g，由四川大學實驗動物中心提供。明膠（B型牛皮明膠）、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、細胞死活染料鈣黃綠素-AM及碘化丙啶（Sigma公司，美國）；mTG（酶活力單位100 U/g；Ajinomoto公司，美國）；H-DMEM培養基（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；細胞增殖檢測染料Alamar-Blue（上海翊圣生物科技有限公司）。
CKX41倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；XDS30熒光顯微鏡（寧波舜宇光學科技有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；Flx800熒光酶標儀（Biotek公司，美國）；掃描電鏡（FEI公司，荷蘭）。
1.2 ADSCs分離培養及鑒定
將SD大鼠脫頸處死，無菌條件下鈍性分離腹股溝處脂肪組織，清洗，剪碎，移入離心管，加入等體積0.05%Ⅰ型膠原酶-0.125%胰蛋白酶消化液后，37℃水浴搖床振蕩消化45 min。用含15%FBS的DMEM中和消化液，過濾后獲單細胞懸液。將單細胞懸液移入另1只離心管，以283×g離心10 min；棄上清，加入紅細胞裂解液重懸細胞，室溫下靜置5?min后去除血細胞，用含10%FBS的DMEM重懸細胞，以283×g離心5 min；棄上清，獲細胞懸液。加入含15%FBS的DMEM，于37℃孵育1 h，將未貼壁細胞轉移至25 cm2培養瓶內，加入含10%FBS、100 U/cm3青霉素、0.1?mg/cm3鏈霉素、0.1?mg/cm3谷氨酰胺的DMEM，于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中培養。24 h后首次換液，以后每周換液2次。當細胞達80%~90%融合時，棄培養基，PBS漂洗3次，加入含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶，于37°C孵育3~5 min，然后加入3~4 mL DMEM終止消化。收集細胞懸液轉移至10 mL離心管，以283×g離心5?min，棄上清液，加入含10%FBS的DMEM重懸細胞懸液，記作P1代細胞，然后按1×104個/cm2傳代。此后，每隔3~5 d進行傳代培養，取P3~P4代細胞用于實驗。參照本課題組既往研究方法[6]，采用流式細胞儀鑒定分離培養細胞為ADSCs。
1.3 mTG交聯明膠水凝膠制備方法
稱取明膠置于PBS中，50℃水浴加速溶解，使明膠濃度達4%（W/V），然后用0.2 μm針式濾器過濾除菌。稱取mTG置于PBS中溶解，使mTG酶濃度達10%（W/V），溶解后過濾除菌備用。按照每克明膠對應10個酶活力單位的mTG比例配制水凝膠，即每毫升4%明膠溶液添加40 μL 10% mTG溶液。將明膠/mTG溶液混合均勻，于37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育6 h，即形成水凝膠。
1.4 ADSCs于水凝膠表面二維培養及觀察
將1.3獲得的明膠/mTG混合溶液加入6孔培養板，每孔2 mL，于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育6 h，形成水凝膠。然后將濃度為5×104個/mL的ADSCs細胞懸液接種至6孔板水凝膠表面，于37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育。待細胞貼壁后，補充適量H-DMEM培養基。此后每3~4天換液1次，共培養2周。
觀測指標：①細胞培養期間，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長形態。②細胞培養第3天取3孔樣本進行細胞死活染色。采用無Ca2+、Mg2+的D-Hank緩沖液漂洗樣本，加入3 μmol/L鈣黃綠素-AM和2?μmol/L碘化丙啶，于37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察，活細胞胞質呈綠色熒光，死細胞胞核呈紅色熒光。以培養皿中常規培養的細胞作為對照。③培養2周后取出樣本，10%中性甲醛固定，分別行HE染色和Masson染色，觀察細胞在水凝膠表面分布形態及細胞分泌膠原纖維情況，分析水凝膠材料的細胞相容性。
1.5 ADSCs于水凝膠中三維培養及觀察
取ADSCs經消化并以283×g離心5 min后，置于1.3中獲得的明膠/mTG混合溶液中并混勻，水凝膠中細胞最終濃度為4×105個/mL；將混合液滴加至35 mm細胞培養皿，置于37℃、5% CO2細胞培養箱孵育6 h，形成包埋細胞的水凝膠。此后每隔2~3天換液1次，共培養2周。
觀測指標：①細胞培養期間，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長形態。②細胞培養第3天取樣本，參照1.4方法進行細胞死活染色觀察。為進一步觀察ADSCs在三維包埋的水凝膠中的空間分布以及細胞存活狀況，2周時染色后采用激光共聚焦顯微鏡觀察，以獲得清晰細胞立體成像圖。③培養2周取出樣本，2.5%戊二醛固定，PBS沖洗3遍，梯度乙醇脫水干燥；剖開干燥后水凝膠樣本，暴露剖面；臨界點干燥，表面噴金，掃描電鏡觀察ADSCs在水凝膠中的黏附情況。④Alamar-Blue法檢測細胞增殖：將ADSCs與明膠/mTG混合溶液混勻后，接種至96孔培養板，每孔50 μL。接種后第0、2、4、6、8、10、12天各取3孔進行Alamar-Blue染色。染色步驟：用PBS漂洗3次，每孔加入100 μL Alamar-Blue染色孵化液（含10%Alamar-Blue染色劑，溶解于DMEM培養基），37℃孵化30min后，收集反應液，用熒光酶標儀在激發光530 nm、發射光590 nm處測定熒光值。取對應時間點培養皿中常規培養的細胞作為對照。
1.6 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 二維培養觀察
倒置相差顯微鏡下觀察，接種24 h內ADSCs即在mTG交聯明膠水凝膠表面黏附并且鋪展生長。第7天，ADSCs已從水凝膠表面向內部生長，細胞生長形態由扁平鋪展狀變為多棱角不規則形狀，部分細胞開始相互連接，形成樹枝狀結構，伸展性較好（圖 1a）。第10天，ADSCs相互連接呈網狀生長形狀（圖 1b）。
圖1
ADSCs在水凝膠表面二維培養觀察?倒置相差顯微鏡下第7天時細胞形態（×10）?倒置相差顯微鏡下第10天時細胞形態（×10）?培養2周HE染色觀察（×10）?培養2周Masson染色觀察（×10）?凝膠表面培養第3天鈣黃綠素-AM染色觀察（熒光顯微鏡×10）?凝膠表面培養第3天碘化丙啶染色觀察（熒光顯微鏡×10）?培養皿培養第3天鈣黃綠素-AM染色觀察（熒光顯微鏡×10）?培養皿培養第3天碘化丙啶染色觀察（熒光顯微鏡×10）
Figure1.
The growth observation of ADSCs in hydrogel 2D culturing ? ADSCs cultured for 7 days under inverted phase contrast microscope (×10) ? ADSCs cultured for 10 days under inverted phase contrast microscope (×10) ? HE staining of ADSCs cultured for 2 weeks (×10) ? Masson staining of ADSCs cultured for 2 weeks (×10) ? The calcein-AM staining of ADSCs cultured for 3 days on the 2D gelatin/mTG gel (Fluorescence microscope×10) ? Propidium iodide staining of ADSCs cultured for 3 days on the 2D gelatin/mTG gel (Fluorescence microscope×10) ? The calcein-AM staining of ADSCs cultured for 3 days on petri dishes (Fluorescence microscope×10) ? Propidium iodide staining of ADSCs cultured for 3 days on petri dishes (Fluorescence microscope×10)
培養2周時，HE染色示細胞胞質和胞核清晰飽滿，細胞生長狀況良好（圖 1c）。Masson染色顯示細胞間已形成了緊密結合的細胞連接，細胞群體呈多層次網狀生長，而且分泌了大量膠原纖維，膠原纖維呈綠染（圖 1d）。
培養第3天鈣黃綠素-AM和碘化丙啶染色觀察，凝膠表面二維培養的細胞及培養皿中常規培養的細胞均能自由鋪展生長、貼壁良好，但細胞呈平面生長，不能立體生長（圖 1e~h）。
2.2 三維培養觀察
倒置相差顯微鏡下觀察，ADSCs包埋在水凝膠中均呈三維生長狀態；接種24 h后，細胞由小圓點狀逐漸伸展出偽足，呈現多棱角不規則形狀；第3天，細胞增殖明顯，而且細胞偽足不斷伸長，形成樹枝狀結構（圖 2a）。
圖2
ADSCs在mTG交聯明膠水凝膠中三維培養觀察?倒置相差顯微鏡下第3天細胞形態（×10）?培養第3天鈣黃綠素-AM染色觀察（熒光顯微鏡×10）?培養第3天碘化丙啶染色觀察（熒光顯微鏡×10）? 培養2周激光共聚焦顯微鏡觀察細胞切片層面（×4）?培養2周激光共聚焦顯微鏡合成的三維立體影像圖（×4）?培養2周掃描電鏡觀察細胞黏附情況（×10）
Figure2.
The growth observation of ADSCs in the gelatin/mTG gel 3D culturing ? ADSCs cultured for 3 days under inverted phase contrast microscope (×10) ? The calcein-AM staining of ADSCs cultured for 3 days (Fluorescence microscope×10) ? Propidium iodide staining of ADSCs cultured for 3 days (Fluorescence microscope×10) ? Observation of the cell slice by laser scanning confocal microscopy cultured for 2 weeks (×4) ? 3D image by laser confocal microscopic synthesis cultured for 2 weeks (×4) ? Cell adhesion in the gelatin gel by scanning electron microscope at 2 weeks (×10)
第3天鈣黃綠素-AM和碘化丙啶染色觀察，水凝膠中細胞生長良好，絕大部分細胞為活細胞，且細胞緊密黏附在水凝膠表面（圖 2b、c）。培養2周激光共聚焦顯微鏡觀察，大量細胞均勻分布于水凝膠中，細胞生長狀態良好，增殖能力強，僅少量細胞死亡（圖 2d、e）。
培養2周掃描電鏡觀察，水凝膠材料表面具有小氣孔結構，ADSCs在水凝膠表面黏附良好，細胞形態完整（圖 2f）。
Alamar-Blue法檢測示，各時間點三維培養的細胞數量低于常規培養細胞，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。但第8天開始三維培養的細胞增殖明顯加快，但常規培養細胞增殖開始減慢。見圖 3。
圖3
培養各時間點ADSCs增殖檢測
Figure3.
The growth curves of ADSCs at different time points
3 討論
體內ECM三維細胞微環境包括大量細胞間相互作用和刺激的信號，這些信號控制著細胞活性和行為。但是，實驗室二維細胞培養環境不具有體內ECM構成的三維立體環境，培養獲得的細胞所表現出的生物學行為與在體內ECM環境中存在較大差異[7]。因此，設計能夠模擬ECM特性的生物材料和三維細胞培養環境對于理解細胞與材料之間的相互作用、完善體外細胞培養系統、推動組織工程和再生醫學的發展具有重要意義。
水凝膠具有與組織ECM相似的結構體系[8-10]，膠原自組后能夠生成供細胞黏附的結合位點，可確保細胞的均勻分布，基于膠原或其他天然聚合物的水凝膠作為一種新型生物材料已受到廣泛關注。但是，天然水凝膠具高度水解性，力學性能和耐久性均較差的缺陷限制了其應用[11-14]。
明膠是膠原的水解產物。首先，明膠具有適合于細胞黏附、移植和分化的結合位點；其次，明膠所含成分大多與天然ECM相似，因此可以為內皮細胞和平滑肌細胞提供與體內細胞生長環境類似的微環境[15]。研究顯示用明膠覆蓋的支架具有良好細胞相容性和抗凝血性[1]。此外，明膠具有優良的生物降解性、無免疫抗原性和價格低廉等特性。但是，天然明膠支架材料因具有高度水解性而缺乏機械強度，從而限制了其應用。這就需要采用交聯方法來加強其機械性能，提高穩定性[16]，如用戊二醛、酰基疊氮、縮水甘油醚、二異氰酸酯等交聯。這些方法交聯后雖然能提高明膠的機械強度，但對細胞具有毒性。
酶促交聯的明膠水凝膠具有良好生物相容性，用于體外細胞培養時具有適合于細胞生長的三維微環境[17-19]。其中mTG作為一種食用交聯蛋白被大量用于制備生物可降解的食用薄膜或食用塑料，以提高蛋白的固化特性[20-22]。mTG是一種酰基轉移酶，可以催化相同或不同蛋白質分子之間的交聯與聚合，形成新的共價鍵。分子間疏水基、離子鍵、共價鍵等對于蛋白質凝膠體系的形成發揮著重要作用，改變共價鍵的數目和強度都會使蛋白質的凝膠性能發生轉變。早期的mTG從哺乳動物獲得，是一種鈣依賴性酶，價格高。1989年，Hiroyasu等[23]從一種稱為Streptoverticillium的微生物中分離出了mTG。mTG是一種非鈣依賴性酶，可采用微生物發酵方法批量生產，原料來源豐富，價格低廉。而且采用mTG交聯明膠無毒副作用。本研究結果表明mTG交聯明膠水凝膠可用于細胞的培養和支架材料的制作。
本研究采用mTG交聯明膠水凝膠作為基質材料，制備ADSCs三維培養支架。將ADSCs種植于mTG交聯明膠水凝膠進行混合培養，通過觀察發現ADSCs生長狀況良好，成活率高，并快速增殖，說明此水凝膠與ADSCs具有良好細胞相容性。在原位封裝的三維結構培養中發現，ADSCs能與水凝膠材料互相黏附，并且能在三維結構中呈樹枝狀伸展，偽足纖細豐富并與鄰近細胞相連，說明采用此水凝膠可以完成對ADSCs的原位封裝，并且在這種三維環境中培養的ADSCs比二維培養的細胞展現出更強細胞活性。這種基于mTG交聯明膠水凝膠構建的ADSC三維培養體系為ADSC的功能化分化研究奠定了基礎，并為構建細胞支架復合材料提供了理論依據。
脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是從脂肪組織中分離獲得的具有多向分化潛能的多能干細胞，其在體外能穩定增殖且衰亡率低[1-2]，在一定條件下可以分化成脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞及內皮細胞等[3]。Vallières等[4]研究表明ADSCs具有良好的力學性能和適當的內皮化能力。此外，由于ADSCs具有來源豐富、容易獲取等特性，已廣泛用于再生醫學相關研究[5]。但目前研究主要在二維環境進行細胞培養，獲得的細胞因離開了體內細胞外基質（extracellular matrix，ECM）構成的三維立體環境，表現的生物學行為與體內環境中存在較大差異。水凝膠具有與組織ECM相似的結構體系，但是天然水凝膠具有高度水解性，為了提高其穩定性，本研究采用轉谷氨酰胺酶（microbial transglutaminase，mTG）交聯明膠水凝膠，構建三維培養體系，探討mTG交聯明膠水凝膠用于ADSCs三維培養的可行性，為構建ADSCs三維培養的組織工程支架材料提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
40日齡雌性SD大鼠1只，體質量150 g，由四川大學實驗動物中心提供。明膠（B型牛皮明膠）、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、細胞死活染料鈣黃綠素-AM及碘化丙啶（Sigma公司，美國）；mTG（酶活力單位100 U/g；Ajinomoto公司，美國）；H-DMEM培養基（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；細胞增殖檢測染料Alamar-Blue（上海翊圣生物科技有限公司）。
CKX41倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；XDS30熒光顯微鏡（寧波舜宇光學科技有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；Flx800熒光酶標儀（Biotek公司，美國）；掃描電鏡（FEI公司，荷蘭）。
1.2 ADSCs分離培養及鑒定
將SD大鼠脫頸處死，無菌條件下鈍性分離腹股溝處脂肪組織，清洗，剪碎，移入離心管，加入等體積0.05%Ⅰ型膠原酶-0.125%胰蛋白酶消化液后，37℃水浴搖床振蕩消化45 min。用含15%FBS的DMEM中和消化液，過濾后獲單細胞懸液。將單細胞懸液移入另1只離心管，以283×g離心10 min；棄上清，加入紅細胞裂解液重懸細胞，室溫下靜置5?min后去除血細胞，用含10%FBS的DMEM重懸細胞，以283×g離心5 min；棄上清，獲細胞懸液。加入含15%FBS的DMEM，于37℃孵育1 h，將未貼壁細胞轉移至25 cm2培養瓶內，加入含10%FBS、100 U/cm3青霉素、0.1?mg/cm3鏈霉素、0.1?mg/cm3谷氨酰胺的DMEM，于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中培養。24 h后首次換液，以后每周換液2次。當細胞達80%~90%融合時，棄培養基，PBS漂洗3次，加入含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶，于37°C孵育3~5 min，然后加入3~4 mL DMEM終止消化。收集細胞懸液轉移至10 mL離心管，以283×g離心5?min，棄上清液，加入含10%FBS的DMEM重懸細胞懸液，記作P1代細胞，然后按1×104個/cm2傳代。此后，每隔3~5 d進行傳代培養，取P3~P4代細胞用于實驗。參照本課題組既往研究方法[6]，采用流式細胞儀鑒定分離培養細胞為ADSCs。
1.3 mTG交聯明膠水凝膠制備方法
稱取明膠置于PBS中，50℃水浴加速溶解，使明膠濃度達4%（W/V），然后用0.2 μm針式濾器過濾除菌。稱取mTG置于PBS中溶解，使mTG酶濃度達10%（W/V），溶解后過濾除菌備用。按照每克明膠對應10個酶活力單位的mTG比例配制水凝膠，即每毫升4%明膠溶液添加40 μL 10% mTG溶液。將明膠/mTG溶液混合均勻，于37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育6 h，即形成水凝膠。
1.4 ADSCs于水凝膠表面二維培養及觀察
將1.3獲得的明膠/mTG混合溶液加入6孔培養板，每孔2 mL，于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育6 h，形成水凝膠。然后將濃度為5×104個/mL的ADSCs細胞懸液接種至6孔板水凝膠表面，于37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育。待細胞貼壁后，補充適量H-DMEM培養基。此后每3~4天換液1次，共培養2周。
觀測指標：①細胞培養期間，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長形態。②細胞培養第3天取3孔樣本進行細胞死活染色。采用無Ca2+、Mg2+的D-Hank緩沖液漂洗樣本，加入3 μmol/L鈣黃綠素-AM和2?μmol/L碘化丙啶，于37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察，活細胞胞質呈綠色熒光，死細胞胞核呈紅色熒光。以培養皿中常規培養的細胞作為對照。③培養2周后取出樣本，10%中性甲醛固定，分別行HE染色和Masson染色，觀察細胞在水凝膠表面分布形態及細胞分泌膠原纖維情況，分析水凝膠材料的細胞相容性。
1.5 ADSCs于水凝膠中三維培養及觀察
取ADSCs經消化并以283×g離心5 min后，置于1.3中獲得的明膠/mTG混合溶液中并混勻，水凝膠中細胞最終濃度為4×105個/mL；將混合液滴加至35 mm細胞培養皿，置于37℃、5% CO2細胞培養箱孵育6 h，形成包埋細胞的水凝膠。此后每隔2~3天換液1次，共培養2周。
觀測指標：①細胞培養期間，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長形態。②細胞培養第3天取樣本，參照1.4方法進行細胞死活染色觀察。為進一步觀察ADSCs在三維包埋的水凝膠中的空間分布以及細胞存活狀況，2周時染色后采用激光共聚焦顯微鏡觀察，以獲得清晰細胞立體成像圖。③培養2周取出樣本，2.5%戊二醛固定，PBS沖洗3遍，梯度乙醇脫水干燥；剖開干燥后水凝膠樣本，暴露剖面；臨界點干燥，表面噴金，掃描電鏡觀察ADSCs在水凝膠中的黏附情況。④Alamar-Blue法檢測細胞增殖：將ADSCs與明膠/mTG混合溶液混勻后，接種至96孔培養板，每孔50 μL。接種后第0、2、4、6、8、10、12天各取3孔進行Alamar-Blue染色。染色步驟：用PBS漂洗3次，每孔加入100 μL Alamar-Blue染色孵化液（含10%Alamar-Blue染色劑，溶解于DMEM培養基），37℃孵化30min后，收集反應液，用熒光酶標儀在激發光530 nm、發射光590 nm處測定熒光值。取對應時間點培養皿中常規培養的細胞作為對照。
1.6 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 二維培養觀察
倒置相差顯微鏡下觀察，接種24 h內ADSCs即在mTG交聯明膠水凝膠表面黏附并且鋪展生長。第7天，ADSCs已從水凝膠表面向內部生長，細胞生長形態由扁平鋪展狀變為多棱角不規則形狀，部分細胞開始相互連接，形成樹枝狀結構，伸展性較好（圖 1a）。第10天，ADSCs相互連接呈網狀生長形狀（圖 1b）。
圖1
ADSCs在水凝膠表面二維培養觀察?倒置相差顯微鏡下第7天時細胞形態（×10）?倒置相差顯微鏡下第10天時細胞形態（×10）?培養2周HE染色觀察（×10）?培養2周Masson染色觀察（×10）?凝膠表面培養第3天鈣黃綠素-AM染色觀察（熒光顯微鏡×10）?凝膠表面培養第3天碘化丙啶染色觀察（熒光顯微鏡×10）?培養皿培養第3天鈣黃綠素-AM染色觀察（熒光顯微鏡×10）?培養皿培養第3天碘化丙啶染色觀察（熒光顯微鏡×10）
Figure1.
The growth observation of ADSCs in hydrogel 2D culturing ? ADSCs cultured for 7 days under inverted phase contrast microscope (×10) ? ADSCs cultured for 10 days under inverted phase contrast microscope (×10) ? HE staining of ADSCs cultured for 2 weeks (×10) ? Masson staining of ADSCs cultured for 2 weeks (×10) ? The calcein-AM staining of ADSCs cultured for 3 days on the 2D gelatin/mTG gel (Fluorescence microscope×10) ? Propidium iodide staining of ADSCs cultured for 3 days on the 2D gelatin/mTG gel (Fluorescence microscope×10) ? The calcein-AM staining of ADSCs cultured for 3 days on petri dishes (Fluorescence microscope×10) ? Propidium iodide staining of ADSCs cultured for 3 days on petri dishes (Fluorescence microscope×10)
培養2周時，HE染色示細胞胞質和胞核清晰飽滿，細胞生長狀況良好（圖 1c）。Masson染色顯示細胞間已形成了緊密結合的細胞連接，細胞群體呈多層次網狀生長，而且分泌了大量膠原纖維，膠原纖維呈綠染（圖 1d）。
培養第3天鈣黃綠素-AM和碘化丙啶染色觀察，凝膠表面二維培養的細胞及培養皿中常規培養的細胞均能自由鋪展生長、貼壁良好，但細胞呈平面生長，不能立體生長（圖 1e~h）。
2.2 三維培養觀察
倒置相差顯微鏡下觀察，ADSCs包埋在水凝膠中均呈三維生長狀態；接種24 h后，細胞由小圓點狀逐漸伸展出偽足，呈現多棱角不規則形狀；第3天，細胞增殖明顯，而且細胞偽足不斷伸長，形成樹枝狀結構（圖 2a）。
圖2
ADSCs在mTG交聯明膠水凝膠中三維培養觀察?倒置相差顯微鏡下第3天細胞形態（×10）?培養第3天鈣黃綠素-AM染色觀察（熒光顯微鏡×10）?培養第3天碘化丙啶染色觀察（熒光顯微鏡×10）? 培養2周激光共聚焦顯微鏡觀察細胞切片層面（×4）?培養2周激光共聚焦顯微鏡合成的三維立體影像圖（×4）?培養2周掃描電鏡觀察細胞黏附情況（×10）
Figure2.
The growth observation of ADSCs in the gelatin/mTG gel 3D culturing ? ADSCs cultured for 3 days under inverted phase contrast microscope (×10) ? The calcein-AM staining of ADSCs cultured for 3 days (Fluorescence microscope×10) ? Propidium iodide staining of ADSCs cultured for 3 days (Fluorescence microscope×10) ? Observation of the cell slice by laser scanning confocal microscopy cultured for 2 weeks (×4) ? 3D image by laser confocal microscopic synthesis cultured for 2 weeks (×4) ? Cell adhesion in the gelatin gel by scanning electron microscope at 2 weeks (×10)
第3天鈣黃綠素-AM和碘化丙啶染色觀察，水凝膠中細胞生長良好，絕大部分細胞為活細胞，且細胞緊密黏附在水凝膠表面（圖 2b、c）。培養2周激光共聚焦顯微鏡觀察，大量細胞均勻分布于水凝膠中，細胞生長狀態良好，增殖能力強，僅少量細胞死亡（圖 2d、e）。
培養2周掃描電鏡觀察，水凝膠材料表面具有小氣孔結構，ADSCs在水凝膠表面黏附良好，細胞形態完整（圖 2f）。
Alamar-Blue法檢測示，各時間點三維培養的細胞數量低于常規培養細胞，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。但第8天開始三維培養的細胞增殖明顯加快，但常規培養細胞增殖開始減慢。見圖 3。
圖3
培養各時間點ADSCs增殖檢測
Figure3.
The growth curves of ADSCs at different time points
3 討論
體內ECM三維細胞微環境包括大量細胞間相互作用和刺激的信號，這些信號控制著細胞活性和行為。但是，實驗室二維細胞培養環境不具有體內ECM構成的三維立體環境，培養獲得的細胞所表現出的生物學行為與在體內ECM環境中存在較大差異[7]。因此，設計能夠模擬ECM特性的生物材料和三維細胞培養環境對于理解細胞與材料之間的相互作用、完善體外細胞培養系統、推動組織工程和再生醫學的發展具有重要意義。
水凝膠具有與組織ECM相似的結構體系[8-10]，膠原自組后能夠生成供細胞黏附的結合位點，可確保細胞的均勻分布，基于膠原或其他天然聚合物的水凝膠作為一種新型生物材料已受到廣泛關注。但是，天然水凝膠具高度水解性，力學性能和耐久性均較差的缺陷限制了其應用[11-14]。
明膠是膠原的水解產物。首先，明膠具有適合于細胞黏附、移植和分化的結合位點；其次，明膠所含成分大多與天然ECM相似，因此可以為內皮細胞和平滑肌細胞提供與體內細胞生長環境類似的微環境[15]。研究顯示用明膠覆蓋的支架具有良好細胞相容性和抗凝血性[1]。此外，明膠具有優良的生物降解性、無免疫抗原性和價格低廉等特性。但是，天然明膠支架材料因具有高度水解性而缺乏機械強度，從而限制了其應用。這就需要采用交聯方法來加強其機械性能，提高穩定性[16]，如用戊二醛、酰基疊氮、縮水甘油醚、二異氰酸酯等交聯。這些方法交聯后雖然能提高明膠的機械強度，但對細胞具有毒性。
酶促交聯的明膠水凝膠具有良好生物相容性，用于體外細胞培養時具有適合于細胞生長的三維微環境[17-19]。其中mTG作為一種食用交聯蛋白被大量用于制備生物可降解的食用薄膜或食用塑料，以提高蛋白的固化特性[20-22]。mTG是一種酰基轉移酶，可以催化相同或不同蛋白質分子之間的交聯與聚合，形成新的共價鍵。分子間疏水基、離子鍵、共價鍵等對于蛋白質凝膠體系的形成發揮著重要作用，改變共價鍵的數目和強度都會使蛋白質的凝膠性能發生轉變。早期的mTG從哺乳動物獲得，是一種鈣依賴性酶，價格高。1989年，Hiroyasu等[23]從一種稱為Streptoverticillium的微生物中分離出了mTG。mTG是一種非鈣依賴性酶，可采用微生物發酵方法批量生產，原料來源豐富，價格低廉。而且采用mTG交聯明膠無毒副作用。本研究結果表明mTG交聯明膠水凝膠可用于細胞的培養和支架材料的制作。
本研究采用mTG交聯明膠水凝膠作為基質材料，制備ADSCs三維培養支架。將ADSCs種植于mTG交聯明膠水凝膠進行混合培養，通過觀察發現ADSCs生長狀況良好，成活率高，并快速增殖，說明此水凝膠與ADSCs具有良好細胞相容性。在原位封裝的三維結構培養中發現，ADSCs能與水凝膠材料互相黏附，并且能在三維結構中呈樹枝狀伸展，偽足纖細豐富并與鄰近細胞相連，說明采用此水凝膠可以完成對ADSCs的原位封裝，并且在這種三維環境中培養的ADSCs比二維培養的細胞展現出更強細胞活性。這種基于mTG交聯明膠水凝膠構建的ADSC三維培養體系為ADSC的功能化分化研究奠定了基礎，并為構建細胞支架復合材料提供了理論依據。
