引用本文： 遲博婧, 劉光源, 邢磊, 田發明. Hedgehog信號通路調控骨形成及BMSCs成骨分化的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(12): 1545-1550. doi: 10.7507/1002-1892.20160318 復制
骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量低下、骨微結構損壞導致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身骨病[1-2]。BMSCs的減少及成骨細胞和脂肪細胞的分化失平衡最終導致骨形成減少，是老年OP的病因基礎之一[3-4]。BMSCs的成骨分化是影響骨形成乃至骨量的主要因素之一，這一過程受到多個信號通路及細胞因子的調控，如Wnt、BMP/Smads、Hedgehog及Notch信號通路。Hedgehog信號通路是一條保守且重要的信號通路，參與多種類型細胞的分化、增殖，并在諸多組織和器官的發育中起著關鍵作用[5]；另外，調控Hedgehog信號通路的一些藥物可用于治療Hedgehog信號擾亂引起的相關疾病[6]。近年研究顯示，Hedgehog信號通路可誘導BMSCs分化為成骨細胞，同時抑制其向脂肪細胞分化[5]，并可促進骨形成，這一過程伴有與其他相關因子和信號通路間的相互調節和影響。但因細胞來源和分化階段的不同，不同研究中Hedgehog信號通路對BMSCs成骨分化過程中特異性成骨分化標志物表達的作用不一致。現綜合目前國內外相關研究，就Hedgehog信號通路對骨形成及BMSCs成骨分化的調控及其分子機制的研究成果作一綜述，為相關研究提供理論依據和參考。
1 Hedgehog信號通路的組成及Hedgehog信號細胞內的調控機制
Hedgehog信號通路在胚胎發育和組織穩態及調控細胞的生長過程中起著重要作用。1980年有研究通過基因篩選首次在果蠅中發現Hedgehog基因。哺乳動物包含3個Hedgehog同源基因，即SonicHedgehog（Shh）、IndianHedgehog（Ihh）和DesertHedgeho（Dhh）[7-9]。Shh在哺乳動物中表達最為廣泛，尤其在早期脊椎動物胚胎形成過程中；Ihh與調節骨與軟骨的形成有關；Dhh主要與生殖細胞發育有關[10]。Hedgehog蛋白的分泌經歷了一系列過程，首先信號序列被分解，Hedgehog多肽的C端結構域催化分子內膽固醇轉移反應，導致C端膽固醇修飾的N端Hedgehog信號域（HhN）形成，膽固醇的修飾導致Hedgehog與細胞膜結合，并通過跨膜酰基轉移酶Skinny（Ski）將棕櫚酰基團結合到HhN的N端，生成了具有活性的雙重脂質修飾的HhN。Hedgehog通過Dispathched（Disp）從分泌細胞釋放，并且輔助受體iHOG和Boi（脊椎動物為CDO和BOC）增加結合Hedgehog信號受體Ptc的親和力。Ptc是一種12次跨膜的糖蛋白受體，包含2個同源基因Ptc1和Ptc2；Smoothened（Smo）是一種7次跨膜蛋白，功能類似于信號傳感器；脊椎動物包含3種Gli蛋白，即Gli1、Gli2和Gli3，是具有鋅指結構的轉錄因子。Hedgehog通過Ptc和Smo進行調節，當Hedgehog缺乏時，Ptc抑制Smo的活性，Hedgehog與Ptc結合導致Ptc活性喪失，隨之解除Ptc對Smo的抑制并激活Hedgehog信號通路，使Hedgehog信號轉導至細胞內，最終導致轉錄因子Glis蛋白家族的激活[11-12]。
2 Hedgehog信號通路調控骨形成的體內研究
2.1 直接干預Hedgehog信號通路活性對骨形成的影響
研究表明Ihh蛋白及下游關鍵分子參與調控骨折愈合過程，Carbone等[13]通過對大鼠行屈肌肌腱移植術制備前交叉韌帶重建模型后，給予移植物0?N或10?N的預張力干預，結果發現Ihh蛋白及下游Gli、Ptch1蛋白表達水平增加，提示Ihh信號通路在腱-骨愈合過程中起重要作用。同時，應用Hedgehog信號通路阻斷劑Cyclopamine可使骨形成受損。Felber等[14]用Cyclopamine處理斑馬魚的幼體，結果導致其頭部骨骼缺失，成骨標記物Runx2a、Runx2b、OSX表達明顯降低，表明Hedgehog信號通路參與脊椎動物的骨骼形成。以上研究表明，Ihh蛋白及下游關鍵分子在骨愈合過程中起關鍵作用。
此外，通過轉基因小鼠進一步研究證實，改變Hedgehog信號通路的受體或下游關鍵信號分子的基因型，會影響骨骼生長和修復的進程。Baht等[15]通過研究小鼠脛骨骨折模型發現，在野生型小鼠骨折修復后7、14、21 d，Hedgehog靶基因Gli1和Ptc1表達水平逐漸增加，制備Smo基因過表達或敲除Smo基因的Esr1-Cre; SmoStab及Esr1-Cre; SmoNull小鼠模型，發現Smo過表達可促進小鼠骨折修復。Wang等[16]的研究也得出類似結論，表明Hedgehog信號的激活在骨折愈合修復過程中具有調節骨折愈合的作用。Kitaura等[17]通過研究Gli1+/-成年小鼠發現，Gli1單倍體不足可通過減少骨形成和加速骨吸收導致骨量降低，骨組織形態學分析顯示成骨能力參數降低；通過與野生型小鼠比較，發現Gli1+/-小鼠表現出骨折愈合障礙，Gli1單倍體不足導致骨代謝的解耦聯及成骨分化受損，表明Gli作為Hedgehog信號通路的下游有助于維持正常骨代謝。
以上研究表明，Hedgehog信號通路是骨骼生長發育的重要調控信號通路之一，其受體和關鍵分子的激活或過表達可以促進骨形成，而阻斷該通路或制備單倍體不足模型可導致骨形成能力下降。
2.2 Hedgehog信號通路與其他信號關鍵分子交互作用調控骨形成
骨形成過程受多個信號通路及關鍵基因的調控，隨著Hedgehog信號通路對骨形成調控研究的逐漸深入，諸多學者對其與其他信號通路和分子的交互影響在骨形成過程中的作用進行了初步探討。Shi等[18]對Gli-CreERT2;Igf1rf/f小鼠胚胎模型（CKO)研究發現，敲除IGF-1受體（IGF-1 recepetor，Igf1r）可使Igf1r表達水平較野生型小鼠明顯下降，骨化抑制及礦化能力降低，成骨標志物Runx2、Sp7等及Hedgehog靶基因Ptch1、Gli2明顯減少，CKO模型組小鼠所有長骨骨領較正常對照組明顯縮短并持續缺損，表明Igf1r的缺失可減少小鼠胚胎骨的生成，Hedgehog信號具有成骨作用，同時揭示了IGF信號也參與了骨形成。Laurie等[19]對過表達堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子Hand1的轉基因小鼠研究發現，Hand1的過表達可導致小鼠產前發育不全和骨干再生障礙性骨化，以及股骨骨骺Ihh及Runx2的表達降低，另外前期研究[20]發現Runx2可直接結合并激活Ihh啟動子，Hand1與Hand2可直接結合Runx2并抑制Runx2的轉錄，表明Hand1過表達可通過調控Ihh的生成參與骨領的成骨過程，還可通過抑制Runx2對Ihh的激活抑制軟骨內骨化過程，證明Ihh參與調控軟骨內骨的形成。Amano等[21]及Kim等[22]的研究通過敲除小鼠的Ihh及PTH1R基因或用Hedgehog蛋白的單克隆抗體5E1，造成Ihh蛋白活性降低，Hedgehog信號下游基因Glis等表達下降，結果發現小鼠胚胎發育過程中骨形態結構形成異常，表明Hedgehog信號與PTH1R信號對維持骨形態結構的正常生長十分必要[21-22]。Tian等[23]通過敲除核結合因子β（core binding factor β，Cbfβ）發現，Cbfβ缺陷小鼠表現出成骨細胞標志物表達減少，骨小梁形成受損，骨骼畸形及骨化延遲；研究還發現Runx/Cbfβ復合物可直接與Ihh基因啟動子結合調控Ihh基因的表達，表明Cbfβ可通過上調Ihh表達調控骨與軟骨的形成。
以上研究通過敲除部分與骨形成相關的調控基因或信號分子進一步證實，Hedgehog信號不僅可通過下游關鍵分子調控骨形成，還可通過與其他信號及關鍵分子的交互影響，共同調控骨的形成。
3 Hedgehog信號通路調控BMSCs成骨分化的體外研究
3.1 Hedgehog信號分子調控BMSCs的增殖及成骨分化
BMSCs的增殖及成骨分化能力直接關系到骨形成活性。Cai等[24]用rShh-N干預大鼠BMSCs，發現細胞增殖及集落形成能力的增強與rShh-N呈劑量依賴關系，并且rShh-N能增加細胞在S期和G2/ M期的比例，增強ALP活性及基質礦化能力，增加成骨相關基因表達，表明Shh可增強BMSCs的增殖與成骨分化。韓磊等[25]對大鼠顱骨來源的前成骨細胞培養21?d，發現Shh與Ihh均有表達，用Shh?N端肽處理細胞可促進ALP活性及骨基質鈣化的增加，并導致Ptc與Smo基因表達水平增加，應用Hedgehog信號通路阻斷劑Cyclopamine可阻斷成骨細胞的增殖與分化；Plaisant等[26]研究也得出類似結論，用Ihh信號阻斷劑Cyclopamine或用阻斷Gli2的siRNA阻礙細胞周期G0/G1可導致人BMSCs增殖減緩。張雪萍等[27]用地塞米松誘導大鼠BMSCs成骨分化也得出類似結論。James等[28]研究發現Shh和Nell-1蛋白具有抗脂肪細胞的特點，Shh-N和Nell-1可對人脂肪來源干細胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）產生成骨和抗成脂分化的附加效應，應用Smo的拮抗劑Cyclopamine可逆轉Nell-1的成骨效應，表明Hedgehog協同Nell-1信號可加強hADSCs的成骨分化并抑制成脂分化。以上研究表明Shh/Ihh信號直接參與了成骨細胞增殖和分化的調節。
3.2 外源性刺激Hedgehog信號或改變基因型調控BMSCs成骨分化
Montgomery等[29]用氧化甾醇衍生物Oxy133誘導小鼠C3H10T1/2及M2-10B4細胞ALP活性及增加成骨標志物OSX、骨鈣素、ALP表達，應用Hedgehog信號通路阻斷劑Cyclopamine后這種作用可完全阻斷。Yalom等[30]用類似方法研究表明Hedgehog信號參與了細胞的成骨分化。Baht等[15]用成骨誘導培養基培養小鼠BMSCs向成骨細胞分化，Gli1及Ptch1轉錄水平較未分化的細胞增加，從Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ，ColⅠ）-Cre; SmoStab基因型小鼠分離的BMSCs，其ALP活性增強，ColⅠ及ALP表達水平增加，而從ColⅠ-Cre; SmoNull基因型小鼠分離的BMSCs以上指標則明顯降低，表明Hedgehog信號通路的激活可增強成骨分化過程。Kitaura等[17]研究發現Gli1+/-基因型小鼠BMSCs的ALP及整合素結合唾液酸蛋白表達下降，ALP活性及基質鈣化能力降低，用表達Gli1的腺病毒轉染C3H10T1/2細胞及Gli1+/-成骨細胞前體細胞（osteoblasts precursor cells，OPCs），結果顯示Gli1表達增加同時成骨細胞標志物ALP及骨鈣素表達增加，表明Hedgehog信號通路通過下游信號Gli1調控成骨分化。
以上研究表明, 給予外源性刺激使Hedgehog信號激活或改變基因型增強Hedgehog信號下游關鍵基因后，可增強成骨標志物的表達，促進BMSCs的成骨分化。
3.3 Hedgehog信號通路與其他信號及關鍵分子協同調控BMSCs成骨分化
Reichert等[31]用腺病毒轉染BMP-2與Ihh使其在人BMSCs過表達，結果顯示骨橋蛋白（osteopon tin，OPN）、骨鈣素表達水平及基質礦化能力增加，表明Ihh與BMP-2協同作用誘導BMSCs成骨分化。Oliveira等[32]應用Hedgehog信號通路激動劑Purmorphamine（PM）處理人BMSCs，發現Smo、Ptch1、Gli1及Gli2基因表達增加，同時Runx2和BMPs等成骨分化相關基因相應增加，表明Hedgehog信號通路激活能促進細胞的成骨分化。Lin等[33]通過研究Scube2的功能證明Scube2調節Ihh激活引起的小鼠BMSCs成骨分化，表明Scube2是調節Ihh信號的關鍵分子。Li等[34]通過研究發現，Hedgehog信號可調控BMP-9誘導小鼠MSCs及C3H10T1/2細胞的成骨分化，給予Hedgehog信號激動劑PM可使ALP活性、OPN、骨鈣素和基質礦化增強，Smad1/5/8轉錄活性與關鍵成骨因子表達增加，給予Hedgheog信號通路阻斷劑則抑制BMP-9誘導的MSCs早期成骨分化。Shi等[18]用PM處理小鼠M2-10B4細胞，發現PM可誘導Gli1和Ptch1基因表達增加，成骨標志物Sp7及ALP等表達增加，敲除mTORC2特有組成成分Rictor或應用MK2206阻斷mTORC2靶點Akt后，PM誘導的成骨作用消除，成骨標志物表達下降，同時Hedgehog顯著增加IGF-2表達并通過激活IGF-2-mTORC2-Akt信號，誘導成骨分化。IGF-2還可通過mTORC2-Akt信號抑制Gli2的流失，因此增強Hedgehog信號激活后的轉錄輸出可引起成骨過程的激活。Nakamura等[35]用C3H10T1/2細胞和取自Runx2缺陷小鼠的MSCs RD-127細胞，應用Hedgehog信號通路激動劑Hh-Ags激活Hedgehog信號通路，研究發現Hh-Ags可協同低劑量BMP-2激活經典Wnt信號通路，并通過上調Runx2下游基因OSX/Sp7恢復Runx2缺陷的RD-127細胞的成骨分化，表明Hedgehog不僅調控干細胞的成骨分化，并在誘導MSCs成骨分化過程中與Wnt信號通路存在交聯。以上研究表明Hedgehog信號通路可與其他信號和關鍵分子互相影響，參與成骨分化的調控。
3.4 鞭毛內運輸蛋白80（intraflagellar transport proteins 80，IFT80）通過調控Hedgehog信號影響成骨分化
IFT80是一種可組裝并維護定位于成骨細胞及骨細胞表面初級纖毛的一種蛋白質，是Hedgehog信號通路及骨形成過程中必不可少的組成部分。Yang等[36]研究發現IFT80在小鼠長骨、顱骨及成骨分化過程中高表達，利用慢病毒介導的RNA干擾技術，使小鼠C3H10T1/2細胞和BMSCs IFT80基因沉默，IFT80基因沉默可明顯阻斷成骨細胞標記物的表達，抑制細胞ALP活性和礦化；進一步研究發現，IFT80基因沉默可阻斷Hedgehog信號通路關鍵轉錄因子Gli2的表達，過表達的Gli2可恢復IFT80基因沉默造成的成骨分化缺陷，并明顯促進成骨分化，且IFT80基因沉默可部分阻斷用Smo激動劑促進的成骨分化，表明IFT80通過調節Hedgehog/Gli信號通路在成骨細胞分化過程中起關鍵作用。Yuan等[37]通過分離敲除IFT80基因的IFT80f/f小鼠OPCs，發現成骨細胞的分化及成熟受損，IFT80基因的缺失通過改變Smo纖毛定位干擾了經典Hedgehog/Gli信號的激活，并過度激活非經典Hh-Gαi-RhoA-ROCK通路增加Gαi與Smo的結合，阻斷RhoA或ROCK可促進纖毛的形成。同時，應用肌動蛋白去穩定劑細胞松弛素D可明顯恢復IFT80缺陷的OPCs的成骨細胞分化。這些結果表明，IFT80在成骨細胞分化過程中通過激活經典Hh-Smo-Ptch1-Gli信號通路，抑制非經典Hh-Smo-Gαi-RhoA應力纖維信號，調節成骨細胞的分化。
3.5 不同細胞來源及觀測節點Hedgehog信號介導的成骨分化作用不同
然而，體外研究對于Hedgehog信號通路調控成骨的作用未得出一致結論。Jiang等[38]用重組人Shh-N蛋白處理牙根尖乳頭來源干細胞（stem cells from apical papilla，SCAPs）、牙周膜干細胞（stem cells from periodontal ligamen，PDLSCs）及過表達Smo的SCAPs使Shh信號激活，研究發現Gli1表達增加可導致SCAPs及PDLSCs的ALP活性及礦化能力明顯降低，應用重組人BMP-4蛋白處理SCAPs，發現BMP-4、BMP-2表達增加，Smo及Gli1表達降低，表明Shh信號激活引起Gli1表達的增加抑制牙組織來源細胞的成骨分化，并負性調節BMP信號引起的成骨分化作用。Plaisant等[39]用PM處理人BMSCs，檢測成骨能力發現ALP活性及基因表達均降低，OPN、骨保護素及骨粘連蛋白表達明顯下降，表明Hedgehog信號的激活可使人BMSCs成骨分化受損。上述研究結論的不一致可能與細胞來源、觀測節點的差異有關，具體原因有待進一步研究。
4 Hedgehog信號通路調控BMSCs的成骨分化及骨形成的離體研究
Wang等[16]用表達ShhN的腺病毒轉染綠色熒光蛋白轉基因小鼠骨膜愈合組織分離的骨膜骨痂來源MSCs，植入免疫缺陷裸鼠行組織學檢測，結果顯示過表達ShhN可明顯誘導骨形成并呈劑量依賴性；用敲除Smo基因的Smof/f基因型小鼠和他西莫芬誘導的RosaCreER小鼠模型Smof/f; CreER模型小鼠行自體骨膜移植，結果顯示Smo基因缺失后導致總骨痂形成總量明顯降低，表明Hedgehog信號參與愈合早期骨膜介導的修復和再生，并且對增強骨的形成和修復再生起重要作用。Jiang等[38]將過表達Smo的SCAPs皮下植入裸鼠，過表達Smo可抑制組織礦化，組織化學染色顯示移植物礦化組織減少，表明Smo的激活使SCAPs成骨分化及牙本質生成受抑制。Lin等[33]取Scube2-/-和Scube2+/+基因型小鼠的BMSCs研究發現，Scube2基因缺失后成骨能力及成骨標志物明顯降低，同時應用Ihh信號阻斷劑可降低Gli1及Ptch1的表達，使成骨分化過程受損，表明Ihh信號參與Scube2介導的成骨分化過程。Huang等[40]通過行小鼠同種異體骨膜源性MSCs的移植，應用腺病毒載體過表達ShhN端肽（Ad-ShhN）激活Hedgehog信號通路，可恢復免疫缺陷小鼠的骨移植模型骨領形成，發現Ad-ShhN增強了膠原支架內供體細胞的存活和微血管的形成，并促進供體細胞依賴的骨形成，表明ShhN可激活Hedgehog信號并通過增強受損骨膜的供祖細胞存活、分化和血運重建，改善骨缺損的重建和骨形成。
以上研究表明，通過骨缺損模型向缺損部位移植不同來源或基因型的MSCs，激活Hedgehog信號可使細胞成骨分化及骨形成和愈合能力增強，但對不同組織來源的干細胞，Hedgehog信號可對細胞的成骨分化與骨形成產生不同影響。
5 結論與展望
Hedgehog信號通路可通過激活自身通路的下游關鍵分子Glis調控骨的形成與修復，并可激活多條與成骨分化相關的通路，如Wnt、BMP/Smads等信號通路并與之產生交聯協同調控BMSCs的成骨分化。同時，Hedgehog信號通路還可通過調控關鍵分子Runx2、PTHrP、IGF-2及Hedgehog通路特殊結構纖毛及IFT80等，調控BMSCs的成骨分化。目前研究表明，某些可控Hedgehog信號通路的藥物可能用于一些骨相關疾病的治療，如OP、骨折愈合障礙等疾病，為以后骨相關疾病的治療及進一步研究提供了新思路，但對不同組織來源的干細胞，Hedgehog信號誘導的骨形成及成骨分化作用有待進一步研究。
骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量低下、骨微結構損壞導致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身骨病[1-2]。BMSCs的減少及成骨細胞和脂肪細胞的分化失平衡最終導致骨形成減少，是老年OP的病因基礎之一[3-4]。BMSCs的成骨分化是影響骨形成乃至骨量的主要因素之一，這一過程受到多個信號通路及細胞因子的調控，如Wnt、BMP/Smads、Hedgehog及Notch信號通路。Hedgehog信號通路是一條保守且重要的信號通路，參與多種類型細胞的分化、增殖，并在諸多組織和器官的發育中起著關鍵作用[5]；另外，調控Hedgehog信號通路的一些藥物可用于治療Hedgehog信號擾亂引起的相關疾病[6]。近年研究顯示，Hedgehog信號通路可誘導BMSCs分化為成骨細胞，同時抑制其向脂肪細胞分化[5]，并可促進骨形成，這一過程伴有與其他相關因子和信號通路間的相互調節和影響。但因細胞來源和分化階段的不同，不同研究中Hedgehog信號通路對BMSCs成骨分化過程中特異性成骨分化標志物表達的作用不一致。現綜合目前國內外相關研究，就Hedgehog信號通路對骨形成及BMSCs成骨分化的調控及其分子機制的研究成果作一綜述，為相關研究提供理論依據和參考。
1 Hedgehog信號通路的組成及Hedgehog信號細胞內的調控機制
Hedgehog信號通路在胚胎發育和組織穩態及調控細胞的生長過程中起著重要作用。1980年有研究通過基因篩選首次在果蠅中發現Hedgehog基因。哺乳動物包含3個Hedgehog同源基因，即SonicHedgehog（Shh）、IndianHedgehog（Ihh）和DesertHedgeho（Dhh）[7-9]。Shh在哺乳動物中表達最為廣泛，尤其在早期脊椎動物胚胎形成過程中；Ihh與調節骨與軟骨的形成有關；Dhh主要與生殖細胞發育有關[10]。Hedgehog蛋白的分泌經歷了一系列過程，首先信號序列被分解，Hedgehog多肽的C端結構域催化分子內膽固醇轉移反應，導致C端膽固醇修飾的N端Hedgehog信號域（HhN）形成，膽固醇的修飾導致Hedgehog與細胞膜結合，并通過跨膜酰基轉移酶Skinny（Ski）將棕櫚酰基團結合到HhN的N端，生成了具有活性的雙重脂質修飾的HhN。Hedgehog通過Dispathched（Disp）從分泌細胞釋放，并且輔助受體iHOG和Boi（脊椎動物為CDO和BOC）增加結合Hedgehog信號受體Ptc的親和力。Ptc是一種12次跨膜的糖蛋白受體，包含2個同源基因Ptc1和Ptc2；Smoothened（Smo）是一種7次跨膜蛋白，功能類似于信號傳感器；脊椎動物包含3種Gli蛋白，即Gli1、Gli2和Gli3，是具有鋅指結構的轉錄因子。Hedgehog通過Ptc和Smo進行調節，當Hedgehog缺乏時，Ptc抑制Smo的活性，Hedgehog與Ptc結合導致Ptc活性喪失，隨之解除Ptc對Smo的抑制并激活Hedgehog信號通路，使Hedgehog信號轉導至細胞內，最終導致轉錄因子Glis蛋白家族的激活[11-12]。
2 Hedgehog信號通路調控骨形成的體內研究
2.1 直接干預Hedgehog信號通路活性對骨形成的影響
研究表明Ihh蛋白及下游關鍵分子參與調控骨折愈合過程，Carbone等[13]通過對大鼠行屈肌肌腱移植術制備前交叉韌帶重建模型后，給予移植物0?N或10?N的預張力干預，結果發現Ihh蛋白及下游Gli、Ptch1蛋白表達水平增加，提示Ihh信號通路在腱-骨愈合過程中起重要作用。同時，應用Hedgehog信號通路阻斷劑Cyclopamine可使骨形成受損。Felber等[14]用Cyclopamine處理斑馬魚的幼體，結果導致其頭部骨骼缺失，成骨標記物Runx2a、Runx2b、OSX表達明顯降低，表明Hedgehog信號通路參與脊椎動物的骨骼形成。以上研究表明，Ihh蛋白及下游關鍵分子在骨愈合過程中起關鍵作用。
此外，通過轉基因小鼠進一步研究證實，改變Hedgehog信號通路的受體或下游關鍵信號分子的基因型，會影響骨骼生長和修復的進程。Baht等[15]通過研究小鼠脛骨骨折模型發現，在野生型小鼠骨折修復后7、14、21 d，Hedgehog靶基因Gli1和Ptc1表達水平逐漸增加，制備Smo基因過表達或敲除Smo基因的Esr1-Cre; SmoStab及Esr1-Cre; SmoNull小鼠模型，發現Smo過表達可促進小鼠骨折修復。Wang等[16]的研究也得出類似結論，表明Hedgehog信號的激活在骨折愈合修復過程中具有調節骨折愈合的作用。Kitaura等[17]通過研究Gli1+/-成年小鼠發現，Gli1單倍體不足可通過減少骨形成和加速骨吸收導致骨量降低，骨組織形態學分析顯示成骨能力參數降低；通過與野生型小鼠比較，發現Gli1+/-小鼠表現出骨折愈合障礙，Gli1單倍體不足導致骨代謝的解耦聯及成骨分化受損，表明Gli作為Hedgehog信號通路的下游有助于維持正常骨代謝。
以上研究表明，Hedgehog信號通路是骨骼生長發育的重要調控信號通路之一，其受體和關鍵分子的激活或過表達可以促進骨形成，而阻斷該通路或制備單倍體不足模型可導致骨形成能力下降。
2.2 Hedgehog信號通路與其他信號關鍵分子交互作用調控骨形成
骨形成過程受多個信號通路及關鍵基因的調控，隨著Hedgehog信號通路對骨形成調控研究的逐漸深入，諸多學者對其與其他信號通路和分子的交互影響在骨形成過程中的作用進行了初步探討。Shi等[18]對Gli-CreERT2;Igf1rf/f小鼠胚胎模型（CKO)研究發現，敲除IGF-1受體（IGF-1 recepetor，Igf1r）可使Igf1r表達水平較野生型小鼠明顯下降，骨化抑制及礦化能力降低，成骨標志物Runx2、Sp7等及Hedgehog靶基因Ptch1、Gli2明顯減少，CKO模型組小鼠所有長骨骨領較正常對照組明顯縮短并持續缺損，表明Igf1r的缺失可減少小鼠胚胎骨的生成，Hedgehog信號具有成骨作用，同時揭示了IGF信號也參與了骨形成。Laurie等[19]對過表達堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子Hand1的轉基因小鼠研究發現，Hand1的過表達可導致小鼠產前發育不全和骨干再生障礙性骨化，以及股骨骨骺Ihh及Runx2的表達降低，另外前期研究[20]發現Runx2可直接結合并激活Ihh啟動子，Hand1與Hand2可直接結合Runx2并抑制Runx2的轉錄，表明Hand1過表達可通過調控Ihh的生成參與骨領的成骨過程，還可通過抑制Runx2對Ihh的激活抑制軟骨內骨化過程，證明Ihh參與調控軟骨內骨的形成。Amano等[21]及Kim等[22]的研究通過敲除小鼠的Ihh及PTH1R基因或用Hedgehog蛋白的單克隆抗體5E1，造成Ihh蛋白活性降低，Hedgehog信號下游基因Glis等表達下降，結果發現小鼠胚胎發育過程中骨形態結構形成異常，表明Hedgehog信號與PTH1R信號對維持骨形態結構的正常生長十分必要[21-22]。Tian等[23]通過敲除核結合因子β（core binding factor β，Cbfβ）發現，Cbfβ缺陷小鼠表現出成骨細胞標志物表達減少，骨小梁形成受損，骨骼畸形及骨化延遲；研究還發現Runx/Cbfβ復合物可直接與Ihh基因啟動子結合調控Ihh基因的表達，表明Cbfβ可通過上調Ihh表達調控骨與軟骨的形成。
以上研究通過敲除部分與骨形成相關的調控基因或信號分子進一步證實，Hedgehog信號不僅可通過下游關鍵分子調控骨形成，還可通過與其他信號及關鍵分子的交互影響，共同調控骨的形成。
3 Hedgehog信號通路調控BMSCs成骨分化的體外研究
3.1 Hedgehog信號分子調控BMSCs的增殖及成骨分化
BMSCs的增殖及成骨分化能力直接關系到骨形成活性。Cai等[24]用rShh-N干預大鼠BMSCs，發現細胞增殖及集落形成能力的增強與rShh-N呈劑量依賴關系，并且rShh-N能增加細胞在S期和G2/ M期的比例，增強ALP活性及基質礦化能力，增加成骨相關基因表達，表明Shh可增強BMSCs的增殖與成骨分化。韓磊等[25]對大鼠顱骨來源的前成骨細胞培養21?d，發現Shh與Ihh均有表達，用Shh?N端肽處理細胞可促進ALP活性及骨基質鈣化的增加，并導致Ptc與Smo基因表達水平增加，應用Hedgehog信號通路阻斷劑Cyclopamine可阻斷成骨細胞的增殖與分化；Plaisant等[26]研究也得出類似結論，用Ihh信號阻斷劑Cyclopamine或用阻斷Gli2的siRNA阻礙細胞周期G0/G1可導致人BMSCs增殖減緩。張雪萍等[27]用地塞米松誘導大鼠BMSCs成骨分化也得出類似結論。James等[28]研究發現Shh和Nell-1蛋白具有抗脂肪細胞的特點，Shh-N和Nell-1可對人脂肪來源干細胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）產生成骨和抗成脂分化的附加效應，應用Smo的拮抗劑Cyclopamine可逆轉Nell-1的成骨效應，表明Hedgehog協同Nell-1信號可加強hADSCs的成骨分化并抑制成脂分化。以上研究表明Shh/Ihh信號直接參與了成骨細胞增殖和分化的調節。
3.2 外源性刺激Hedgehog信號或改變基因型調控BMSCs成骨分化
Montgomery等[29]用氧化甾醇衍生物Oxy133誘導小鼠C3H10T1/2及M2-10B4細胞ALP活性及增加成骨標志物OSX、骨鈣素、ALP表達，應用Hedgehog信號通路阻斷劑Cyclopamine后這種作用可完全阻斷。Yalom等[30]用類似方法研究表明Hedgehog信號參與了細胞的成骨分化。Baht等[15]用成骨誘導培養基培養小鼠BMSCs向成骨細胞分化，Gli1及Ptch1轉錄水平較未分化的細胞增加，從Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ，ColⅠ）-Cre; SmoStab基因型小鼠分離的BMSCs，其ALP活性增強，ColⅠ及ALP表達水平增加，而從ColⅠ-Cre; SmoNull基因型小鼠分離的BMSCs以上指標則明顯降低，表明Hedgehog信號通路的激活可增強成骨分化過程。Kitaura等[17]研究發現Gli1+/-基因型小鼠BMSCs的ALP及整合素結合唾液酸蛋白表達下降，ALP活性及基質鈣化能力降低，用表達Gli1的腺病毒轉染C3H10T1/2細胞及Gli1+/-成骨細胞前體細胞（osteoblasts precursor cells，OPCs），結果顯示Gli1表達增加同時成骨細胞標志物ALP及骨鈣素表達增加，表明Hedgehog信號通路通過下游信號Gli1調控成骨分化。
以上研究表明, 給予外源性刺激使Hedgehog信號激活或改變基因型增強Hedgehog信號下游關鍵基因后，可增強成骨標志物的表達，促進BMSCs的成骨分化。
3.3 Hedgehog信號通路與其他信號及關鍵分子協同調控BMSCs成骨分化
Reichert等[31]用腺病毒轉染BMP-2與Ihh使其在人BMSCs過表達，結果顯示骨橋蛋白（osteopon tin，OPN）、骨鈣素表達水平及基質礦化能力增加，表明Ihh與BMP-2協同作用誘導BMSCs成骨分化。Oliveira等[32]應用Hedgehog信號通路激動劑Purmorphamine（PM）處理人BMSCs，發現Smo、Ptch1、Gli1及Gli2基因表達增加，同時Runx2和BMPs等成骨分化相關基因相應增加，表明Hedgehog信號通路激活能促進細胞的成骨分化。Lin等[33]通過研究Scube2的功能證明Scube2調節Ihh激活引起的小鼠BMSCs成骨分化，表明Scube2是調節Ihh信號的關鍵分子。Li等[34]通過研究發現，Hedgehog信號可調控BMP-9誘導小鼠MSCs及C3H10T1/2細胞的成骨分化，給予Hedgehog信號激動劑PM可使ALP活性、OPN、骨鈣素和基質礦化增強，Smad1/5/8轉錄活性與關鍵成骨因子表達增加，給予Hedgheog信號通路阻斷劑則抑制BMP-9誘導的MSCs早期成骨分化。Shi等[18]用PM處理小鼠M2-10B4細胞，發現PM可誘導Gli1和Ptch1基因表達增加，成骨標志物Sp7及ALP等表達增加，敲除mTORC2特有組成成分Rictor或應用MK2206阻斷mTORC2靶點Akt后，PM誘導的成骨作用消除，成骨標志物表達下降，同時Hedgehog顯著增加IGF-2表達并通過激活IGF-2-mTORC2-Akt信號，誘導成骨分化。IGF-2還可通過mTORC2-Akt信號抑制Gli2的流失，因此增強Hedgehog信號激活后的轉錄輸出可引起成骨過程的激活。Nakamura等[35]用C3H10T1/2細胞和取自Runx2缺陷小鼠的MSCs RD-127細胞，應用Hedgehog信號通路激動劑Hh-Ags激活Hedgehog信號通路，研究發現Hh-Ags可協同低劑量BMP-2激活經典Wnt信號通路，并通過上調Runx2下游基因OSX/Sp7恢復Runx2缺陷的RD-127細胞的成骨分化，表明Hedgehog不僅調控干細胞的成骨分化，并在誘導MSCs成骨分化過程中與Wnt信號通路存在交聯。以上研究表明Hedgehog信號通路可與其他信號和關鍵分子互相影響，參與成骨分化的調控。
3.4 鞭毛內運輸蛋白80（intraflagellar transport proteins 80，IFT80）通過調控Hedgehog信號影響成骨分化
IFT80是一種可組裝并維護定位于成骨細胞及骨細胞表面初級纖毛的一種蛋白質，是Hedgehog信號通路及骨形成過程中必不可少的組成部分。Yang等[36]研究發現IFT80在小鼠長骨、顱骨及成骨分化過程中高表達，利用慢病毒介導的RNA干擾技術，使小鼠C3H10T1/2細胞和BMSCs IFT80基因沉默，IFT80基因沉默可明顯阻斷成骨細胞標記物的表達，抑制細胞ALP活性和礦化；進一步研究發現，IFT80基因沉默可阻斷Hedgehog信號通路關鍵轉錄因子Gli2的表達，過表達的Gli2可恢復IFT80基因沉默造成的成骨分化缺陷，并明顯促進成骨分化，且IFT80基因沉默可部分阻斷用Smo激動劑促進的成骨分化，表明IFT80通過調節Hedgehog/Gli信號通路在成骨細胞分化過程中起關鍵作用。Yuan等[37]通過分離敲除IFT80基因的IFT80f/f小鼠OPCs，發現成骨細胞的分化及成熟受損，IFT80基因的缺失通過改變Smo纖毛定位干擾了經典Hedgehog/Gli信號的激活，并過度激活非經典Hh-Gαi-RhoA-ROCK通路增加Gαi與Smo的結合，阻斷RhoA或ROCK可促進纖毛的形成。同時，應用肌動蛋白去穩定劑細胞松弛素D可明顯恢復IFT80缺陷的OPCs的成骨細胞分化。這些結果表明，IFT80在成骨細胞分化過程中通過激活經典Hh-Smo-Ptch1-Gli信號通路，抑制非經典Hh-Smo-Gαi-RhoA應力纖維信號，調節成骨細胞的分化。
3.5 不同細胞來源及觀測節點Hedgehog信號介導的成骨分化作用不同
然而，體外研究對于Hedgehog信號通路調控成骨的作用未得出一致結論。Jiang等[38]用重組人Shh-N蛋白處理牙根尖乳頭來源干細胞（stem cells from apical papilla，SCAPs）、牙周膜干細胞（stem cells from periodontal ligamen，PDLSCs）及過表達Smo的SCAPs使Shh信號激活，研究發現Gli1表達增加可導致SCAPs及PDLSCs的ALP活性及礦化能力明顯降低，應用重組人BMP-4蛋白處理SCAPs，發現BMP-4、BMP-2表達增加，Smo及Gli1表達降低，表明Shh信號激活引起Gli1表達的增加抑制牙組織來源細胞的成骨分化，并負性調節BMP信號引起的成骨分化作用。Plaisant等[39]用PM處理人BMSCs，檢測成骨能力發現ALP活性及基因表達均降低，OPN、骨保護素及骨粘連蛋白表達明顯下降，表明Hedgehog信號的激活可使人BMSCs成骨分化受損。上述研究結論的不一致可能與細胞來源、觀測節點的差異有關，具體原因有待進一步研究。
4 Hedgehog信號通路調控BMSCs的成骨分化及骨形成的離體研究
Wang等[16]用表達ShhN的腺病毒轉染綠色熒光蛋白轉基因小鼠骨膜愈合組織分離的骨膜骨痂來源MSCs，植入免疫缺陷裸鼠行組織學檢測，結果顯示過表達ShhN可明顯誘導骨形成并呈劑量依賴性；用敲除Smo基因的Smof/f基因型小鼠和他西莫芬誘導的RosaCreER小鼠模型Smof/f; CreER模型小鼠行自體骨膜移植，結果顯示Smo基因缺失后導致總骨痂形成總量明顯降低，表明Hedgehog信號參與愈合早期骨膜介導的修復和再生，并且對增強骨的形成和修復再生起重要作用。Jiang等[38]將過表達Smo的SCAPs皮下植入裸鼠，過表達Smo可抑制組織礦化，組織化學染色顯示移植物礦化組織減少，表明Smo的激活使SCAPs成骨分化及牙本質生成受抑制。Lin等[33]取Scube2-/-和Scube2+/+基因型小鼠的BMSCs研究發現，Scube2基因缺失后成骨能力及成骨標志物明顯降低，同時應用Ihh信號阻斷劑可降低Gli1及Ptch1的表達，使成骨分化過程受損，表明Ihh信號參與Scube2介導的成骨分化過程。Huang等[40]通過行小鼠同種異體骨膜源性MSCs的移植，應用腺病毒載體過表達ShhN端肽（Ad-ShhN）激活Hedgehog信號通路，可恢復免疫缺陷小鼠的骨移植模型骨領形成，發現Ad-ShhN增強了膠原支架內供體細胞的存活和微血管的形成，并促進供體細胞依賴的骨形成，表明ShhN可激活Hedgehog信號并通過增強受損骨膜的供祖細胞存活、分化和血運重建，改善骨缺損的重建和骨形成。
以上研究表明，通過骨缺損模型向缺損部位移植不同來源或基因型的MSCs，激活Hedgehog信號可使細胞成骨分化及骨形成和愈合能力增強，但對不同組織來源的干細胞，Hedgehog信號可對細胞的成骨分化與骨形成產生不同影響。
5 結論與展望
Hedgehog信號通路可通過激活自身通路的下游關鍵分子Glis調控骨的形成與修復，并可激活多條與成骨分化相關的通路，如Wnt、BMP/Smads等信號通路并與之產生交聯協同調控BMSCs的成骨分化。同時，Hedgehog信號通路還可通過調控關鍵分子Runx2、PTHrP、IGF-2及Hedgehog通路特殊結構纖毛及IFT80等，調控BMSCs的成骨分化。目前研究表明，某些可控Hedgehog信號通路的藥物可能用于一些骨相關疾病的治療，如OP、骨折愈合障礙等疾病，為以后骨相關疾病的治療及進一步研究提供了新思路，但對不同組織來源的干細胞，Hedgehog信號誘導的骨形成及成骨分化作用有待進一步研究。