引用本文： 姚東東, 張潔元, 李兵倉, 周嬋, 劉彬. 嗅鞘細胞在大鼠坐骨神經缺損修復中的炎性調節作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(12): 1538-1544. doi: 10.7507/1002-1892.20160317 復制
周圍神經損傷是顯微外科常見疾病[1]，常需要神經移植修復，但效果常不理想。分析原因除與神經組織高度分化、神經纖維再生緩慢有關外，炎癥/免疫反應的調節作用也引起了廣泛關注[2]。軸突再生受炎性因子調控[3]，整體把握和維持炎性因子的動態平衡[4-5]是了解周圍神經修復中炎癥/免疫反應的關鍵。組織工程的發展使細胞移植治療神經損傷成為近年研究熱點。其中，聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物[poly（lactic acid-co-glycolic acid），PLGA]因具有較好的生物可降解性和相容性，被廣泛用于人工神經研究中。細胞外基質（extracellular matrix，ECM）含有層粘連蛋白、膠原等促進細胞黏附和生長的物質。因此將ECM預置在PLGA導管中，有利于種子細胞在導管內的存活和生長[6]。常用于移植治療周圍神經疾病的細胞有嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cell，OEC）、神經干細胞、雪旺細胞、表皮神經嵴干細胞等[7]。其中，OEC能夠分泌多種神經營養因子和炎性蛋白，促進血管生成，刺激軸突的再生和導向[8-10]，但其炎性調節作用未見報道。本研究擬采用填充OEC的PLGA導管橋接修復大鼠坐骨神經10?mm缺損，檢測修復后神經組織中炎性因子IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α的表達變化，探討OEC移植修復坐骨神經缺損的炎性調節作用，為臨床治療坐骨神經損傷提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2.5月齡綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）轉基因SD（GFP-SD）大鼠10只，成年SD大鼠100只，均為雌性，體質量220~250 g，購于第三軍醫大學大坪醫院動物中心。
DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；PLGA（85：15）、ECM、Hoechst33342（Sigma公司，美國）；凱基蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；小鼠抗大鼠S100多克隆抗體、兔抗大鼠神經生長因子受體（nerve growth factor receptor，NGFR）p75多克隆抗體、TRITC標記山羊抗兔IgG、FITC標記山羊抗小鼠IgG、兔多克隆IL-4抗體、兔多克隆IL-6抗體、兔多克隆TNF-α抗體、小鼠單克隆IL-13抗體、小鼠單克隆actin抗體（Abcam公司，美國）。
SHEL-LAB2300型CO2孵育箱（Sheldo公司，美國）；OPTON47-52-65型解剖顯微鏡（OPTON公司，德國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；ECL化學發光檢測儀（Amersham公司，美國）；八孔道生理記錄儀（Nicolet公司，美國）；Western blot電泳儀、轉膜儀（Invitrogen公司，美國）；CM1800冰凍切片機（Leica公司，德國）；Image J軟件（NIH公司，美國）。
1.2 GFP-OEC分離培養及鑒定
參考Sasaki等[11]方法分離培養GFP-OEC。將10只GFP-SD大鼠斷頸處死，取出嗅球，剝除嗅球頭側2/3軟腦膜、附著毛細血管和白質層，剪碎至1?mm×1?mm×1 mm大小，0.25%胰蛋白酶消化后，收集上層細胞懸液。置于37℃、5%CO2孵育箱培養，3?d后半量換液，以后每2天全量換液1次。于培養7、10 d時倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。取培養10 d的GFP-OEC，調整細胞濃度為1×105個/μL，備用。
培養7 d時GFP-OEC蓋玻片爬片，10 d時4%多聚甲醛液固定30 min，PBS洗5 min×3次；山羊血清封閉2 h；加入一抗混合工作液：兔抗大鼠NGFRp75多克隆抗體（1：100）、小鼠抗大鼠S100多克隆抗體（1：100），4℃過夜孵育，PBS洗5?min×3次；加入二抗混合工作液：TRITC標記山羊抗兔IgG和FITC標記山羊抗小鼠IgG（1：50），37℃避光孵育2?h，PBS洗5 min×3次；加入Hoechst33342（1：200），37℃避光孵育30 min，PBS洗5?min×3次。晾干封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.3 實驗分組及方法
參考Sundback等[12]方法制備長15 mm、內徑1.5?mm、壁厚0.5 mm的PLGA導管，手術前用DMEM無血清培養基孵育12 h。取GFP-OEC細胞懸液與ECM等量混合，制備混合液；另取DMEM與ECM等量混合。
將100只成年SD大鼠隨機分為兩組，其中實驗組55只、對照組45只。兩組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后，俯臥位固定；作切口暴露右側坐骨神經，于梨狀肌下緣5 mm處切除遠端坐骨神經，制備10?mm長坐骨神經缺損模型。取PLGA導管套接于神經兩斷端，7-0無創縫線縫合神經外膜于PLGA導管上。實驗組：在神經導管兩端用顯微注射器分別注入12.5 μL GFP-OEC與ECM混合液；對照組：在神經導管兩端分別注入等量DMEM和ECM混合液。用2-0縫線依次縫合肌肉、皮膚。術后1周內每日肌肉注射青霉素（40萬U/kg），腹腔注射環孢霉素（10?mg/kg）。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
術后觀察大鼠成活以及切口愈合情況，記錄足跟部皮膚有無潰瘍形成、有無自噬現象。
1.4.2 Western blot檢測IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α的表達
術后6 h、1 d、3 d以及1、2、3、4、6周，兩組各取4只大鼠同上法麻醉后，按照原手術入路，暴露并取出包括PLGA導管的神經組織（長約20?mm）。采用凱基蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度，濃度調整一致后等體積上樣，電泳分離蛋白，濕轉至聚偏二氟乙烯膜，室溫封閉2 h，一抗IL-4（1：2 500）、IL-6（1：500）、IL-13（1：500）、TNF-α（1：1 000）和actin（1：3?000），4℃孵育過夜；二抗孵育2 h，化學發光顯影拍照，用Image J軟件分析各條帶灰度值，以actin作為內參對照，采用同一泳道目標蛋白與actin的比值，作為IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α的相對表達量。
1.4.3 組織學觀察
術后2、4、6周，實驗組各取4只大鼠依次快速灌注生理鹽水100~200 mL，切取PLGA導管內再生神經組織，冰凍切片機縱切片，片厚10?μm，熒光顯微鏡下觀察移植GFP-OEC存活情況；術后9周，兩組各取5只（感覺及運動功能檢測實驗后）大鼠同上法灌注，切取導管內再生神經組織，石蠟包埋后縱切片，HE染色，自然晾干后中性樹脂封片，光鏡下觀察再生神經組織形態。
1.4.4 坐骨神經功能評價
①感覺及運動功能檢測術后9周，兩組各取5只大鼠，將兩側后足分別浸入50℃熱水中，記錄后足回縮時間，以評估痛溫覺（避免組織熱損傷）[13]。采用自制大鼠足印跡行走盒（長80?cm，寬10 cm），記錄大鼠后足足印跡。測量大鼠后足印長（print length，PL）、中間趾展（intermediary toe spread，ITS）、趾展（toe spread，TS），每只動物測量5對足印跡。參照以下公式計算坐骨神經功能指數（sciatic nerve function index，SFI）：SFI=-38.3×PLF+109.5×TSF+13.3×ITF-8.8。其中PLF=（EPL-NPL）/NPL，ITF=（EITS-NITS）/NITS，TSF=（ETS-NTS）/NTS。N代表正常側，E代表實驗側[14]。
②神經電生理檢測：術后9周，兩組各取5只大鼠，同上法麻醉后，作切口暴露并游離兩側坐骨神經。采用八孔道生理記錄儀，雙鉤形刺激電極（極間距2?mm）實驗側置于導管近端距梨狀肌下緣約3 mm的神經干下方，正常側位置相同；雙極針形記錄電極插入踝關節上方10 mm處的腓腸肌中部，兩極排列方向與腓腸肌纖維方向垂直，極尖端相距2?mm，深度約5?mm；接地線電極插入鼠尾部。刺激強度10 mA，刺激間期0.25 ms，每只動物重復測量5次，記錄波形圖，通過Powerlab軟件測量肌肉動作電位潛伏期、復合肌肉動作電位波幅[15]。
1.5 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 GFP-OEC觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，培養7 d時，細胞增殖明顯，形態以雙極形為主（圖 1a）；培養10 d時，細胞形態清楚，胞體較小，細胞突起更細長，網狀結構更致密（圖 1b）。NGFRp75、S100和Hoechst33342免疫熒光染色觀察示，細胞質呈紅色和綠色熒光，細胞核呈藍色熒光，提示原代培養細胞為GFP-OEC（圖 1c~f）。
圖1
GFP-OEC的原代培養及鑒定?培養7 d倒置相差顯微鏡觀察細胞形態（×40）?培養10 d倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態（×40）?培養10 d NGFRp75免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）?培養10 d S100免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）?培養10 d Hoechst33342免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）? NGFRp75、S100、Hoechst33342免疫熒光染色疊加圖
Figure1.
Primary culture and identification of GFP-OEC ? Morphological observation of GFP-OEC under inverted phase contrast microscope at 7 days (×40) ? Morphological observation of GFP-OEC under inverted phase contrast microscope at 10 days (×40) ? Immunofluorescence staining of NGFRp75 at 10 days (Fluorescence microscope×200) ? Immunofluorescence staining of S100 at 10 days (Fluorescence microscope×200) ? Nuclear labeling of Hoechst33342 at 10 days (Fluorescence microscope×200) ? Superposition of NGFRp75, S100, and Hoechst33342
2.2 一般情況
術后兩組大鼠切口均愈合良好。實驗期間，實驗組及對照組各有1只及3只大鼠死亡。術后1周，所有大鼠開始出現不同程度足跟部紅腫和潰瘍。9周時，對照組36只大鼠足跟部潰瘍愈合，6只大鼠出現腳趾自噬現象，大鼠后肢運動功能基本恢復；實驗組52只大鼠足跟部潰瘍愈合，2只大鼠出現腳趾自噬現象，大鼠后肢運動功能優于對照組。
2.3 Western blot檢測IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α的表達
2.3.1 IL-4
術后兩組IL-4相對表達量總體呈先升高、后降低、再升高的趨勢，且實驗組在1 d和3周時、對照組在1 d和2周時出現2次峰值。其中，2~6周實驗組IL-4相對表達量均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05)。見圖 2、3a。
圖2
Western blot檢測IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α表達Mr：相對分子質量1：6 h 2：1 d 3：3 d 4：1周5：2周6：3周7：4周8：6周?實驗組?對照組??圖 3?兩組IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α相對表達量比較? IL-4 ? IL-6 ? IL-13 ? TNF-α
Figure2.
Expressions of IL-4, IL-6, IL-13, and TNF-α by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: At 6 hours 2: At 1 day 3: At 3 days 4: At 1 week 5: At 2 weeks 6: At 3 weeks 7: At 4 weeks 8: At 6 weeks ? Experimental group ? Control group ??Fig.3 Comparison of relative expressions of IL-4, IL-6, IL-13, and TNF-α between 2 groups ? IL-4 ? IL-6 ? IL-13 ? TNF-α
2.3.2 IL-6
術后兩組IL-6相對表達量總體呈先降低、再升高的趨勢，1周時出現最低值。各時間點實驗組IL-6相對表達量均低于對照組，其中3 d、1周時比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2、3b。
2.3.3 IL-13
術后兩組IL-13相對表達量總體呈先增加、后降低、再緩慢升高后降低的趨勢，于1 d和3周時出現2次峰值。各時間點實驗組IL-13相對表達量高于對照組，其中1 d以及3~6周時比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2、3c。
2.3.4 TNF-α
術后兩組TNF-α相對表達量總體呈現先升高后降低的趨勢，1周時達峰值。各時間點實驗組TNF-α相對表達量低于對照組，其中3 d、1周時比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2、3d。
2.4 組織學觀察
術后2、4、6周熒光顯微鏡下觀察，實驗組神經移植體內神經再生端均有GFP-OEC存活，顯示綠色熒光呈團分布（圖 4）。術后9周HE染色示，與正常坐骨神經組織相比，實驗組移植體內再生神經組織較松散，細胞形態不規則；對照組移植體內再生神經組織成泡狀空隙，細胞明顯減少（圖 5）。
圖4
術后實驗組熒光顯微鏡觀察（×200）?術后2周?術后4周?術后6周??圖 5?術后9周兩組HE染色觀察?實驗組（×40）?對照組（×40）?實驗組（×200）?對照組（×200）
Figure4.
Observation of GFP-OEC under fluorescence microscope in the experimental group after operation (×200) ? At 2 weeks after operation ? At 4 weeks after operation ? At 6 weeks after operation ??Fig.5 HE staining of 2 groups at 9 weeks after operation ? Experimental group (×40) ? Control group (×40) ? Experimental group (×200) ? Control group (×200)
2.5 坐骨神經功能評價
2.5.1 感覺及運動功能檢測
術后9周，實驗組大鼠感覺及運動功能明顯好轉，后足回縮時間為（2.36±0.26）s、SFI為-76.67±4.77，顯著優于對照組的（3.19±0.18）s及-88.31±1.39，比較差異有統計學意義（t=5.778，P=0.000；t=-5.236，P=0.001）。
2.5.2 神經電生理檢測
術后9周，實驗組肌肉動作電位潛伏期為（2.90±1.10）ms、復合肌肉動作電位波幅為（2.18±0.61）mV，對照組分別為（5.20±1.20）ms、（0.50±0.37）mV，兩組比較差異均有統計學意義（t=3.156，P=0.013；t=-5.265，P=0.001）。
3 討論
研究表明，原代培養的OEC分泌的纖維連接蛋白能夠促進雪旺細胞和巨噬細胞的增殖和遷移[16-17]。將OEC植入損傷脊髓，可顯著抑制星形膠質細胞的活化，而星形膠質細胞作為脊髓內重要的炎性細胞，參與合成分泌眾多炎性調節介質，啟動免疫調節修復[18]。近期有研究發現，將原代培養的OEC和雪旺細胞聯合植入挫傷的脊髓后，兩者能夠協同性地抑制促炎因子IL-6和TNF-α的表達，促進抗炎因子IL-10和IL-13的表達，實現良好修復[19]。本實驗Western blot檢測結果表明：與對照組比較，實驗組移植OEC對大鼠缺損坐骨神經組織炎性因子的表達產生了一定調控作用，即OEC移植后可以抑制促炎因子IL-6和TNF-α的表達，同時促進抗炎因子IL-4和IL-13的表達，初步驗證了OEC修復坐骨神經損傷潛在的炎性調節作用。
另外，我們還發現坐骨神經損傷后前期（急性期和亞急性期）主要以促炎因子IL-6和TNF-α的表達作用為主，抗炎因子IL-4和IL-13主要在炎癥后期（慢性期）發揮作用。IL-6在炎癥初始階段能夠誘導多種細胞分泌急性期蛋白，與TNF-α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-8等炎性因子協同控制局部炎性反應[20]，其在炎癥急性期高表達，同時在炎癥慢性期也有一定表達，總體呈降低、再升高的趨勢。這可能與IL-6的雙重作用性質有關，在急性期IL-6表達量迅速升高，誘導化學趨化因子聚集大量炎性細胞，導致內皮細胞、神經元等損傷；在慢性期IL-6低水平表達，可以保護和修復神經元。TNF-α作為細菌感染、組織破壞等刺激激活巨噬細胞而產生的促炎反應啟動因子，其能介導IL-6等其他炎性因子產生和釋放，誘導細胞凋亡等[21]。TNF-α在炎癥前期高表達，同時在炎癥慢性期低表達，總體呈先增加后降低的趨勢。這可能與TNF-α的雙向作用有關，高表達會引發細胞因子的級聯反應，加重炎性反應，低濃度的TNF-α則參與清除壞死組織和促進重構。IL-4能抑制單核巨噬細胞產生，誘導M2型巨噬細胞的極化，下調TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子[22]，其在炎癥急性期和慢性期都有一定表達，總體呈先升高、后降低、再升高的趨勢，這可能與IL-4能夠誘導M2型巨噬細胞的極化，參與抗炎反應有關。IL-13作為由T淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞產生的多效性抗炎因子，能夠抑制單核巨噬細胞的產生和炎性因子IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等基因的轉錄和蛋白合成[23]，其在炎癥慢性期高表達，總體呈先增加、后降低、再緩慢升高后降低的趨勢，并有雙相升高的規律，第2次峰值增高比第1次更明顯，這可能與下調TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子表達有關。
本實驗大體觀察及組織學染色示：與對照組比較，實驗組中大鼠坐骨神經恢復更理想、缺損坐骨神經結構修復更滿意；通過兩組大鼠的后足回縮時間、坐骨神經功能指數、肌肉動作電位潛伏期及復合肌肉動作電位波幅比較，發現實驗組大鼠坐骨神經功能恢復效果更優。說明實驗組方法能夠有效地促進坐骨神經結構和功能的修復。
另外，本實驗也存在一定不足。例如，缺少坐骨神經修復的“金標準”--自體神經移植組。本課題組前期研究表明，與OEC、雪旺細胞等種子細胞構成的人工神經相比，自體神經移植能更好地促進坐骨神經結構和功能的恢復[24]。但因本實驗旨在觀察OEC移植后對缺損坐骨神經局部微環境內的炎性因子（IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α）的調節作用，考慮自體坐骨神經中無OEC，用其對照不能充分說明OEC移植后對缺損坐骨神經微環境中的炎性因子調節作用，故未設置自體神經移植對照組。
綜上述，OEC移植后對大鼠缺損坐骨神經組織炎性因子的表達具有一定調控作用，炎性因子作為炎性反應中聯系機體組織與炎性細胞的樞紐，其促炎或抗炎作用在機體中相互制約和影響，趨于動態平衡，進而有效地促進缺損坐骨神經結構和功能的修復。在不同炎癥階段，參與的炎性細胞和炎性因子及其相關的炎性調節機制等亦需要進一步闡明。
周圍神經損傷是顯微外科常見疾病[1]，常需要神經移植修復，但效果常不理想。分析原因除與神經組織高度分化、神經纖維再生緩慢有關外，炎癥/免疫反應的調節作用也引起了廣泛關注[2]。軸突再生受炎性因子調控[3]，整體把握和維持炎性因子的動態平衡[4-5]是了解周圍神經修復中炎癥/免疫反應的關鍵。組織工程的發展使細胞移植治療神經損傷成為近年研究熱點。其中，聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物[poly（lactic acid-co-glycolic acid），PLGA]因具有較好的生物可降解性和相容性，被廣泛用于人工神經研究中。細胞外基質（extracellular matrix，ECM）含有層粘連蛋白、膠原等促進細胞黏附和生長的物質。因此將ECM預置在PLGA導管中，有利于種子細胞在導管內的存活和生長[6]。常用于移植治療周圍神經疾病的細胞有嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cell，OEC）、神經干細胞、雪旺細胞、表皮神經嵴干細胞等[7]。其中，OEC能夠分泌多種神經營養因子和炎性蛋白，促進血管生成，刺激軸突的再生和導向[8-10]，但其炎性調節作用未見報道。本研究擬采用填充OEC的PLGA導管橋接修復大鼠坐骨神經10?mm缺損，檢測修復后神經組織中炎性因子IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α的表達變化，探討OEC移植修復坐骨神經缺損的炎性調節作用，為臨床治療坐骨神經損傷提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2.5月齡綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）轉基因SD（GFP-SD）大鼠10只，成年SD大鼠100只，均為雌性，體質量220~250 g，購于第三軍醫大學大坪醫院動物中心。
DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；PLGA（85：15）、ECM、Hoechst33342（Sigma公司，美國）；凱基蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；小鼠抗大鼠S100多克隆抗體、兔抗大鼠神經生長因子受體（nerve growth factor receptor，NGFR）p75多克隆抗體、TRITC標記山羊抗兔IgG、FITC標記山羊抗小鼠IgG、兔多克隆IL-4抗體、兔多克隆IL-6抗體、兔多克隆TNF-α抗體、小鼠單克隆IL-13抗體、小鼠單克隆actin抗體（Abcam公司，美國）。
SHEL-LAB2300型CO2孵育箱（Sheldo公司，美國）；OPTON47-52-65型解剖顯微鏡（OPTON公司，德國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；ECL化學發光檢測儀（Amersham公司，美國）；八孔道生理記錄儀（Nicolet公司，美國）；Western blot電泳儀、轉膜儀（Invitrogen公司，美國）；CM1800冰凍切片機（Leica公司，德國）；Image J軟件（NIH公司，美國）。
1.2 GFP-OEC分離培養及鑒定
參考Sasaki等[11]方法分離培養GFP-OEC。將10只GFP-SD大鼠斷頸處死，取出嗅球，剝除嗅球頭側2/3軟腦膜、附著毛細血管和白質層，剪碎至1?mm×1?mm×1 mm大小，0.25%胰蛋白酶消化后，收集上層細胞懸液。置于37℃、5%CO2孵育箱培養，3?d后半量換液，以后每2天全量換液1次。于培養7、10 d時倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。取培養10 d的GFP-OEC，調整細胞濃度為1×105個/μL，備用。
培養7 d時GFP-OEC蓋玻片爬片，10 d時4%多聚甲醛液固定30 min，PBS洗5 min×3次；山羊血清封閉2 h；加入一抗混合工作液：兔抗大鼠NGFRp75多克隆抗體（1：100）、小鼠抗大鼠S100多克隆抗體（1：100），4℃過夜孵育，PBS洗5?min×3次；加入二抗混合工作液：TRITC標記山羊抗兔IgG和FITC標記山羊抗小鼠IgG（1：50），37℃避光孵育2?h，PBS洗5 min×3次；加入Hoechst33342（1：200），37℃避光孵育30 min，PBS洗5?min×3次。晾干封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.3 實驗分組及方法
參考Sundback等[12]方法制備長15 mm、內徑1.5?mm、壁厚0.5 mm的PLGA導管，手術前用DMEM無血清培養基孵育12 h。取GFP-OEC細胞懸液與ECM等量混合，制備混合液；另取DMEM與ECM等量混合。
將100只成年SD大鼠隨機分為兩組，其中實驗組55只、對照組45只。兩組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后，俯臥位固定；作切口暴露右側坐骨神經，于梨狀肌下緣5 mm處切除遠端坐骨神經，制備10?mm長坐骨神經缺損模型。取PLGA導管套接于神經兩斷端，7-0無創縫線縫合神經外膜于PLGA導管上。實驗組：在神經導管兩端用顯微注射器分別注入12.5 μL GFP-OEC與ECM混合液；對照組：在神經導管兩端分別注入等量DMEM和ECM混合液。用2-0縫線依次縫合肌肉、皮膚。術后1周內每日肌肉注射青霉素（40萬U/kg），腹腔注射環孢霉素（10?mg/kg）。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
術后觀察大鼠成活以及切口愈合情況，記錄足跟部皮膚有無潰瘍形成、有無自噬現象。
1.4.2 Western blot檢測IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α的表達
術后6 h、1 d、3 d以及1、2、3、4、6周，兩組各取4只大鼠同上法麻醉后，按照原手術入路，暴露并取出包括PLGA導管的神經組織（長約20?mm）。采用凱基蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度，濃度調整一致后等體積上樣，電泳分離蛋白，濕轉至聚偏二氟乙烯膜，室溫封閉2 h，一抗IL-4（1：2 500）、IL-6（1：500）、IL-13（1：500）、TNF-α（1：1 000）和actin（1：3?000），4℃孵育過夜；二抗孵育2 h，化學發光顯影拍照，用Image J軟件分析各條帶灰度值，以actin作為內參對照，采用同一泳道目標蛋白與actin的比值，作為IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α的相對表達量。
1.4.3 組織學觀察
術后2、4、6周，實驗組各取4只大鼠依次快速灌注生理鹽水100~200 mL，切取PLGA導管內再生神經組織，冰凍切片機縱切片，片厚10?μm，熒光顯微鏡下觀察移植GFP-OEC存活情況；術后9周，兩組各取5只（感覺及運動功能檢測實驗后）大鼠同上法灌注，切取導管內再生神經組織，石蠟包埋后縱切片，HE染色，自然晾干后中性樹脂封片，光鏡下觀察再生神經組織形態。
1.4.4 坐骨神經功能評價
①感覺及運動功能檢測術后9周，兩組各取5只大鼠，將兩側后足分別浸入50℃熱水中，記錄后足回縮時間，以評估痛溫覺（避免組織熱損傷）[13]。采用自制大鼠足印跡行走盒（長80?cm，寬10 cm），記錄大鼠后足足印跡。測量大鼠后足印長（print length，PL）、中間趾展（intermediary toe spread，ITS）、趾展（toe spread，TS），每只動物測量5對足印跡。參照以下公式計算坐骨神經功能指數（sciatic nerve function index，SFI）：SFI=-38.3×PLF+109.5×TSF+13.3×ITF-8.8。其中PLF=（EPL-NPL）/NPL，ITF=（EITS-NITS）/NITS，TSF=（ETS-NTS）/NTS。N代表正常側，E代表實驗側[14]。
②神經電生理檢測：術后9周，兩組各取5只大鼠，同上法麻醉后，作切口暴露并游離兩側坐骨神經。采用八孔道生理記錄儀，雙鉤形刺激電極（極間距2?mm）實驗側置于導管近端距梨狀肌下緣約3 mm的神經干下方，正常側位置相同；雙極針形記錄電極插入踝關節上方10 mm處的腓腸肌中部，兩極排列方向與腓腸肌纖維方向垂直，極尖端相距2?mm，深度約5?mm；接地線電極插入鼠尾部。刺激強度10 mA，刺激間期0.25 ms，每只動物重復測量5次，記錄波形圖，通過Powerlab軟件測量肌肉動作電位潛伏期、復合肌肉動作電位波幅[15]。
1.5 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 GFP-OEC觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，培養7 d時，細胞增殖明顯，形態以雙極形為主（圖 1a）；培養10 d時，細胞形態清楚，胞體較小，細胞突起更細長，網狀結構更致密（圖 1b）。NGFRp75、S100和Hoechst33342免疫熒光染色觀察示，細胞質呈紅色和綠色熒光，細胞核呈藍色熒光，提示原代培養細胞為GFP-OEC（圖 1c~f）。
圖1
GFP-OEC的原代培養及鑒定?培養7 d倒置相差顯微鏡觀察細胞形態（×40）?培養10 d倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態（×40）?培養10 d NGFRp75免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）?培養10 d S100免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）?培養10 d Hoechst33342免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）? NGFRp75、S100、Hoechst33342免疫熒光染色疊加圖
Figure1.
Primary culture and identification of GFP-OEC ? Morphological observation of GFP-OEC under inverted phase contrast microscope at 7 days (×40) ? Morphological observation of GFP-OEC under inverted phase contrast microscope at 10 days (×40) ? Immunofluorescence staining of NGFRp75 at 10 days (Fluorescence microscope×200) ? Immunofluorescence staining of S100 at 10 days (Fluorescence microscope×200) ? Nuclear labeling of Hoechst33342 at 10 days (Fluorescence microscope×200) ? Superposition of NGFRp75, S100, and Hoechst33342
2.2 一般情況
術后兩組大鼠切口均愈合良好。實驗期間，實驗組及對照組各有1只及3只大鼠死亡。術后1周，所有大鼠開始出現不同程度足跟部紅腫和潰瘍。9周時，對照組36只大鼠足跟部潰瘍愈合，6只大鼠出現腳趾自噬現象，大鼠后肢運動功能基本恢復；實驗組52只大鼠足跟部潰瘍愈合，2只大鼠出現腳趾自噬現象，大鼠后肢運動功能優于對照組。
2.3 Western blot檢測IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α的表達
2.3.1 IL-4
術后兩組IL-4相對表達量總體呈先升高、后降低、再升高的趨勢，且實驗組在1 d和3周時、對照組在1 d和2周時出現2次峰值。其中，2~6周實驗組IL-4相對表達量均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05)。見圖 2、3a。
圖2
Western blot檢測IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α表達Mr：相對分子質量1：6 h 2：1 d 3：3 d 4：1周5：2周6：3周7：4周8：6周?實驗組?對照組??圖 3?兩組IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α相對表達量比較? IL-4 ? IL-6 ? IL-13 ? TNF-α
Figure2.
Expressions of IL-4, IL-6, IL-13, and TNF-α by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: At 6 hours 2: At 1 day 3: At 3 days 4: At 1 week 5: At 2 weeks 6: At 3 weeks 7: At 4 weeks 8: At 6 weeks ? Experimental group ? Control group ??Fig.3 Comparison of relative expressions of IL-4, IL-6, IL-13, and TNF-α between 2 groups ? IL-4 ? IL-6 ? IL-13 ? TNF-α
2.3.2 IL-6
術后兩組IL-6相對表達量總體呈先降低、再升高的趨勢，1周時出現最低值。各時間點實驗組IL-6相對表達量均低于對照組，其中3 d、1周時比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2、3b。
2.3.3 IL-13
術后兩組IL-13相對表達量總體呈先增加、后降低、再緩慢升高后降低的趨勢，于1 d和3周時出現2次峰值。各時間點實驗組IL-13相對表達量高于對照組，其中1 d以及3~6周時比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2、3c。
2.3.4 TNF-α
術后兩組TNF-α相對表達量總體呈現先升高后降低的趨勢，1周時達峰值。各時間點實驗組TNF-α相對表達量低于對照組，其中3 d、1周時比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2、3d。
2.4 組織學觀察
術后2、4、6周熒光顯微鏡下觀察，實驗組神經移植體內神經再生端均有GFP-OEC存活，顯示綠色熒光呈團分布（圖 4）。術后9周HE染色示，與正常坐骨神經組織相比，實驗組移植體內再生神經組織較松散，細胞形態不規則；對照組移植體內再生神經組織成泡狀空隙，細胞明顯減少（圖 5）。
圖4
術后實驗組熒光顯微鏡觀察（×200）?術后2周?術后4周?術后6周??圖 5?術后9周兩組HE染色觀察?實驗組（×40）?對照組（×40）?實驗組（×200）?對照組（×200）
Figure4.
Observation of GFP-OEC under fluorescence microscope in the experimental group after operation (×200) ? At 2 weeks after operation ? At 4 weeks after operation ? At 6 weeks after operation ??Fig.5 HE staining of 2 groups at 9 weeks after operation ? Experimental group (×40) ? Control group (×40) ? Experimental group (×200) ? Control group (×200)
2.5 坐骨神經功能評價
2.5.1 感覺及運動功能檢測
術后9周，實驗組大鼠感覺及運動功能明顯好轉，后足回縮時間為（2.36±0.26）s、SFI為-76.67±4.77，顯著優于對照組的（3.19±0.18）s及-88.31±1.39，比較差異有統計學意義（t=5.778，P=0.000；t=-5.236，P=0.001）。
2.5.2 神經電生理檢測
術后9周，實驗組肌肉動作電位潛伏期為（2.90±1.10）ms、復合肌肉動作電位波幅為（2.18±0.61）mV，對照組分別為（5.20±1.20）ms、（0.50±0.37）mV，兩組比較差異均有統計學意義（t=3.156，P=0.013；t=-5.265，P=0.001）。
3 討論
研究表明，原代培養的OEC分泌的纖維連接蛋白能夠促進雪旺細胞和巨噬細胞的增殖和遷移[16-17]。將OEC植入損傷脊髓，可顯著抑制星形膠質細胞的活化，而星形膠質細胞作為脊髓內重要的炎性細胞，參與合成分泌眾多炎性調節介質，啟動免疫調節修復[18]。近期有研究發現，將原代培養的OEC和雪旺細胞聯合植入挫傷的脊髓后，兩者能夠協同性地抑制促炎因子IL-6和TNF-α的表達，促進抗炎因子IL-10和IL-13的表達，實現良好修復[19]。本實驗Western blot檢測結果表明：與對照組比較，實驗組移植OEC對大鼠缺損坐骨神經組織炎性因子的表達產生了一定調控作用，即OEC移植后可以抑制促炎因子IL-6和TNF-α的表達，同時促進抗炎因子IL-4和IL-13的表達，初步驗證了OEC修復坐骨神經損傷潛在的炎性調節作用。
另外，我們還發現坐骨神經損傷后前期（急性期和亞急性期）主要以促炎因子IL-6和TNF-α的表達作用為主，抗炎因子IL-4和IL-13主要在炎癥后期（慢性期）發揮作用。IL-6在炎癥初始階段能夠誘導多種細胞分泌急性期蛋白，與TNF-α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-8等炎性因子協同控制局部炎性反應[20]，其在炎癥急性期高表達，同時在炎癥慢性期也有一定表達，總體呈降低、再升高的趨勢。這可能與IL-6的雙重作用性質有關，在急性期IL-6表達量迅速升高，誘導化學趨化因子聚集大量炎性細胞，導致內皮細胞、神經元等損傷；在慢性期IL-6低水平表達，可以保護和修復神經元。TNF-α作為細菌感染、組織破壞等刺激激活巨噬細胞而產生的促炎反應啟動因子，其能介導IL-6等其他炎性因子產生和釋放，誘導細胞凋亡等[21]。TNF-α在炎癥前期高表達，同時在炎癥慢性期低表達，總體呈先增加后降低的趨勢。這可能與TNF-α的雙向作用有關，高表達會引發細胞因子的級聯反應，加重炎性反應，低濃度的TNF-α則參與清除壞死組織和促進重構。IL-4能抑制單核巨噬細胞產生，誘導M2型巨噬細胞的極化，下調TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子[22]，其在炎癥急性期和慢性期都有一定表達，總體呈先升高、后降低、再升高的趨勢，這可能與IL-4能夠誘導M2型巨噬細胞的極化，參與抗炎反應有關。IL-13作為由T淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞產生的多效性抗炎因子，能夠抑制單核巨噬細胞的產生和炎性因子IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等基因的轉錄和蛋白合成[23]，其在炎癥慢性期高表達，總體呈先增加、后降低、再緩慢升高后降低的趨勢，并有雙相升高的規律，第2次峰值增高比第1次更明顯，這可能與下調TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子表達有關。
本實驗大體觀察及組織學染色示：與對照組比較，實驗組中大鼠坐骨神經恢復更理想、缺損坐骨神經結構修復更滿意；通過兩組大鼠的后足回縮時間、坐骨神經功能指數、肌肉動作電位潛伏期及復合肌肉動作電位波幅比較，發現實驗組大鼠坐骨神經功能恢復效果更優。說明實驗組方法能夠有效地促進坐骨神經結構和功能的修復。
另外，本實驗也存在一定不足。例如，缺少坐骨神經修復的“金標準”--自體神經移植組。本課題組前期研究表明，與OEC、雪旺細胞等種子細胞構成的人工神經相比，自體神經移植能更好地促進坐骨神經結構和功能的恢復[24]。但因本實驗旨在觀察OEC移植后對缺損坐骨神經局部微環境內的炎性因子（IL-4、IL-6、IL-13和TNF-α）的調節作用，考慮自體坐骨神經中無OEC，用其對照不能充分說明OEC移植后對缺損坐骨神經微環境中的炎性因子調節作用，故未設置自體神經移植對照組。
綜上述，OEC移植后對大鼠缺損坐骨神經組織炎性因子的表達具有一定調控作用，炎性因子作為炎性反應中聯系機體組織與炎性細胞的樞紐，其促炎或抗炎作用在機體中相互制約和影響，趨于動態平衡，進而有效地促進缺損坐骨神經結構和功能的修復。在不同炎癥階段，參與的炎性細胞和炎性因子及其相關的炎性調節機制等亦需要進一步闡明。
