引用本文： 孫瑞, 于德水. 抑制 miR-429 促進 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白表達改善血脊髓屏障通透性的體外實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(9): 1163-1169. doi: 10.7507/1002-1892.202001097 復制
脊髓損傷是一類嚴重的中樞神經創傷性疾病[1-2]，主要臨床表現為不同程度截癱，給患者和家庭帶來沉重負擔[3]。在原發性脊髓損傷基礎上，因繼發性脊髓損傷導致的組織局部缺氧會進一步加重脊髓損傷程度[4]。相關研究證明，血脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）在繼發性脊髓損傷中起著至關重要的作用[5-6]，修復 BSCB 是減輕繼發性脊髓損傷的關鍵步驟之一[7-8]。ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 是 BSCB 中重要的緊密連接蛋白，研究發現上述蛋白含量升高后，BSCB 通透性下降[9-11]。而 BSCB 通透性降低，繼發性脊髓損傷嚴重程度也會大幅度下降[12]。
各細胞中 miRNA 是通過靶向下游基因發揮調節功能的重要分子之一[13]。例如，miR-429 可通過介導下游基因 Bcl-2 mRNA 促進動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡下調[14]。近期研究表明，miR-429 參與內皮細胞的遷移和緊密連接蛋白的表達，同時還可以在一定程度逆轉因低氧導致的人羊膜 MSCs 損傷[15-16]。本研究通過將 miR-429 拮抗劑 antagomiR-429 轉染的人微血管內皮細胞，與脊髓細胞構建體外 BSCB 模型并進行低氧處理，觀察內皮細胞中緊密連接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表達以及 BSCB 通透性變化，探討 miR-429 對 BSCB 通透性的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞及培養
永生化人腦微血管內皮細胞系（hCMEC/D3）和人星形膠質細胞-脊髓細胞系（Ha-sc）由錦州醫科大學曹陽教授提供。hCMEC/D3 細胞采用含 10%FBS、1% 青/鏈霉素、1%VEGF 的內皮細胞培養基培養；Ha-sc 細胞采用含 10% FBS、1% 青/鏈霉素的 DMEM/F12 培養；置于 37℃、5%CO2 孵箱中培養，每 48 小時更換 1 次培養基。
1.2 主要試劑及儀器
內皮細胞培養基、VEGF、FBS、青/鏈霉素（ScienCell 公司，美國）；DMEM/F12、胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；antagomiR-429 及其陰性對照 antagomiR-429-NC、siRNA Mate Plus、TRIzol 試劑（江蘇吉瑪基因股份有限公司）；兔抗 ZO-1 多克隆抗體、兔抗 Occludin 多克隆抗體、兔抗 Claudin-5 多克隆抗體（Affinity 公司，美國）；兔抗 GAPDH 多克隆抗體、山羊抗兔 IgG-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）二抗（Earthox 公司，美國）；HRP（北京索萊寶科技有限公司）；四甲基聯苯胺（Sigma 公司，美國）；蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、ECL 化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；GoScriptTM Reverse Transcription System 逆轉錄試劑盒、GoTaq? qPCR Master Mix 試劑盒、Dual Luciferase? Reporter Assay System 試劑盒（Promega 公司，美國）。
6 孔 Transwell 小室（Corning 公司，美國）。倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；紫外分光光度計（Tecan 公司，美國）；全自動電泳儀、凝膠成像系統、實時熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）；YCP 系列三氣培養箱（深圳市華曦達科技股份有限公司）。
1.3 antagomiR-429 轉染 hCMEC/D3 細胞方法及觀測
1.3.1 antagomiR-429 轉染細胞方法
實驗分為空白對照組、antagomiR-429-NC 組及 antagomiR-429 組。取內皮細胞培養基培養 12 h 的 hCMEC/D3 細胞，按照說明書采用 siRNA Mate Plus 轉染試劑，將 antagomiR-429、antagomiR-429-NC 分別轉染至細胞（antagomiR-429 組、antagomiR-429-NC 組）中，無菌培養箱中孵育 4～6 h ，更換內皮細胞培養基后觀測。以內皮細胞培養基正常培養的 hCMEC/D3 細胞作為空白對照組。
1.3.2 觀測方法
① 熒光顯微鏡下觀察兩轉染組細胞內有無熒光，如呈綠色熒光表示轉染成功。② 實時熒光定量 PCR 檢測細胞中 miR-429 表達水平。取 3 組細胞，使用 TRIzol 試劑及氯仿提取總 RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄為 cDNA；按照 GoTaq? qPCR Master Mix 試劑盒說明書進行定量 PCR 分析，引物序列見表 1。反應條件：95℃、3 min，95℃、12 s，40 個循環；60℃、40 s。以 U6 作為內參。使用 2–ΔΔCt法計算 miR-429 相對表達量。實驗重復 3 次。
表1
實時熒光定量 PCR 各基因引物序列
Table1.
Primer sequence of real-time fluorescence quantitative PCR
1.4 miR-429 對體外 BSCB 通透性的影響
1.4.1 實驗分組
實驗分為 4 組，其中空白對照組（A 組）為正常 hCMEC/D3 細胞、Ha-sc 細胞構建 BSCB 模型；低氧誘導組（B 組）為正常 hCMEC/D3 細胞、Ha-sc 細胞構建 BSCB 模型并低氧處理；低氧誘導+antagomiR-429-NC 組（C 組）為 antagomiR-429-NC 轉染 hCMEC/D3 細胞、Ha-sc 細胞構建 BSCB 模型并低氧處理；低氧誘導+antagomiR-429 組（D 組）為 antagomiR-429 轉染 hCMEC/D3 細胞、Ha-sc 細胞構建 BSCB 模型并低氧處理。
1.4.2 體外 BSCB 模型制備及低氧處理
先將 Ha-sc 細胞以 1×104個/cm2密度接種于 6 孔 Transwell 上室背面，于 37℃、5%CO2 孵箱中培養；當 Ha-sc 細胞黏附后將 Transwell 上室直立并插入 6 孔板中，并將 hCMEC/D3 細胞以 1×104個/cm2密度接種在上室內面；37℃、5%CO2 孵箱中繼續培養，待融合至 90% 左右時置于低氧室中，混合氣體中含 94% N2 和 5% CO2，低氧誘導處理 12 h。各組取相應細胞參考上述方法對應處理后進行觀測。
1.4.3 觀測指標
① HRP 通透性測量：將濃度為 0.5 μmol/L 的 HRP 添加至各組 Transwell 上室中，2 h 后從下部收集樣品，添加 0.5 mmol/L 四甲基聯苯胺，于酶標儀中檢測波長 562 nm 處吸光度（A）值，評價 HRP 通透性。
② 實時熒光定量 PCR 檢測細胞中 ZO-1、Occludin、Claudin-5 mRNA 表達水平：同 1.3.2 中方法提取細胞總 RNA，使用 GoScriptTM Reverse Transcription System 逆轉錄試劑盒逆轉錄為 cDNA。按照 GoTaq? qPCR Master Mix 試劑盒說明書進行定量 PCR 分析。 引物序列見表 1。反應條件：95℃、2 min，95℃、15 s，60℃、1 min，40 個循環。以 GAPDH 作為內參，計算 ZO-1、Occludin、Claudin-5 mRNA 相對表達量。實驗重復 3 次。
③ Western blot 檢測細胞中 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白表達水平：各組細胞以 4℃ PBS 洗滌 2 次，用含 1%PMSF 的 RIPA 緩沖液提取細胞蛋白質；4℃，以 12 000×g 離心 30 min。取上清，參照 BCA 蛋白定量試劑盒確定蛋白濃度。收集裂解物，通過 SDS-PAGE 凝膠電泳進行分離，然后將其印跡至聚偏二氟乙烯膜，置于 TBST 中用 5% 脫脂奶粉密封 3 h；分別加入兔抗 ZO-1（1∶500）、兔抗 Occludin（1∶1 000）、兔抗 Claudin-5（1∶1 000）一抗，4℃ 過夜；TBST 洗滌 3 次后加入二抗（1∶5 000），37℃ 孵育 2 h。TBST 洗滌 3 次，將膜與 ECL 于暗室孵育后，用化學成像儀將蛋白條帶可視化。以 GAPDH 作為內參，以目的蛋白條帶與內參條帶灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復 3 次。
④ 免疫熒光染色觀察 ZO-1、Occludin 及 Claudin-5 蛋白表達：各組細胞以 4℃ PBS 洗滌 3 次后，于 4% 多聚甲醛固定 15 min；室溫下置于含 0.1%Triton X-100 的 PBS 中 5 min，PBS 浸漬 3 次。加入兔抗 ZO-1（1∶100）、兔抗 Occludin（1∶200）和兔抗 Claudin-5（1∶200），4℃ 濕箱中孵育過夜；與熒光二抗（1∶500）孵育 1 h。將樣品與 DAPI 在黑暗中孵育 3 min，PBST 沖洗多余 DAPI，抗熒光淬滅封片劑密封樣品。熒光顯微鏡下觀察，ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白為紅色熒光標記，DAPI 為藍色熒光標記。實驗重復 3 次。
1.5 統計學方法
采用 GraphPad 6.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 antagomiR-429 的轉染效率
熒光顯微鏡下觀察可見 antagomiR-429 及 antagomiR-429-NC 均成功轉染至 hCMEC/D3 細胞，轉染效率約為 90%（圖 1）。實時熒光定量 PCR 檢測顯示，antagomiR-429 組 miR-429 相對表達量為 0.109±0.013，明顯低于 antagomiR-429-NC 組（0.956±0.004）及空白對照組（1.005±0.072），差異有統計學意義（P<0.05）；antagomiR-429-NC 組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
圖1
細胞轉染后熒光顯微鏡觀察（×40）
a. antagomiR-429-NC 組；b. antagomiR-429 組
Figure1. Observation under fluorescence microscope after cell transfection (×40)a. antagomiR-429-NC group; b. antagomiR-429 group
2.2 miR-429 對體外 BSCB 通透性的影響
2.2.1 HRP 通透性測量
A、B、C、D 組 A 值分別為 0.171±0.002、0.206±0.006、0.214±0.003、0.185±0.003。B、C 組明顯高于 A、D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）；D 組尚未達 A 組水平，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2.2 實時熒光定量 PCR 及 Western blot 檢測
B、C 組 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白及 mRNA 相對表達量明顯低于 A、D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）；D 組尚未達 A 組水平，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2、3。
圖2
實時熒光定量 PCR 檢測各組 ZO-1、Occludin、Claudin-5 mRNA 相對表達量
Figure2.
The relative expressions of ZO-1, Occludin, Claudin-5 mRNAs in each group by real-time fluorescence quanti tative PCR
圖3
Western blot 檢測各組 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白表達
a. 電泳圖 Mr：相對分子質量 1：A 組 2：B 組3：C 組 4：D 組；b. 各組目的蛋白相對表達量
Figure3. The expressions of ZO-1, Occludin, and Claudin-5 proteins in each group detected by Western blota. Electrophoresis diagram Mr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D; b. The relative expressions of ZO-1, Occludin, and Claudin-5 proteins
2.2.3 免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡下見 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白定位于細胞膜及細胞膜與細胞膜之間連接處，其中 D 組以上 3 種蛋白在細胞膜邊界熒光染色較 B、C 組增強，但尚未達 A 組強度。見圖 4。
圖4
各組免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×400）
從左至右分別為 ZO-1/DAPI、Occludin/DAPI 和 Claudin-5/DAPI a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure4. Immunofluorescence staining observation of each group (Fluorescence microscope×400)From left to right for ZO-1/DAPI, Occludin/DAPI, and Claudin-5/DAPI a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 討論
研究表明，脊髓微環境動態平衡是維持中樞神經系統中神經元正常功能的重要因素之一[17]。BSCB 是脊髓組織與血液之間物質代謝的物理屏障，在維持中樞神經系統穩態和內部微環境穩定性中起重要作用[5-6]。既往研究重點關注脊髓損傷后神經元凋亡和自噬以及炎癥反應[18]，對通過改善 BSCB 通透性來減輕脊髓繼發性損傷的研究較少，為此我們進行了本次研究。BSCB 類似血腦屏障，主要由脊髓血管內皮細胞、基底膜和星形膠質細胞足突組成[9]。因為國內外尚未分離培養出穩定的脊髓血管內皮細胞系，而脊髓血管內皮細胞在結構上與腦血管內皮細胞相似，因此本研究用永生化人腦微血管內皮細胞系代替脊髓血管內皮細胞[19]，選擇 hCMEC/D3 細胞和 Ha-sc 細胞復合培養體外構建 BSCB。
研究表明，脊髓損傷后 BSCB 的緊密連接結構受損，導致其通透性增加，從而加重了脊髓的繼發性損傷[20]。緊密連接結構主要由緊密連接蛋白和黏附因子組成[21]，其中緊密連接蛋白含量降低是脊髓損傷后 BSCB 的一種特殊表現[20]。為此，本研究通過低氧誘導處理體外模擬脊髓損傷后 BSCB，觀察 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白水平變化。結果顯示，低氧處理可使細胞中 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白降低，進而使緊密連接蛋白結構遭到破壞，間接地解釋了脊髓損傷后間歇性低氧導致的慢性脊髓損傷和因頸椎管狹窄導致的低氧缺血性脊髓損傷中的繼發性損傷機制。
miR-429 與其余 4 個成員（miR-200a、miR-200b、miR-200c 和 miR-141）結合在一起，形成了 miR-200 家族[22]。 miR-429 廣泛存在于人類各種系統腫瘤中。據報道，miR-429 參與了各種癌癥的發展，例如膀胱癌、腎細胞癌和軟組織肉瘤[23-25]，還參與保護心肌細胞免受低氧誘導導致的凋亡[26]。同時，在透明細胞腎細胞癌中 miR-429 可以靶向 VEGF 調節細胞功能[27]。最近研究證實，miR-429 可以直接或通過其下游靶基因靶向負調控緊密連接蛋白，并參與血腫瘤屏障和血腸屏障通透性的調節[16, 28]。相比 DNA 及 mRNA，miRNA 擁有分子量小、更易轉染的生物優勢，且目前沒有文獻證明 miR-429 對 BSCB 低氧損傷修復的作用，本研究將 miR-429 抑制劑 antagomiR-429 加入體外 BSCB 模型，模擬抑制脊髓微血管內皮細胞中 miR-429 表達，以此為 miRNA 用于臨床脊髓損傷基因治療提供前期基礎及理論依據。
本研究結果顯示，通過抑制 miR-429 的表達可以改善低氧誘導的體外 BSCB 通透性，提示抑制 BSCB 中微血管內皮細胞內 miR-429 可以改善因低氧導致的繼發性脊髓損傷。與此同時，通過 Western blot、免疫熒光染色及實時熒光定量 PCR 檢測，發現抑制 miR-429 可以一定程度恢復因低氧導致的 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白降低，提示抑制微血管內皮細胞中 miR-429 表達對低氧導致的繼發性脊髓損傷的修復機制。但是不能排除 antagomiR-429 也可能影響其他結合蛋白進而調節 BSCB 的通透性。
綜上述，抑制 miR-429 可以增加體外 BSCB 中緊密連接蛋白含量，進而逆轉因低氧誘導所導致的 BSCB 通透性增加，提示 miR-429 可以作為改善脊髓微環境的基因治療靶點。
作者貢獻：孫瑞負責實驗設計及實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；于德水負責實驗設計及實施、起草文章、對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
脊髓損傷是一類嚴重的中樞神經創傷性疾病[1-2]，主要臨床表現為不同程度截癱，給患者和家庭帶來沉重負擔[3]。在原發性脊髓損傷基礎上，因繼發性脊髓損傷導致的組織局部缺氧會進一步加重脊髓損傷程度[4]。相關研究證明，血脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）在繼發性脊髓損傷中起著至關重要的作用[5-6]，修復 BSCB 是減輕繼發性脊髓損傷的關鍵步驟之一[7-8]。ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 是 BSCB 中重要的緊密連接蛋白，研究發現上述蛋白含量升高后，BSCB 通透性下降[9-11]。而 BSCB 通透性降低，繼發性脊髓損傷嚴重程度也會大幅度下降[12]。
各細胞中 miRNA 是通過靶向下游基因發揮調節功能的重要分子之一[13]。例如，miR-429 可通過介導下游基因 Bcl-2 mRNA 促進動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡下調[14]。近期研究表明，miR-429 參與內皮細胞的遷移和緊密連接蛋白的表達，同時還可以在一定程度逆轉因低氧導致的人羊膜 MSCs 損傷[15-16]。本研究通過將 miR-429 拮抗劑 antagomiR-429 轉染的人微血管內皮細胞，與脊髓細胞構建體外 BSCB 模型并進行低氧處理，觀察內皮細胞中緊密連接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表達以及 BSCB 通透性變化，探討 miR-429 對 BSCB 通透性的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞及培養
永生化人腦微血管內皮細胞系（hCMEC/D3）和人星形膠質細胞-脊髓細胞系（Ha-sc）由錦州醫科大學曹陽教授提供。hCMEC/D3 細胞采用含 10%FBS、1% 青/鏈霉素、1%VEGF 的內皮細胞培養基培養；Ha-sc 細胞采用含 10% FBS、1% 青/鏈霉素的 DMEM/F12 培養；置于 37℃、5%CO2 孵箱中培養，每 48 小時更換 1 次培養基。
1.2 主要試劑及儀器
內皮細胞培養基、VEGF、FBS、青/鏈霉素（ScienCell 公司，美國）；DMEM/F12、胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；antagomiR-429 及其陰性對照 antagomiR-429-NC、siRNA Mate Plus、TRIzol 試劑（江蘇吉瑪基因股份有限公司）；兔抗 ZO-1 多克隆抗體、兔抗 Occludin 多克隆抗體、兔抗 Claudin-5 多克隆抗體（Affinity 公司，美國）；兔抗 GAPDH 多克隆抗體、山羊抗兔 IgG-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）二抗（Earthox 公司，美國）；HRP（北京索萊寶科技有限公司）；四甲基聯苯胺（Sigma 公司，美國）；蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、ECL 化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；GoScriptTM Reverse Transcription System 逆轉錄試劑盒、GoTaq? qPCR Master Mix 試劑盒、Dual Luciferase? Reporter Assay System 試劑盒（Promega 公司，美國）。
6 孔 Transwell 小室（Corning 公司，美國）。倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；紫外分光光度計（Tecan 公司，美國）；全自動電泳儀、凝膠成像系統、實時熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）；YCP 系列三氣培養箱（深圳市華曦達科技股份有限公司）。
1.3 antagomiR-429 轉染 hCMEC/D3 細胞方法及觀測
1.3.1 antagomiR-429 轉染細胞方法
實驗分為空白對照組、antagomiR-429-NC 組及 antagomiR-429 組。取內皮細胞培養基培養 12 h 的 hCMEC/D3 細胞，按照說明書采用 siRNA Mate Plus 轉染試劑，將 antagomiR-429、antagomiR-429-NC 分別轉染至細胞（antagomiR-429 組、antagomiR-429-NC 組）中，無菌培養箱中孵育 4～6 h ，更換內皮細胞培養基后觀測。以內皮細胞培養基正常培養的 hCMEC/D3 細胞作為空白對照組。
1.3.2 觀測方法
① 熒光顯微鏡下觀察兩轉染組細胞內有無熒光，如呈綠色熒光表示轉染成功。② 實時熒光定量 PCR 檢測細胞中 miR-429 表達水平。取 3 組細胞，使用 TRIzol 試劑及氯仿提取總 RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄為 cDNA；按照 GoTaq? qPCR Master Mix 試劑盒說明書進行定量 PCR 分析，引物序列見表 1。反應條件：95℃、3 min，95℃、12 s，40 個循環；60℃、40 s。以 U6 作為內參。使用 2–ΔΔCt法計算 miR-429 相對表達量。實驗重復 3 次。
表1
實時熒光定量 PCR 各基因引物序列
Table1.
Primer sequence of real-time fluorescence quantitative PCR
1.4 miR-429 對體外 BSCB 通透性的影響
1.4.1 實驗分組
實驗分為 4 組，其中空白對照組（A 組）為正常 hCMEC/D3 細胞、Ha-sc 細胞構建 BSCB 模型；低氧誘導組（B 組）為正常 hCMEC/D3 細胞、Ha-sc 細胞構建 BSCB 模型并低氧處理；低氧誘導+antagomiR-429-NC 組（C 組）為 antagomiR-429-NC 轉染 hCMEC/D3 細胞、Ha-sc 細胞構建 BSCB 模型并低氧處理；低氧誘導+antagomiR-429 組（D 組）為 antagomiR-429 轉染 hCMEC/D3 細胞、Ha-sc 細胞構建 BSCB 模型并低氧處理。
1.4.2 體外 BSCB 模型制備及低氧處理
先將 Ha-sc 細胞以 1×104個/cm2密度接種于 6 孔 Transwell 上室背面，于 37℃、5%CO2 孵箱中培養；當 Ha-sc 細胞黏附后將 Transwell 上室直立并插入 6 孔板中，并將 hCMEC/D3 細胞以 1×104個/cm2密度接種在上室內面；37℃、5%CO2 孵箱中繼續培養，待融合至 90% 左右時置于低氧室中，混合氣體中含 94% N2 和 5% CO2，低氧誘導處理 12 h。各組取相應細胞參考上述方法對應處理后進行觀測。
1.4.3 觀測指標
① HRP 通透性測量：將濃度為 0.5 μmol/L 的 HRP 添加至各組 Transwell 上室中，2 h 后從下部收集樣品，添加 0.5 mmol/L 四甲基聯苯胺，于酶標儀中檢測波長 562 nm 處吸光度（A）值，評價 HRP 通透性。
② 實時熒光定量 PCR 檢測細胞中 ZO-1、Occludin、Claudin-5 mRNA 表達水平：同 1.3.2 中方法提取細胞總 RNA，使用 GoScriptTM Reverse Transcription System 逆轉錄試劑盒逆轉錄為 cDNA。按照 GoTaq? qPCR Master Mix 試劑盒說明書進行定量 PCR 分析。 引物序列見表 1。反應條件：95℃、2 min，95℃、15 s，60℃、1 min，40 個循環。以 GAPDH 作為內參，計算 ZO-1、Occludin、Claudin-5 mRNA 相對表達量。實驗重復 3 次。
③ Western blot 檢測細胞中 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白表達水平：各組細胞以 4℃ PBS 洗滌 2 次，用含 1%PMSF 的 RIPA 緩沖液提取細胞蛋白質；4℃，以 12 000×g 離心 30 min。取上清，參照 BCA 蛋白定量試劑盒確定蛋白濃度。收集裂解物，通過 SDS-PAGE 凝膠電泳進行分離，然后將其印跡至聚偏二氟乙烯膜，置于 TBST 中用 5% 脫脂奶粉密封 3 h；分別加入兔抗 ZO-1（1∶500）、兔抗 Occludin（1∶1 000）、兔抗 Claudin-5（1∶1 000）一抗，4℃ 過夜；TBST 洗滌 3 次后加入二抗（1∶5 000），37℃ 孵育 2 h。TBST 洗滌 3 次，將膜與 ECL 于暗室孵育后，用化學成像儀將蛋白條帶可視化。以 GAPDH 作為內參，以目的蛋白條帶與內參條帶灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復 3 次。
④ 免疫熒光染色觀察 ZO-1、Occludin 及 Claudin-5 蛋白表達：各組細胞以 4℃ PBS 洗滌 3 次后，于 4% 多聚甲醛固定 15 min；室溫下置于含 0.1%Triton X-100 的 PBS 中 5 min，PBS 浸漬 3 次。加入兔抗 ZO-1（1∶100）、兔抗 Occludin（1∶200）和兔抗 Claudin-5（1∶200），4℃ 濕箱中孵育過夜；與熒光二抗（1∶500）孵育 1 h。將樣品與 DAPI 在黑暗中孵育 3 min，PBST 沖洗多余 DAPI，抗熒光淬滅封片劑密封樣品。熒光顯微鏡下觀察，ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白為紅色熒光標記，DAPI 為藍色熒光標記。實驗重復 3 次。
1.5 統計學方法
采用 GraphPad 6.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 antagomiR-429 的轉染效率
熒光顯微鏡下觀察可見 antagomiR-429 及 antagomiR-429-NC 均成功轉染至 hCMEC/D3 細胞，轉染效率約為 90%（圖 1）。實時熒光定量 PCR 檢測顯示，antagomiR-429 組 miR-429 相對表達量為 0.109±0.013，明顯低于 antagomiR-429-NC 組（0.956±0.004）及空白對照組（1.005±0.072），差異有統計學意義（P<0.05）；antagomiR-429-NC 組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
圖1
細胞轉染后熒光顯微鏡觀察（×40）
a. antagomiR-429-NC 組；b. antagomiR-429 組
Figure1. Observation under fluorescence microscope after cell transfection (×40)a. antagomiR-429-NC group; b. antagomiR-429 group
2.2 miR-429 對體外 BSCB 通透性的影響
2.2.1 HRP 通透性測量
A、B、C、D 組 A 值分別為 0.171±0.002、0.206±0.006、0.214±0.003、0.185±0.003。B、C 組明顯高于 A、D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）；D 組尚未達 A 組水平，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2.2 實時熒光定量 PCR 及 Western blot 檢測
B、C 組 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白及 mRNA 相對表達量明顯低于 A、D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）；D 組尚未達 A 組水平，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2、3。
圖2
實時熒光定量 PCR 檢測各組 ZO-1、Occludin、Claudin-5 mRNA 相對表達量
Figure2.
The relative expressions of ZO-1, Occludin, Claudin-5 mRNAs in each group by real-time fluorescence quanti tative PCR
圖3
Western blot 檢測各組 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白表達
a. 電泳圖 Mr：相對分子質量 1：A 組 2：B 組3：C 組 4：D 組；b. 各組目的蛋白相對表達量
Figure3. The expressions of ZO-1, Occludin, and Claudin-5 proteins in each group detected by Western blota. Electrophoresis diagram Mr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D; b. The relative expressions of ZO-1, Occludin, and Claudin-5 proteins
2.2.3 免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡下見 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白定位于細胞膜及細胞膜與細胞膜之間連接處，其中 D 組以上 3 種蛋白在細胞膜邊界熒光染色較 B、C 組增強，但尚未達 A 組強度。見圖 4。
圖4
各組免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×400）
從左至右分別為 ZO-1/DAPI、Occludin/DAPI 和 Claudin-5/DAPI a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure4. Immunofluorescence staining observation of each group (Fluorescence microscope×400)From left to right for ZO-1/DAPI, Occludin/DAPI, and Claudin-5/DAPI a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 討論
研究表明，脊髓微環境動態平衡是維持中樞神經系統中神經元正常功能的重要因素之一[17]。BSCB 是脊髓組織與血液之間物質代謝的物理屏障，在維持中樞神經系統穩態和內部微環境穩定性中起重要作用[5-6]。既往研究重點關注脊髓損傷后神經元凋亡和自噬以及炎癥反應[18]，對通過改善 BSCB 通透性來減輕脊髓繼發性損傷的研究較少，為此我們進行了本次研究。BSCB 類似血腦屏障，主要由脊髓血管內皮細胞、基底膜和星形膠質細胞足突組成[9]。因為國內外尚未分離培養出穩定的脊髓血管內皮細胞系，而脊髓血管內皮細胞在結構上與腦血管內皮細胞相似，因此本研究用永生化人腦微血管內皮細胞系代替脊髓血管內皮細胞[19]，選擇 hCMEC/D3 細胞和 Ha-sc 細胞復合培養體外構建 BSCB。
研究表明，脊髓損傷后 BSCB 的緊密連接結構受損，導致其通透性增加，從而加重了脊髓的繼發性損傷[20]。緊密連接結構主要由緊密連接蛋白和黏附因子組成[21]，其中緊密連接蛋白含量降低是脊髓損傷后 BSCB 的一種特殊表現[20]。為此，本研究通過低氧誘導處理體外模擬脊髓損傷后 BSCB，觀察 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白水平變化。結果顯示，低氧處理可使細胞中 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白降低，進而使緊密連接蛋白結構遭到破壞，間接地解釋了脊髓損傷后間歇性低氧導致的慢性脊髓損傷和因頸椎管狹窄導致的低氧缺血性脊髓損傷中的繼發性損傷機制。
miR-429 與其余 4 個成員（miR-200a、miR-200b、miR-200c 和 miR-141）結合在一起，形成了 miR-200 家族[22]。 miR-429 廣泛存在于人類各種系統腫瘤中。據報道，miR-429 參與了各種癌癥的發展，例如膀胱癌、腎細胞癌和軟組織肉瘤[23-25]，還參與保護心肌細胞免受低氧誘導導致的凋亡[26]。同時，在透明細胞腎細胞癌中 miR-429 可以靶向 VEGF 調節細胞功能[27]。最近研究證實，miR-429 可以直接或通過其下游靶基因靶向負調控緊密連接蛋白，并參與血腫瘤屏障和血腸屏障通透性的調節[16, 28]。相比 DNA 及 mRNA，miRNA 擁有分子量小、更易轉染的生物優勢，且目前沒有文獻證明 miR-429 對 BSCB 低氧損傷修復的作用，本研究將 miR-429 抑制劑 antagomiR-429 加入體外 BSCB 模型，模擬抑制脊髓微血管內皮細胞中 miR-429 表達，以此為 miRNA 用于臨床脊髓損傷基因治療提供前期基礎及理論依據。
本研究結果顯示，通過抑制 miR-429 的表達可以改善低氧誘導的體外 BSCB 通透性，提示抑制 BSCB 中微血管內皮細胞內 miR-429 可以改善因低氧導致的繼發性脊髓損傷。與此同時，通過 Western blot、免疫熒光染色及實時熒光定量 PCR 檢測，發現抑制 miR-429 可以一定程度恢復因低氧導致的 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白降低，提示抑制微血管內皮細胞中 miR-429 表達對低氧導致的繼發性脊髓損傷的修復機制。但是不能排除 antagomiR-429 也可能影響其他結合蛋白進而調節 BSCB 的通透性。
綜上述，抑制 miR-429 可以增加體外 BSCB 中緊密連接蛋白含量，進而逆轉因低氧誘導所導致的 BSCB 通透性增加，提示 miR-429 可以作為改善脊髓微環境的基因治療靶點。
作者貢獻：孫瑞負責實驗設計及實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；于德水負責實驗設計及實施、起草文章、對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
