目的探討抑制 miR-429 改善體外血脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）通透性的可行性及機制，為改善脊髓微環境提供新的基因治療靶點。方法首先，取永生化人腦微血管內皮細胞系（hCMEC/D3），應用 miR-429 拮抗劑 antagomiR-429 及其陰性對照 antagomiR-429-NC 進行轉染，通過熒光顯微鏡觀察以及實時熒光定量 PCR 檢測 miR-429 表達，驗證 antagomiR-429 轉染效率。然后觀察 miR-429 對體外 BSCB 通透性的影響。實驗分為 4 組，其中空白對照組（A 組）為正常 hCMEC/D3 細胞、Ha-sc 細胞構建 BSCB 模型，低氧誘導組（B 組）、低氧誘導+antagomiR-429-NC 組（C 組）、低氧誘導+antagomiR-429 組（D 組）分別采用正常、antagomiR-429-NC 轉染以及 antagomiR-429 轉染的 hCMEC/D3 細胞，與 Ha-sc 細胞構建 BSCB 模型并低氧處理 12 h。通過辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）通量測定體外 BSCB 通透性，實時熒光定量 PCR、Western blot 和免疫熒光染色觀測內皮細胞中緊密連接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表達水平。結果熒光顯微鏡下觀察 antagomiR-429 及 antagomiR-429-NC 成功轉染至 hCMEC/D3 細胞，轉染效率約為 90%；實時熒光定量 PCR 檢測 antagomiR-429 組 miR-429 相對表達量為 0.109±0.013，明顯低于 antagomiR-429-NC 組的 0.956±0.004（P<0.05）。HRP 通透性測量、實時熒光定量 PCR 及 Western blot 檢測顯示，B、C 組 HRP 通透性明顯高于 A、D 組，ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白及 mRNA 相對表達量均明顯低于 A、D 組（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05），D 組尚未達 A 組水平（P<0.05）。免疫熒光染色觀察示 D 組 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白在細胞膜邊界免疫熒光較 B、C 組增強，但尚未達 A 組強度。結論通過抑制 miR-429 表達可促進微血管內皮細胞中 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白表達，進而改善因低氧導致的 BSCB 通透性增高。
目的 研究BMSCs 移植對大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后VEGF 受體胎肝激酶1（fetal liver kinase 1，Flk-1）基因和蛋白表達的影響，探討BMSCs 移植修復大鼠SCI 的機制。 方法 取4 周齡雄性Wistar 大鼠5 只，體重100 ～ 120 g，進行BMSCs 分離及培養。取81 只Wistar 雌性大鼠，體重220 ～ 250 g，采用改良Allen’s 打擊裝置制備SCI 模型，隨機分為3 組：假手術組（A 組，n=21），僅咬除T8 ～ 10 棘突和椎板；DMEM 組（B 組，n=30），SCI 區周圍注射DMEM；BMSCs 組（C 組，n=30），SCI 區周圍注射BMSCs。于移植術后1、3、5 d，采用RT-PCR 方法檢測各組大鼠SCI 區Flk-1 基因表達的變化；于移植術后3、7、14 d，免疫組織化學方法觀察脊髓內Flk-1 蛋白的表達。 結果 原代培養的BMSCs 細胞形態多樣，隨著傳代次數的增加，細胞形態逐漸趨于均一，多為扁平形和長梭形。RT-PCR 結果顯示，在移植術后1、3、5 d，C 組Flk-1 mRNA 表達水平與B 組比較差異無統計學意義（P gt; 0.05）；但B、C 組與A 組比較，Flk-1 mRNA表達于術后1 d 明顯增加并達峰值（P lt; 0.01），術后3 d 下降（P lt; 0.01），至術后5 d 表達仍高于A組（P lt; 0.05）。免疫組織化學結果顯示，移植術后3 、7 d，B 組Flk-1 蛋白表達較A 組顯著增加，差異有統計學意義（P lt; 0.01）；術后14 d，A、B 組Flk-1 蛋白表達差異無統計學意義（P gt; 0.05） ；移植術后3 d，B、C 組Flk-1 表達相似，差異無統計學意義（P gt; 0.05），移植術后7 、14 d，C 組Flk-1 表達明顯高于B 組（P lt; 0.01）。 結論 SCI 后BMSCs 移植對Flk-1 mRNA 的表達無調節作用，但上調Flk-1 蛋白的表達，是修復SCI 的機制之一。
目的通過瞬時轉染缺氧誘導因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）基因，觀察缺氧處理后人羊膜間充質干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）成活及凋亡情況，探討 HIF-1α 對 hAMSCs 耐受缺氧能力的影響。方法取健康剖宮產產婦自愿捐贈的羊膜組織分離、培養 hAMSCs，通過倒置相差顯微鏡觀察細胞形態及免疫熒光法檢測干細胞標志物 OCT-4、NANOG 表達，對培養細胞進行鑒定。取第 3 代 hAMSCs 進行缺氧處理（200 μmol/L CoCl2）后，按以下分組瞬時轉染對應質粒：A 組為 hAMSCs 空白組，B 組為 pcDNA3.1 陰性對照組，C 組為 shRNA 陰性對照組，D 組為 shRNA-HIF-1α 干擾組，E 組為 pcDNA3.1-HIF-1α 過表達組。缺氧處理后 12、24、48 h 采用細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）檢測各組細胞成活率；24 h 采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，并采用 Western blot 檢測 HIF-1α、VEGF、B 細胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bax、活化型半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3，C-Caspase-3）蛋白表達。結果CCK-8 法檢測示，缺氧處理后各時間點與 A、C 組比較，D 組細胞成活率明顯降低（P<0.05）；與 A、B 組比較，E 組細胞成活率明顯升高，其中 24 h 組間比較差異有統計學意義（P<0.05）；E 組內 24 h 時細胞成活率明顯高于 12、48 h 時（P<0.05）。流式細胞儀檢測示，與 A、C 組比較，D 組細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與 A、B 組比較，E 組細胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。Western blot 檢測示，與 A、C 組比較，D 組細胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表達明顯減少，Bax、C-Caspase-3 蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）；而 E 組結果相反，與 A、B 組比較，E 組細胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表達明顯增加，Bax、C-Caspase-3 蛋白表達明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）。結論HIF-1α 基因過表達能夠明顯改善 hAMSCs 耐受缺氧能力，其機制可能與上調 VEGF 和 Bcl-2 表達及下調 Bax 和 C-Caspase-3 表達作用相關。
目的 研究BMSCs 移植對大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后運動功能恢復、VEGF 基因表達和血管生成的影響，探討BMSCs 治療SCI 的機制。 方法 取5 只4 周齡Wistar 雄性大鼠骨髓，分離培養BMSCs，取第3 ～ 4 代細胞進行實驗。取Wistar 雌性成年大鼠87 只，體重220 ～ 250 g，隨機分為假手術組（A 組，21 只）、DMEM注射組（B 組，33 只）和BMSCs 移植組（C 組，33 只）。A 組僅咬除T8 ～ 10 棘突和椎板；B、C 組參照Nystrom 方法制備T8 ～ 10 SCI 模型，傷后30 min C 組注射BMSCs（共3.0 × 105 個），B 組注射等量DMEM。于術后3、7、14、28 d 采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分法評價大鼠后肢運動功能；術后3、7、14、28 d 應用Ⅷ因子免疫組織化學染色行微血管計數觀測血管生成情況；術后1、3、5 d 應用RT-PCR 法檢測損傷脊髓組織內VEGF mRNA 的表達。 結果 術后各時間點B、C 組大鼠后肢功能隨時間延長均有不同程度恢復，各時間點BBB 評分與A 組比較差異均有統計學意義（P lt; 0.05）。術后28 d，C 組BBB 評分顯著高于B 組（P lt; 0.05），其余時間點B、C 組比較差異無統計學意義（P gt; 0.05）。術后3 d，B、C 組損傷周圍區脊髓灰質腹側角內微血管數目明顯少于A 組（P lt; 0.05）；術后7、14、28 d 與A 組比較差異無統計學意義（P gt; 0.05）。C 組術后3、7 d 脊髓灰質腹側角內微血管數目與B 組比較差異無統計學意義（P gt; 0.05）；但術后14、28 d 顯著高于B 組（P lt; 0.05）。各組術后各時間點損傷周圍區脊髓白質內的微血管數目比較差異均無統計學意義（P gt; 0.05）。RTPCR檢測示，A 組大鼠脊髓組織內VEGF mRNA 表達水平較低。B、C 組與A 組相比，于術后1 d 開始VEGF mRNA 表達增加，3 d 時表達達峰值，5 d 時表達下降但仍高 于A 組，各時間點與A 組比較差異均有統計學意義（P lt; 0.05）；C 組各時間點均高于B 組（P lt; 0.05）。 結論 BMSCs 可能通過上調VEGF 基因表達和增加脊髓內新生血管而促進大鼠SCI 后運動功能恢復。
目的 氨基胍（aminoguanidine，AG）能顯著減輕腦外傷及中風動物模型腦水腫，提高神經功能恢復程度。探討AG對大鼠急性脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后脊髓水腫的作用及相關機制。 方法 取成年雄性SD大鼠150只（體重230～255 g），分為對照組（A組，25只）、假損傷組（B組，25只）、SCI后未治療組（C組，25只）和SCI后AG治療組（75只）；AG治療組按給藥劑量分為AG 75 mg/kg組（D組，25只）、AG 150 mg/kg組（E組，25只）和AG 300 mg/kg組（F組，25只）。A組未行任何處理，B組僅行椎板切除術但不治療；C、D、E、F組制備靜壓型大鼠SCI模型后，C組腹腔注射5%DMSO，D、E、F組腹腔注射相應劑量AG。于造模后0、12、24、48 h用干濕重法檢測受損脊髓組織含水量以篩選最佳劑量，進一步用伊文思蘭（Evans blue，EB）法評測血-脊髓屏障功能，用RT-PCR檢測水通道蛋白4（aquaporins 4，AQP4）mRNA表達，Western blot和免疫組織化學染色檢測AQP4蛋白表達。 結果脊髓組織含水量檢測示，E組在造膜后12、24、48 h對SCI后脊髓組織水腫有明顯抑制作用（P lt; 0.05），選擇該劑量組用于后續實驗。造模后12、24、48 h，E組EB含量明顯低于C組（P lt; 0.05），降低血-脊髓屏障通透性。RT-PCR檢測結果示造模后12、24、48 h，B、E組AQP4 mRNA表達明顯低于C組；Western blot檢測示造模后24、48 h，B、E組AQP4蛋白表達明顯低于C組；免疫組織化學染色示造模后48 h，B、E組AQP4蛋白表達明顯低于C組，差異均有統計學意義（P lt; 0.05）；但各指標各時間點B、E組間比較，差異均無統計學意義（P gt; 0.05）。 結論急性SCI后大鼠經150 mg/kg AG治療后，能降低AQP4表達，改善脊髓水腫，減輕損傷。