引用本文： 丁強, 孫楠, 王孝輝. 淫羊藿苷對誘導膜內TGF-β1及bFGF表達水平的影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(11): 1405-1409. doi: 10.7507/1002-1892.201905060 復制
臨床上各種原因造成的大段骨缺損一直是骨科治療難題。淫羊藿是中醫骨傷科常用藥物，為補命門、益精氣、強筋骨、補腎壯陽之要藥。藥理實驗表明，淫羊藿能增加心腦血管血流量，促進造血功能、免疫功能及骨代謝，具有抗衰老、抗腫瘤等功效；臨床常用于治療腎虛腰痛、筋骨折傷等疾病[1-2]。其有效成分淫羊藿苷對新骨形成及骨修復具有顯著促進作用[3-4]。自 2000 年 Masquelet 報道采用一期抗生素骨水泥填充、二期植骨治療大段骨缺損獲得優良臨床效果以來，該方法逐漸受到臨床醫師的關注，但也存在治療時間長、骨質塑形慢等問題。在 Masquelet 技術一期和二期兩個階段中，骨修復再生的基礎是誘導膜形成，目前關于淫羊藿苷對誘導膜形成期的影響鮮見報道。通過調節內源性細胞因子提高誘導膜微血管化程度，可以作為促進后期植骨血管化和骨再生的突破口。
本研究通過制備大鼠脛骨骨缺損模型，應用 Masquelet 技術治療后再進行淫羊藿藥物干預，觀察誘導膜內血管化及其相關生物活性因子 TGF-β1 和 bFGF 的變化，為淫羊藿苷在誘導膜技術修復骨缺損中的應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級 3 月齡健康 Wistar 雄性大鼠 60 只，體質量 180～200 g，由河南省實驗動物中心提供，全部大鼠均適應性飼養 1 周后開始實驗。實驗動物使用許可證號：SYXK（豫）2015-0001。
淫羊藿苷（成都曼斯特生物科技有限公司）；淫羊藿總黃酮注射液（深褐色液體，含 20 mg/mL 淫羊藿苷，總黃酮含量為 88%；北京世佳研究中心提供）；去甲萬古霉素抗生素骨水泥（Palacos 公司名，德國）；蘇木素-伊紅染色液（北京雷根生物技術有限公司）；大鼠 TGF-β1 和 bFGF 的 ELISA 試劑盒（上海通蔚科技有限公司）；組織脫水機、染色機（上海五相儀器儀表有限公司）；BX53 生物顯微鏡（Olympus 公司，日本）；超凈工作臺（浙江蘇凈凈化設備有限公司）。
1.2 實驗分組及方法
將 60 只大鼠按隨機數字表法分為 3 組，每組 20 只。所有大鼠腹腔注射戊巴比妥（5 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定于超凈工作臺上。于右后肢脛骨中段外側作一長約 2 cm 縱切口，逐層切開分離，顯露脛骨干骨質，分離周圍肌肉組織，用手外科電動擺鋸截取長約 6 mm 骨質，將 1.5 cm 克氏針由骨缺損遠近端插入脛骨髓腔。空白組（A 組）骨缺損處不作處理；對照組（B 組）和實驗組（C 組）將處于拉絲期的去甲萬古霉素抗生素骨水泥填充于骨缺損處，待骨水泥完全凝固，沖洗并縫合切口。術后各組大鼠均連續 3 d 腹腔注射青霉素鈉（8 萬 U/d）預防感染，常規飼料喂養。術后第 1 天開始，C 組每天淫羊藿總黃酮注射液稀釋液（10 μmol/L）灌胃 1 次（0.3 mL）[5]，A、B 組予以等量生理鹽水灌胃。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察實驗動物圍術期恢復及切口愈合情況；術后 4 周攝 X 線片觀察脛骨近端骨缺損恢復情況；術后 6 周所有動物腹腔注射戊巴比妥（5 mg/kg）麻醉后于原切口處切開，大體觀察骨缺損處肉芽組織及誘導膜組織形態變化及其血管化程度。
1.3.2 免疫組織化學染色觀察
術后 6 周大體觀察后，取各組大鼠骨缺損處組織進行連續切片，片厚 4～5 μm，常規脫蠟至水。用 0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）高壓熱修復抗原，PBS 沖洗 2 次，每次 5 min；30 mL/L H2O2 阻斷內源性過氧化物酶 10 min，PBS 沖洗 2 次，每次 5 min；滴加 TGF-β1、bFGF 一抗 4℃ 過夜，PBS 沖洗 2 次，每次 5 min；滴加二抗和三抗，PBS 各沖洗 2 次，每次 5 min；DAB 顯色 5～20 min，有滿意陽性結果時終止染色；蒸餾水沖洗 10 min，PBS 沖洗 2 次，每次 5 min；蘇木素復染 2 min，BX53 生物顯微鏡下觀察適時終止；梯度系列乙醇脫水、二甲苯透明各 5 min、樹脂封片，生物顯微鏡下觀察。
1.3.3 ELISA 法檢測血清 TGF-β1和 bFGF 表達
術后 6 周于動物腹腔取血靜置 30 min 以上，4℃ 以離心半徑 10 cm、2 500 r/min 離心 20 min，輕輕吸取上層血清，采用 ELISA 法檢測大鼠血清 TGF-β1、bFGF 水平。
1.4 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
3 組大鼠骨缺損模型均造模成功，術后無異常，切口均Ⅰ期愈合。術后 4 周 X 線片觀察示，A 組脛骨近端骨缺損處能觀察到明顯空隙；B、C 組脛骨近端骨缺損處骨水泥充填，克氏針固定良好。見圖 1。術后 6 周大體觀察示，A 組可見缺損區被肉芽組織充填；B、C 組可見透明薄膜形成，部分區域可見微血管，且 C 組骨水泥上薄膜和微血管明顯多于 B 組。見圖 2。
圖1
術后 4 周各組 X 線片
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure1. X-ray films of each group at 4 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C
圖2
術后 6 周各組大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure2. General observation of each group at 6 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C
2.2 免疫組織化學染色觀察
A 組 TGF-β1、bFGF 表達均為陰性。TGF-β1、bFGF 在 B、C 組均有表達，B 組表達明顯少于 C 組。見圖 3。
圖3
術后 6 周各組免疫組織化學染色觀察（生物顯微鏡×20）
從左至右依次為 A、B、C 組 a. TGF-β1；b. bFGF
Figure3. Immunohistochemical observation of each group at 6 weeks after operation (Biomicroscope×20)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. TGF-β1; b. bFGF
2.3 ELISA 檢測
C 組 TGF-β1、bFGF 表達水平顯著高于 A、B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
ELISA 檢測術后 6 周各組大鼠血清中 TGF-β1、bFGF 表達水平（n=20，
，pg/mL）
Table1.
The expressions of serum TGF-β1 and bFGF detected by ELISA in 3 groups at 6 weeks after operation (n=20, 
, pg/mL)
3 討論
對于較大范圍長骨干骨缺損，常用治療方法有帶血管的自體骨移植技術、Ilizarov 骨搬移技術、Masquelet 技術，3 種方法各有優缺點。帶血管的自體骨移植技術需要作血管顯微吻合，且容易出現受區應力性骨折及供區并發癥；而且其適用于骨缺損范圍較小的患者，當骨缺損>6 cm 時，采用該方法重建骨干后骨愈合是不完全的，還容易出現植骨塊吸收的情況。雖然 Ilizarov 骨搬移技術適應證較廣泛，尤其適用于合并軟組織缺損和感染的患者，但骨缺損愈合時間較長，術后護理不便，常需多次手術，并發癥較多，如釘道感染、松動，關節粘連僵硬，神經損傷，對合端偏移等；該技術治療后骨不愈合發生率較高，并且需要特殊的復雜裝置。Masquelet 技術可用于修復創傷后骨缺損、惡性腫瘤切除術后的骨缺損、骨髓炎性骨缺損等，還可用于骨骺、干骺端、足跗骨、下頜骨等長骨骨干以外的骨缺損；尤其對于感染引起的骨缺損，骨水泥中混入萬古霉素可有效控制感染，優勢較其他方法明顯。
Masquelet 技術分兩期進行，一期首先對骨缺損區徹底清創，將聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥混入抗生素，塑形為棒狀填充連接骨斷端，用軟組織包裹骨水泥，縫合筋膜和皮膚，并用外固定架固定骨缺損兩端。一期術后 6～8 周軟組織愈合良好、感染控制的情況下，二期手術去除外固定架，切開軟組織及形成的誘導膜，小心取出骨水泥以免損傷誘導膜，打通纖維膜兩端，使骨髓腔與膜囊腔相通，同時在膜囊腔內填滿切碎的自體松質骨或骨替代材料。動物實驗表明[6]，誘導膜上有垂直于骨長軸方向密集排列的小血管系統，還能分泌促進成骨的生長因子，如 TGF-β1、bFGF、VEGF 等。VEGF 不僅可促進膜內皮細胞增殖，還可促進成骨細胞的增殖與分化，為骨的生長提供營養，并促進骨再生；TGF-β1 可促進成骨細胞的新陳代謝和細胞外基質的合成；bFGF 可促進骨的再生與修復。因此，在骨生長區形成的誘導膜可以誘導出更強的骨重建。Gouron 等[7]在動物模型中發現，誘導膜囊腔內有破骨細胞及破骨前體細胞，這些細胞可能有助于骨重建。
近年來大量研究表明淫羊藿苷有益于骨損傷愈合[8-10]，抑制破骨細胞活性同時促進成骨細胞增殖，在骨傷科應用較多。國內外許多學者已從分子水平對淫羊藿苷的作用機制進行了深入研究，淫羊藿苷具有減少骨吸收、促進骨形成、增加骨密度的作用[11-12]；還能增加骨痂厚度，提高骨折愈合質量，增加 TGF-β1 等因子在骨痂組織中的表達[13]。高子范等[14]研究認為，淫羊藿注射液對雞胚脛骨有促進作用，用藥組骨長度、干重和滲透度均明顯增加，且能促進蛋白質的合成。本研究應用 Masquelet 技術治療后再進行淫羊藿藥物干預，觀察誘導膜內血管化及其相關生物活性因子 TGF-β1 和 bFGF 的變化，為淫羊藿苷在 Masquelet 技術修復骨缺損中的應用提供實驗依據。結果發現，與對照組比較，實驗組中淫羊藿苷能使誘導膜組織內 bFGF、TGF-β1 表達顯著上升，與臨床治療情況一致。
目前已有研究證實[15-16]，誘導膜內微血管系統與成骨細胞分化增殖密切相關，這對二期植骨后的新骨形成意義重大。基于此，我們下一步將對淫羊藿苷促進誘導膜微血管化的具體分子調控機制進行深入分析，而微血管化如何影響 Masquelet 技術后期骨再生修復的機制也需要進一步研究。
作者貢獻：丁強負責實驗實施及文章撰寫；孫楠負責數據收集整理；王孝輝負責實驗設計及統計學分析。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
臨床上各種原因造成的大段骨缺損一直是骨科治療難題。淫羊藿是中醫骨傷科常用藥物，為補命門、益精氣、強筋骨、補腎壯陽之要藥。藥理實驗表明，淫羊藿能增加心腦血管血流量，促進造血功能、免疫功能及骨代謝，具有抗衰老、抗腫瘤等功效；臨床常用于治療腎虛腰痛、筋骨折傷等疾病[1-2]。其有效成分淫羊藿苷對新骨形成及骨修復具有顯著促進作用[3-4]。自 2000 年 Masquelet 報道采用一期抗生素骨水泥填充、二期植骨治療大段骨缺損獲得優良臨床效果以來，該方法逐漸受到臨床醫師的關注，但也存在治療時間長、骨質塑形慢等問題。在 Masquelet 技術一期和二期兩個階段中，骨修復再生的基礎是誘導膜形成，目前關于淫羊藿苷對誘導膜形成期的影響鮮見報道。通過調節內源性細胞因子提高誘導膜微血管化程度，可以作為促進后期植骨血管化和骨再生的突破口。
本研究通過制備大鼠脛骨骨缺損模型，應用 Masquelet 技術治療后再進行淫羊藿藥物干預，觀察誘導膜內血管化及其相關生物活性因子 TGF-β1 和 bFGF 的變化，為淫羊藿苷在誘導膜技術修復骨缺損中的應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級 3 月齡健康 Wistar 雄性大鼠 60 只，體質量 180～200 g，由河南省實驗動物中心提供，全部大鼠均適應性飼養 1 周后開始實驗。實驗動物使用許可證號：SYXK（豫）2015-0001。
淫羊藿苷（成都曼斯特生物科技有限公司）；淫羊藿總黃酮注射液（深褐色液體，含 20 mg/mL 淫羊藿苷，總黃酮含量為 88%；北京世佳研究中心提供）；去甲萬古霉素抗生素骨水泥（Palacos 公司名，德國）；蘇木素-伊紅染色液（北京雷根生物技術有限公司）；大鼠 TGF-β1 和 bFGF 的 ELISA 試劑盒（上海通蔚科技有限公司）；組織脫水機、染色機（上海五相儀器儀表有限公司）；BX53 生物顯微鏡（Olympus 公司，日本）；超凈工作臺（浙江蘇凈凈化設備有限公司）。
1.2 實驗分組及方法
將 60 只大鼠按隨機數字表法分為 3 組，每組 20 只。所有大鼠腹腔注射戊巴比妥（5 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定于超凈工作臺上。于右后肢脛骨中段外側作一長約 2 cm 縱切口，逐層切開分離，顯露脛骨干骨質，分離周圍肌肉組織，用手外科電動擺鋸截取長約 6 mm 骨質，將 1.5 cm 克氏針由骨缺損遠近端插入脛骨髓腔。空白組（A 組）骨缺損處不作處理；對照組（B 組）和實驗組（C 組）將處于拉絲期的去甲萬古霉素抗生素骨水泥填充于骨缺損處，待骨水泥完全凝固，沖洗并縫合切口。術后各組大鼠均連續 3 d 腹腔注射青霉素鈉（8 萬 U/d）預防感染，常規飼料喂養。術后第 1 天開始，C 組每天淫羊藿總黃酮注射液稀釋液（10 μmol/L）灌胃 1 次（0.3 mL）[5]，A、B 組予以等量生理鹽水灌胃。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察實驗動物圍術期恢復及切口愈合情況；術后 4 周攝 X 線片觀察脛骨近端骨缺損恢復情況；術后 6 周所有動物腹腔注射戊巴比妥（5 mg/kg）麻醉后于原切口處切開，大體觀察骨缺損處肉芽組織及誘導膜組織形態變化及其血管化程度。
1.3.2 免疫組織化學染色觀察
術后 6 周大體觀察后，取各組大鼠骨缺損處組織進行連續切片，片厚 4～5 μm，常規脫蠟至水。用 0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）高壓熱修復抗原，PBS 沖洗 2 次，每次 5 min；30 mL/L H2O2 阻斷內源性過氧化物酶 10 min，PBS 沖洗 2 次，每次 5 min；滴加 TGF-β1、bFGF 一抗 4℃ 過夜，PBS 沖洗 2 次，每次 5 min；滴加二抗和三抗，PBS 各沖洗 2 次，每次 5 min；DAB 顯色 5～20 min，有滿意陽性結果時終止染色；蒸餾水沖洗 10 min，PBS 沖洗 2 次，每次 5 min；蘇木素復染 2 min，BX53 生物顯微鏡下觀察適時終止；梯度系列乙醇脫水、二甲苯透明各 5 min、樹脂封片，生物顯微鏡下觀察。
1.3.3 ELISA 法檢測血清 TGF-β1和 bFGF 表達
術后 6 周于動物腹腔取血靜置 30 min 以上，4℃ 以離心半徑 10 cm、2 500 r/min 離心 20 min，輕輕吸取上層血清，采用 ELISA 法檢測大鼠血清 TGF-β1、bFGF 水平。
1.4 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
3 組大鼠骨缺損模型均造模成功，術后無異常，切口均Ⅰ期愈合。術后 4 周 X 線片觀察示，A 組脛骨近端骨缺損處能觀察到明顯空隙；B、C 組脛骨近端骨缺損處骨水泥充填，克氏針固定良好。見圖 1。術后 6 周大體觀察示，A 組可見缺損區被肉芽組織充填；B、C 組可見透明薄膜形成，部分區域可見微血管，且 C 組骨水泥上薄膜和微血管明顯多于 B 組。見圖 2。
圖1
術后 4 周各組 X 線片
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure1. X-ray films of each group at 4 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C
圖2
術后 6 周各組大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure2. General observation of each group at 6 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C
2.2 免疫組織化學染色觀察
A 組 TGF-β1、bFGF 表達均為陰性。TGF-β1、bFGF 在 B、C 組均有表達，B 組表達明顯少于 C 組。見圖 3。
圖3
術后 6 周各組免疫組織化學染色觀察（生物顯微鏡×20）
從左至右依次為 A、B、C 組 a. TGF-β1；b. bFGF
Figure3. Immunohistochemical observation of each group at 6 weeks after operation (Biomicroscope×20)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. TGF-β1; b. bFGF
2.3 ELISA 檢測
C 組 TGF-β1、bFGF 表達水平顯著高于 A、B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
ELISA 檢測術后 6 周各組大鼠血清中 TGF-β1、bFGF 表達水平（n=20，，pg/mL）
Table1.
The expressions of serum TGF-β1 and bFGF detected by ELISA in 3 groups at 6 weeks after operation (n=20, , pg/mL)
3 討論
對于較大范圍長骨干骨缺損，常用治療方法有帶血管的自體骨移植技術、Ilizarov 骨搬移技術、Masquelet 技術，3 種方法各有優缺點。帶血管的自體骨移植技術需要作血管顯微吻合，且容易出現受區應力性骨折及供區并發癥；而且其適用于骨缺損范圍較小的患者，當骨缺損>6 cm 時，采用該方法重建骨干后骨愈合是不完全的，還容易出現植骨塊吸收的情況。雖然 Ilizarov 骨搬移技術適應證較廣泛，尤其適用于合并軟組織缺損和感染的患者，但骨缺損愈合時間較長，術后護理不便，常需多次手術，并發癥較多，如釘道感染、松動，關節粘連僵硬，神經損傷，對合端偏移等；該技術治療后骨不愈合發生率較高，并且需要特殊的復雜裝置。Masquelet 技術可用于修復創傷后骨缺損、惡性腫瘤切除術后的骨缺損、骨髓炎性骨缺損等，還可用于骨骺、干骺端、足跗骨、下頜骨等長骨骨干以外的骨缺損；尤其對于感染引起的骨缺損，骨水泥中混入萬古霉素可有效控制感染，優勢較其他方法明顯。
Masquelet 技術分兩期進行，一期首先對骨缺損區徹底清創，將聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥混入抗生素，塑形為棒狀填充連接骨斷端，用軟組織包裹骨水泥，縫合筋膜和皮膚，并用外固定架固定骨缺損兩端。一期術后 6～8 周軟組織愈合良好、感染控制的情況下，二期手術去除外固定架，切開軟組織及形成的誘導膜，小心取出骨水泥以免損傷誘導膜，打通纖維膜兩端，使骨髓腔與膜囊腔相通，同時在膜囊腔內填滿切碎的自體松質骨或骨替代材料。動物實驗表明[6]，誘導膜上有垂直于骨長軸方向密集排列的小血管系統，還能分泌促進成骨的生長因子，如 TGF-β1、bFGF、VEGF 等。VEGF 不僅可促進膜內皮細胞增殖，還可促進成骨細胞的增殖與分化，為骨的生長提供營養，并促進骨再生；TGF-β1 可促進成骨細胞的新陳代謝和細胞外基質的合成；bFGF 可促進骨的再生與修復。因此，在骨生長區形成的誘導膜可以誘導出更強的骨重建。Gouron 等[7]在動物模型中發現，誘導膜囊腔內有破骨細胞及破骨前體細胞，這些細胞可能有助于骨重建。
近年來大量研究表明淫羊藿苷有益于骨損傷愈合[8-10]，抑制破骨細胞活性同時促進成骨細胞增殖，在骨傷科應用較多。國內外許多學者已從分子水平對淫羊藿苷的作用機制進行了深入研究，淫羊藿苷具有減少骨吸收、促進骨形成、增加骨密度的作用[11-12]；還能增加骨痂厚度，提高骨折愈合質量，增加 TGF-β1 等因子在骨痂組織中的表達[13]。高子范等[14]研究認為，淫羊藿注射液對雞胚脛骨有促進作用，用藥組骨長度、干重和滲透度均明顯增加，且能促進蛋白質的合成。本研究應用 Masquelet 技術治療后再進行淫羊藿藥物干預，觀察誘導膜內血管化及其相關生物活性因子 TGF-β1 和 bFGF 的變化，為淫羊藿苷在 Masquelet 技術修復骨缺損中的應用提供實驗依據。結果發現，與對照組比較，實驗組中淫羊藿苷能使誘導膜組織內 bFGF、TGF-β1 表達顯著上升，與臨床治療情況一致。
目前已有研究證實[15-16]，誘導膜內微血管系統與成骨細胞分化增殖密切相關，這對二期植骨后的新骨形成意義重大。基于此，我們下一步將對淫羊藿苷促進誘導膜微血管化的具體分子調控機制進行深入分析，而微血管化如何影響 Masquelet 技術后期骨再生修復的機制也需要進一步研究。
作者貢獻：丁強負責實驗實施及文章撰寫；孫楠負責數據收集整理；王孝輝負責實驗設計及統計學分析。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
