目的觀察轉化生長因子-β(TGF-β)受體抑制劑復合物C對人胚胎干細胞(hESC)向視網膜色素上皮(RPE)細胞定向誘導效率的影響。 方法將H1 hESC分為對照組和實驗組。對照組在細胞過度融合后,以去除堿性成纖維細胞生長因子的血清替代物培養體系誘導RPE細胞定向分化。實驗組于誘導分化前6 d在培養體系中加入1 μmol/L復合物C。誘導分化第1、3、5周,采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測兩組人類配對盒基因(PAX6)、小眼球相關轉錄因子(MITF)、細胞視黃醛結合蛋白(CRALBP)、RPE65 mRNA的表達。將hESC來源的RPE (hESC-RPE)細胞分離純化,采用RT-PCR、蛋白免疫印跡法(Western blot)和細胞免疫熒光法對純化的hESC-RPE細胞進行鑒定。 結果誘導分化第4周,實驗組肉眼可見色素團塊,對照組無色素團塊出現。將實驗組的色素細胞分離純化后,可見100%的細胞表現為多角形色素化。RT-PCR檢測結果顯示,實驗組PAX6 mRNA表達在誘導分化第1、3周顯著高于對照組,差異有統計學意義(t=28.498、3.141,P<0.05);誘導分化第3、5周,實驗組MITF (t=8.866、10.111)、CRALBP (t=5.293、5.394)和RPE65(t=9.263、9.504)的表達均明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。hESC-RPE細胞PAX6、MITF、CRALBP、RPE65 mRNA表達均顯著高于hESC (t=9.154、17.284、18.204、44.194)和ARPE-19(t=7.605、16.770、18.190、44.190)細胞,差異有統計學意義(P<0.05)。Western blot檢測結果顯示,hESC-RPE細胞高水平表達RPE標志蛋白PAX6、RPE65。熒光顯微鏡觀察發現,hESC-RPE細胞表達RPE細胞特異性標志蛋白PAX6、緊密連接蛋白-1。 結論TGF-β受體抑制劑復合物C能顯著提高hESC向RPE定向誘導效率。
目的觀察苯丙氨酸對胚胎干細胞（ESC）向視網膜色素上皮（RPE）細胞定向分化誘導效率的影響。 方法H1人ESC（hESC）分為對照組和實驗組，以mTeSR培養基常規培養。細胞克隆過度融合后對照組以撤除堿性成纖維細胞生長因子、含10% knockout血清替代物的培養基誘導hESC自主分化至第7周。實驗組從第3周開始在誘導培養基中添加0.2 mmol/L苯丙氨酸培養至第7周。觀察兩組細胞形態學變化；實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測人類配對盒基因6（Pax6）、小眼球相關轉錄因子（MITF）、RPE65、酪氨酸酶（tyrosinase）、Wnt配體（Wnt3a）、淋巴樣增強因子-1（Lef1）、轉錄因子7（Tcf7）基因mRNA的表達；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測MITF、RPE65蛋白的表達；流式細胞技術（FCM）檢測RPE65陽性細胞比例。Sprague Dawley大鼠12只，隨機分為對照組和治療組；單眼內路法視網膜下腔注射，對照組注射2μl 1倍磷酸鹽緩沖液，治療組注射2μl純化的hESC-RPE。治療后6周行視網膜電圖（ERG）檢查，觀察暗適應3.0 a-b波振幅。 結果誘導分化第7周，實驗組出現大量肉眼可見的色素團塊，明顯多于對照組。色素化區域內可見多邊形蜂窩狀排列的單層細胞，胞質充滿色素顆粒。RT-PCR檢測結果顯示，實驗組Pax6、MITF、RPE65、tyrosinase（t=39.44、26.14、31.28、77.24）、Wnt3a、Lef1、Tcf7（t=46.11、27.69、17.42）mRNA表達量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。Western blot檢測結果顯示，實驗組MITF、RPE65蛋白表達量高于對照組。FCM檢測結果顯示，實驗組、對照組RPE65陽性比例分為（18.91±1.76）%、（0.88±0.09）%；實驗組RPE65陽性比較明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。ERG檢查結果顯示，治療組大鼠暗適應3.0 a-b波振幅較對照組顯著提高，差異有統計學意義（t=7.543，P＜0.01）。 結論苯丙氨酸顯著提高hESC向RPE定向誘導效率。hESC誘導來源的RPE細胞視網膜下移植能改善視網膜變性模型動物視功能。