引用本文： 張臣科, 盧衍錦, 郭宇鵬, 陳萬, 唐紅, 李懷勝, 唐康來, 何清義. 3D 打印 Ti6Al4V-4Cu 合金通過骨免疫調節促進成骨基因的表達. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(9): 1170-1176. doi: 10.7507/1002-1892.201912139 復制
骨缺損通常由創傷、感染、腫瘤、先天畸形等骨骼疾病引起[1]，骨移植是主要治療方法。但自體骨移植供骨部位有限且易發生取骨相關并發癥，同種異體骨移植又存在免疫原性和疾病傳播風險[2]。生物材料的出現為骨缺損修復提供了一種選擇，鈦及其合金因具有良好的生物相容性、較低的彈性模量及抗腐蝕性等優點，在骨科植入領域中應用廣泛[3-6]。然而，鈦合金本身的生物惰性并不利于骨組織長入[7]，且植入人體后會引起組織免疫反應，不利于骨組織生長[8-9]。因此給予材料抑制炎癥的能力，有助于促進成骨發生[10-12]。
銅離子是體內維持細胞功能的重要微量元素[13]，在骨折修復過程中起著重要作用[14]，維持血清中適當的銅離子含量可以延緩女性骨質疏松的發生[15]。同時，銅離子對體內的免疫調節反應至關重要[16]，在炎癥急性期，銅離子的代謝明顯增強[17]，且有研究表明銅離子可以抑制炎癥反應，從而促進成骨發生[18]。因此，我們考慮將銅元素引入鈦合金中，從而改善鈦合金的生物性能。傳統方法通常采用在鈦合金表面添加涂層的方式對其進行改性，然而存在涂層與金屬材料黏附性差、易脫落等問題[19]，3D 打印技術的發展為解決這一問題提供了可能。前期研究中我們通過選擇性激光熔融（selective laser melting，SLM）技術成功制造了一組含銅元素的 Ti6Al4V-xCu（x=0wt%、2wt%、4wt%、6wt%）合金[20]。預實驗提示 Ti6Al4V-4Cu 合金對細胞毒性較小，且銅元素含量適當，故本研究選擇 Ti6Al4V-4Cu，觀察該材料對小鼠 BMSCs 及小鼠單核巨噬細胞系 RAW264.7 的影響，探討 Ti6Al4V-4Cu 合金的生物相容性及是否具有促進成骨發生的特性，以期探究銅元素在成骨材料中的應用，并制備一種具有免疫調節功能的骨科植入材料。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4 周齡雄性 C57 小鼠 5 只，體質量 10～15 g，由陸軍軍醫大學（原第三軍醫大學）實驗動物中心 提供。
小鼠單核巨噬細胞系 RAW264.7 購自中國科學院細胞庫。Ti6Al4V 粉末（飛而康快速制造科技有限責任公司）。L-DMEM 培養基、FBS、0.25% 胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；青霉素-鏈霉素溶液（上海碧云天生物技術公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；合肥 Biosharp 公司）；ELISA 酶聯免疫試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；RNAiso Plus 試劑盒、定量 PCR 試劑盒 TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）、逆轉錄試劑盒 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara 公司，日本）。SLM 3D 打印機（ Concept Laser GmbH 公司，德國）；掃描電鏡（Phenom-World 公司，荷蘭）；X 射線能譜分析（energy dispersive spectrometer，EDS）儀（Hitachi 公司，日本）。
1.2 3D 打印 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件的制備與材料表征
3D 打印 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件由中國科學院福建物質結構研究所提供。以 Ti6Al4V 粉末為原材料，通過 SLM 3D 打印機制備 Ti6Al4V 合金樣件（直徑 15 mm、厚度 1 mm）。然后采用交叉孵育技術，將 Ti6Al4V 粉末與純銅粉（99.99%）混合（銅粉質量比 4wt%），同法制備 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件（直徑 15 mm、高 1 mm）。兩種合金樣件各打印 12 個。取 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件，采用掃描電鏡觀察微觀結構，EDS 儀分析合金基體元素分布，確定是否成功制備。
用 2 000 目砂紙打磨材料樣件表面，以 SiO2-H2O2 溶液對樣件拋光后，用丙酮、75% 乙醇、無水乙醇、去離子水分別對樣件超聲清洗 30 min，烘干后采用高溫高壓對材料消毒滅菌以用于細胞實驗。
1.3 Ti6Al4V-4Cu 合金生物相容性及成骨性能檢測
1.3.1 小鼠 BMSCs 分離培養
將 5 只 4 周齡雄性 C57 小鼠脫頸處死，浸入 75% 乙醇溶液中消毒處理 5 min，于無菌環境中取出兩側股骨，去除表面軟組織后用 PBS 洗滌 3 次；剪去股骨干骺端與股骨頭，用 5 mL 注射器吸取含 10%FBS 與 1% 青霉素-鏈霉素溶液的 L-DMEM 培養基沖洗骨髓腔，將沖洗出的細胞混懸液加到 25 cm2培養皿，置于 37℃、5%CO2 細胞孵箱中孵育；24 h 后去掉未貼壁細胞，每 3 天換液 1 次，5～7 d 后傳代，經鑒定后選取第 3～8 代細胞用于實驗。
1.3.2 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液的制備
依照醫療器械生物學評價標準（GB/T 16886.12-2017/ISO 10993-12-2005），將滅菌后的 3D 打印 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件放入無菌 50 mL 離心管中，按照 3 cm2/mL 向離心管中加入無血清 L-DMEM 培養基，混勻后放入 37℃、5%CO2 細胞孵箱中，72 h 后收集浸提液，添加 10%FBS 及 1% 青霉素-鏈霉素溶液備用。
1.3.3 CCK-8 法檢測細胞增殖
將 BMSCs 以 2×103個/孔密度鋪于 96 孔板中，分為 3 組，每組設 3 個復孔。24 h 后棄原始培養基，分別更換培養基為含 10%FBS 及 1% 青霉素-鏈霉素溶液的 L-DMEM 培養基（A 組）、Ti6Al4V 合金浸提液（B 組）、Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液（C 組），每 3 天換液 1 次。分別于 1、3、5 d 依據 CCK-8 試劑盒說明書檢測各組細胞的增殖情況，以 450 nm 處檢測吸光度（A）值表示。
另外，取小鼠 RAW264.7 細胞以 2×103個/孔密度鋪于 96 孔板中，同上法分組培養后，于 1、2、3 d 檢測各組細胞增殖情況，以 450 nm 處 A 值表示。
1.3.4 實時熒光定量 PCR 檢測
① 對 BMSCs 成骨相關基因表達的影響：將 BMSCs 以 1×105個/孔密度鋪于 6 孔板中，分為 2 組，每組 3 個復孔。24 h 后棄原始培養基，分別加入含 Ti6Al4V 合金浸提液（A 組）與 Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液（B 組）的成骨誘導培養基（含 10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、1 mmol/L 維生素 C、0.1 mmol/L 地塞米松的 DMEM 培養基），置于 37℃、5% CO2 細胞孵箱中誘導培養 3 d。根據 Trizol 試劑盒說明書提取兩組 RNA，測定濃度后，按照逆轉錄試劑盒 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）說明書方法提取 cDNA；再以 SYBR 熒光定量法檢測成骨相關基因Ⅰ型膠原（collagen type Ⅰ，Col-Ⅰ）、ALP、Runx 家族轉錄因子 2（Runx family transcription factor 2，Runx-2）、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的 mRNA 表達，每組重復 3 次，取均值。② 對小鼠 RAW264.7 細胞炎癥相關基因表達的影響：將小鼠 RAW264.7 細胞以 1×105個/孔密度鋪于 6 孔板中，24 h 后同上法分組成骨誘導 1 d。采用相同方法檢測炎癥相關基因 IL-4、一氧化氮合成酶 2（nitric oxide synthase 2，iNOS）的 mRNA 表達，每組重復 3 次，取均值。以上均以 2–ΔΔCt值計算各目的基因相對表達量。相關引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表 1。
表1
實時熒光定量 PCR 各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for real-time fluorescent quantitative PCR
1.3.5 ELISA 法檢測小鼠 RAW264.7 細胞分泌的相關因子
將小鼠 RAW264.7 細胞以 1×105個/孔密度鋪于 6 孔板中，分為 2 組，每組 4 個復孔。24 h 后分別更換培養基為 Ti6Al4V 合金浸提液（A 組）與 Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液（B 組）。1 d 后收集培養基，以離心半徑 15.9 cm、1 500 r/min 離心 5 min，取上清，按照 ELISA 酶聯免疫試劑盒說明書檢測上清液中 VEGF-a 與 BMP-2 的含量。
1.3.6 RAW264.7 細胞條件培養基對 BMSCs 成骨相關基因表達的影響
將小鼠 RAW264.7 細胞以 1×105個/孔密度鋪于 6 孔板中，分為 2 組，每組 3 個復孔。24 h 后分別更換培養基為 Ti6Al4V 合金浸提液（A 組）與 Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液（B 組），1 d 后收集培養基，以離心半徑 15.9 cm、1 500 r/min 離心 5 min 后取上清，與 L-DMEM 成骨誘導培養基 1∶1 混合，分別制備 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 成骨條件培養基。將 BMSCs 以 1×105個/孔密度鋪于 6 孔板中，24 h 后分別更換為 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 成骨條件培養基，3 d 后同 1.3.4 方法檢測成骨相關基因 Col-Ⅰ、ALP、Runx-2、OPG、OPN 的 mRNA 相對表達量。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 3D 打印 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件的表征
通過 3D 打印制備的 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件外觀均呈金屬光澤，表面光滑，直徑 15 mm、厚度 1 mm，二者無明顯區別（圖 1a）。Ti6Al4V-4Cu 合金掃描電鏡觀察示，深灰色為針狀 α 相（密排六方結構），銀灰色為 β 相（體心立方結構），合金組織是以 β 相為基體，與針狀 α 相密集排列組成（圖 1b）。EDS 分析顯示，銅元素質量百分比為4.08%±0.83%，說明成功制備 Ti6Al4V-4Cu 合金（圖 1c）。
圖1
3D 打印 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件表征
a. 材料外觀；b. 掃描電鏡觀察（×2 000）；c. EDS 分析
Figure1. Characterization of 3D printed Ti6Al4V and Ti6Al4V-4Cu alloy samplesa. Material appearance; b. Scanning electron microscope observation (×2 000); c. Energy dispersive spectrometer analysis
2.2 Ti6Al4V-4Cu 合金生物相容性及成骨性能檢測
2.2.1 CCK-8 法檢測細胞增殖
① 浸提液對 BMSCs 的影響：第 1 天，B、C 組 A 值顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。第 3、5 天，各組間 A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。② 浸提液對 RAW264.7 細胞的影響：除第 1、2 天，B 組 A 值顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）外，其余各時間點各組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
CCK-8 法檢測細胞增殖
a. 浸提液對 BMSCs 的影響；b. 浸提液對 RAW264.7 細胞的影響
Figure2. Detection of cell proliferation by CCK-8 methoda. Effect of extract on BMSCs; b. Effect of extract on RAW264.7 cells
2.2.2 實時熒光定量 PCR 檢測
① 對 BMSCs 成骨相關基因表達的影響：除 B 組 OPG mRNA 相對表達量顯著高于 A 組，差異有統計學意義（t=9.168，P=0.001）外，兩組 Col-Ⅰ、ALP、Runx-2、OPN mRNA 相對表達量比較差異均無統計學意義（P>0.05）。② 對小鼠 RAW264.7 細胞炎癥相關基因表達的影響：與 A 組比較，B 組 IL-4 mRNA 相對表達量明顯增加，iNOS mRNA 相對表達量明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
實時熒光定量 PCR 檢測成骨及炎癥相關基因表達
a. 對 BMSCs 成骨相關基因表達的影響；b. 對小鼠 RAW264.7 細胞炎癥相關基因表達的影響
Figure3. Detection of osteogenesis- and inflammation-related genes expression by real-time fluorescence quantitative PCRa. Effect on the expression of osteogenesis-related genes in BMSCs; b. Effect on the expression of inflammation-related genes in mouse RAW264.7 cells
2.2.3 ELISA 法檢測小鼠 RAW264.7 細胞分泌的相關因子
B 組上清液中 VEGF-a 與 BMP-2 的含量分別為（11.169±0.984）ng/L、（0.163±0.063）μg/L，顯著高于 A 組的（9.070±0.518）ng/L、（0.070±0.013）μg/L，差異均有統計學意義（t=3.269，P=0.017；t=2.506，P=0.046）。
2.2.4 RAW264.7 細胞條件培養基對 BMSCs 成骨相關基因表達的影響
B 組 BMSCs 成骨相關基因 Col-Ⅰ、ALP、Runx-2、OPG、OPN mRNA 相對表達量均顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
實時熒光定量 PCR 檢測 RAW264.7 條件培養基對 BMSCs 成骨相關基因表達的影響
Figure4.
Real-time fluorescence quantitative PCR to detect the effect of RAW264.7 conditioned medium on expression of osteogenesis-related genes in BMSCs
3 討論
近年來，許多研究報道了生物材料具有良好的骨誘導作用[21-24]，但具體作用機制仍未明確[25]。生物材料在體內外的差異表現，使得人們越來越關注體內的免疫調節機制研究[26]。骨生物材料植入后，免疫細胞通常首先產生應答反應[27]，由此形成免疫微環境，在組織修復與再生中起著核心作用[11]。巨噬細胞作為調節免疫微環境最重要的細胞之一，在骨形成中也發揮著重要作用[28]，這為研究者們開發具有骨免疫調節作用的材料奠定了理論基礎[12]。Liu 等[29]為聚醚醚酮材料制備鋅涂層，Shi 等[30]將銅離子摻入二氧化硅納米球中，Zhang 等[31]制備了摻鋅的納米涂層，Zhang 等[32]制備了含有 β-磷酸鈣涂層的鎂支架，均是利用了金屬元素調節巨噬細胞，營造一個適當的免疫微環境，從而促進成骨發生。Honda 等[33]研究也驗證了當細胞外鈣離子濃度達 14 mmol/L 時可促進小鼠巨噬細胞 J774A.1 分泌 BMP-2，從而促進成骨發生。此外，動物實驗也證明，沒有巨噬細胞的及時參與，骨折無法修復[26]。這些都說明了巨噬細胞在成骨發生中具有重要作用，然而如何利用巨噬細胞的可塑性達到促成骨發生目的，將是未來開發新型骨科材料的方向。
我們認為銅離子可以通過調節巨噬細胞從而影響成骨發生，因此本研究通過 3D 打印制備了 Ti6Al4V 及 Ti6Al4V-4Cu 合金，觀測 Ti6Al4V-4Cu 合金中銅離子對小鼠 BMSCs 與小鼠 RAW264.7 細胞增殖的影響，確定了 Ti6Al4V-4Cu 合金對細胞無毒性作用。其次，通過 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液分別與小鼠 RAW264.7 細胞共培養 24 h 后，觀測到銅離子可增強抗炎因子 IL-4 的表達，減少炎癥因子 iNOS 的表達，從而減少了炎癥發生，營造了一個良好的免疫微環境；同時，我們從兩種培養上清液中均檢測出巨噬細胞分泌的 BMP-2 和 VEGF-a，且 Ti6Al4V-4Cu 合金組含量較高。另外，我們將 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液分別與小鼠 BMSCs 共培養 3 d，檢測成骨相關基因的表達，發現相比于 Ti6Al4V，Ti6Al4V-4Cu 促進了 OPG mRNA 表達，但 Col-Ⅰ、ALP、Runx-2、OPN mRNA 的表達卻無明顯差異。然而，將培養基換為 RAW264.7 細胞條件培養基，分別與小鼠 BMSCs 共培養 3 d 后發現，Ti6Al4V-4Cu 組各成骨相關基因表達均顯著增加。結合前期檢測結果顯示，條件培養基中有巨噬細胞分泌的 BMP-2 和 VEGF-a，而且有文獻報道巨噬細胞可以通過分泌 BMP-2[33-35]和 VEGF-a[36]促進成骨發生，因此我們認為銅離子可以降低小鼠 RAW264.7 細胞向炎癥方向極化的可能，同時促進細胞分泌 BMP-2 和 VEGF-a，從而通過免疫調節營造一個良好的成骨微環境，促進成骨發生（圖 5），為金屬假體的應用提供了理論依據。同時，也有研究表明銅具有模擬缺氧的能力[30]，從而促進血管生成。Zhang 等[37]在磷酸鈣骨水泥材料中引入銅離子，使其兼具成骨和成血管功能。究其原因，Weng 等[38]認為銅離子以劑量依賴方式促進內皮細胞增殖；Li 等[39]的研究表明銅離子是通過缺氧誘導因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）通路增強 VEGF-a 的表達，從而增強血管生成；Rigiracciolo 等[40]在對乳腺癌的研究中發現，銅離子劑量依賴性誘導 HIF-1α 和 VEGF-a 基因表達，而施以銅離子螯合劑時，又抑制了乳腺癌中血管的生成。因此，銅離子在促血管生成方面具有很大潛力，是生物材料中比較有前景的添加劑，當然本實驗所用 Ti6Al4V-4Cu 合金是否也具有促血管生成的能力，有待進一步研究。
圖5
銅離子通過骨免疫調節促進成骨發生的機制
Figure5.
Mechanism of copper ion promoting osteogenesis through bone immunomodulation
綜上述，與不含銅的 Ti6Al4V 合金相比，銅離子能夠賦予材料良好的免疫調節性能，通過改變巨噬細胞炎癥表型，促使其分泌 BMP-2 和 VEGF-a，從而促進成骨發生。本研究為了解生物材料誘導成骨發生的機制奠定了基礎，為骨誘導材料的設計及研究提供了新的策略。下一步我們將繼續完善該材料在成血管及動物體內的相關研究，進一步探究成骨發生機制。
作者貢獻：張臣科參與實驗設計與實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；盧衍錦參與 Ti6Al4V 和 Ti6Al4V-4Cu 材料的設計制備及成分分析；郭宇鵬參與實驗設計及文章內容審閱；陳萬參與實驗設計；唐紅、李懷勝參與部分實驗的實施；唐康來負責文章審閱；何清義參與實驗設計、數據分析及對文章內容進行批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：所有動物實驗均經中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物福利倫理審查委員會批準（AMUWEC2018602）。實驗動物生產許可證號：SCXK（渝）20170002，使用許可證號：SYXK（渝）2017002。
骨缺損通常由創傷、感染、腫瘤、先天畸形等骨骼疾病引起[1]，骨移植是主要治療方法。但自體骨移植供骨部位有限且易發生取骨相關并發癥，同種異體骨移植又存在免疫原性和疾病傳播風險[2]。生物材料的出現為骨缺損修復提供了一種選擇，鈦及其合金因具有良好的生物相容性、較低的彈性模量及抗腐蝕性等優點，在骨科植入領域中應用廣泛[3-6]。然而，鈦合金本身的生物惰性并不利于骨組織長入[7]，且植入人體后會引起組織免疫反應，不利于骨組織生長[8-9]。因此給予材料抑制炎癥的能力，有助于促進成骨發生[10-12]。
銅離子是體內維持細胞功能的重要微量元素[13]，在骨折修復過程中起著重要作用[14]，維持血清中適當的銅離子含量可以延緩女性骨質疏松的發生[15]。同時，銅離子對體內的免疫調節反應至關重要[16]，在炎癥急性期，銅離子的代謝明顯增強[17]，且有研究表明銅離子可以抑制炎癥反應，從而促進成骨發生[18]。因此，我們考慮將銅元素引入鈦合金中，從而改善鈦合金的生物性能。傳統方法通常采用在鈦合金表面添加涂層的方式對其進行改性，然而存在涂層與金屬材料黏附性差、易脫落等問題[19]，3D 打印技術的發展為解決這一問題提供了可能。前期研究中我們通過選擇性激光熔融（selective laser melting，SLM）技術成功制造了一組含銅元素的 Ti6Al4V-xCu（x=0wt%、2wt%、4wt%、6wt%）合金[20]。預實驗提示 Ti6Al4V-4Cu 合金對細胞毒性較小，且銅元素含量適當，故本研究選擇 Ti6Al4V-4Cu，觀察該材料對小鼠 BMSCs 及小鼠單核巨噬細胞系 RAW264.7 的影響，探討 Ti6Al4V-4Cu 合金的生物相容性及是否具有促進成骨發生的特性，以期探究銅元素在成骨材料中的應用，并制備一種具有免疫調節功能的骨科植入材料。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4 周齡雄性 C57 小鼠 5 只，體質量 10～15 g，由陸軍軍醫大學（原第三軍醫大學）實驗動物中心 提供。
小鼠單核巨噬細胞系 RAW264.7 購自中國科學院細胞庫。Ti6Al4V 粉末（飛而康快速制造科技有限責任公司）。L-DMEM 培養基、FBS、0.25% 胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；青霉素-鏈霉素溶液（上海碧云天生物技術公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；合肥 Biosharp 公司）；ELISA 酶聯免疫試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；RNAiso Plus 試劑盒、定量 PCR 試劑盒 TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）、逆轉錄試劑盒 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara 公司，日本）。SLM 3D 打印機（ Concept Laser GmbH 公司，德國）；掃描電鏡（Phenom-World 公司，荷蘭）；X 射線能譜分析（energy dispersive spectrometer，EDS）儀（Hitachi 公司，日本）。
1.2 3D 打印 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件的制備與材料表征
3D 打印 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件由中國科學院福建物質結構研究所提供。以 Ti6Al4V 粉末為原材料，通過 SLM 3D 打印機制備 Ti6Al4V 合金樣件（直徑 15 mm、厚度 1 mm）。然后采用交叉孵育技術，將 Ti6Al4V 粉末與純銅粉（99.99%）混合（銅粉質量比 4wt%），同法制備 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件（直徑 15 mm、高 1 mm）。兩種合金樣件各打印 12 個。取 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件，采用掃描電鏡觀察微觀結構，EDS 儀分析合金基體元素分布，確定是否成功制備。
用 2 000 目砂紙打磨材料樣件表面，以 SiO2-H2O2 溶液對樣件拋光后，用丙酮、75% 乙醇、無水乙醇、去離子水分別對樣件超聲清洗 30 min，烘干后采用高溫高壓對材料消毒滅菌以用于細胞實驗。
1.3 Ti6Al4V-4Cu 合金生物相容性及成骨性能檢測
1.3.1 小鼠 BMSCs 分離培養
將 5 只 4 周齡雄性 C57 小鼠脫頸處死，浸入 75% 乙醇溶液中消毒處理 5 min，于無菌環境中取出兩側股骨，去除表面軟組織后用 PBS 洗滌 3 次；剪去股骨干骺端與股骨頭，用 5 mL 注射器吸取含 10%FBS 與 1% 青霉素-鏈霉素溶液的 L-DMEM 培養基沖洗骨髓腔，將沖洗出的細胞混懸液加到 25 cm2培養皿，置于 37℃、5%CO2 細胞孵箱中孵育；24 h 后去掉未貼壁細胞，每 3 天換液 1 次，5～7 d 后傳代，經鑒定后選取第 3～8 代細胞用于實驗。
1.3.2 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液的制備
依照醫療器械生物學評價標準（GB/T 16886.12-2017/ISO 10993-12-2005），將滅菌后的 3D 打印 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件放入無菌 50 mL 離心管中，按照 3 cm2/mL 向離心管中加入無血清 L-DMEM 培養基，混勻后放入 37℃、5%CO2 細胞孵箱中，72 h 后收集浸提液，添加 10%FBS 及 1% 青霉素-鏈霉素溶液備用。
1.3.3 CCK-8 法檢測細胞增殖
將 BMSCs 以 2×103個/孔密度鋪于 96 孔板中，分為 3 組，每組設 3 個復孔。24 h 后棄原始培養基，分別更換培養基為含 10%FBS 及 1% 青霉素-鏈霉素溶液的 L-DMEM 培養基（A 組）、Ti6Al4V 合金浸提液（B 組）、Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液（C 組），每 3 天換液 1 次。分別于 1、3、5 d 依據 CCK-8 試劑盒說明書檢測各組細胞的增殖情況，以 450 nm 處檢測吸光度（A）值表示。
另外，取小鼠 RAW264.7 細胞以 2×103個/孔密度鋪于 96 孔板中，同上法分組培養后，于 1、2、3 d 檢測各組細胞增殖情況，以 450 nm 處 A 值表示。
1.3.4 實時熒光定量 PCR 檢測
① 對 BMSCs 成骨相關基因表達的影響：將 BMSCs 以 1×105個/孔密度鋪于 6 孔板中，分為 2 組，每組 3 個復孔。24 h 后棄原始培養基，分別加入含 Ti6Al4V 合金浸提液（A 組）與 Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液（B 組）的成骨誘導培養基（含 10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、1 mmol/L 維生素 C、0.1 mmol/L 地塞米松的 DMEM 培養基），置于 37℃、5% CO2 細胞孵箱中誘導培養 3 d。根據 Trizol 試劑盒說明書提取兩組 RNA，測定濃度后，按照逆轉錄試劑盒 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）說明書方法提取 cDNA；再以 SYBR 熒光定量法檢測成骨相關基因Ⅰ型膠原（collagen type Ⅰ，Col-Ⅰ）、ALP、Runx 家族轉錄因子 2（Runx family transcription factor 2，Runx-2）、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的 mRNA 表達，每組重復 3 次，取均值。② 對小鼠 RAW264.7 細胞炎癥相關基因表達的影響：將小鼠 RAW264.7 細胞以 1×105個/孔密度鋪于 6 孔板中，24 h 后同上法分組成骨誘導 1 d。采用相同方法檢測炎癥相關基因 IL-4、一氧化氮合成酶 2（nitric oxide synthase 2，iNOS）的 mRNA 表達，每組重復 3 次，取均值。以上均以 2–ΔΔCt值計算各目的基因相對表達量。相關引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表 1。
表1
實時熒光定量 PCR 各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for real-time fluorescent quantitative PCR
1.3.5 ELISA 法檢測小鼠 RAW264.7 細胞分泌的相關因子
將小鼠 RAW264.7 細胞以 1×105個/孔密度鋪于 6 孔板中，分為 2 組，每組 4 個復孔。24 h 后分別更換培養基為 Ti6Al4V 合金浸提液（A 組）與 Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液（B 組）。1 d 后收集培養基，以離心半徑 15.9 cm、1 500 r/min 離心 5 min，取上清，按照 ELISA 酶聯免疫試劑盒說明書檢測上清液中 VEGF-a 與 BMP-2 的含量。
1.3.6 RAW264.7 細胞條件培養基對 BMSCs 成骨相關基因表達的影響
將小鼠 RAW264.7 細胞以 1×105個/孔密度鋪于 6 孔板中，分為 2 組，每組 3 個復孔。24 h 后分別更換培養基為 Ti6Al4V 合金浸提液（A 組）與 Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液（B 組），1 d 后收集培養基，以離心半徑 15.9 cm、1 500 r/min 離心 5 min 后取上清，與 L-DMEM 成骨誘導培養基 1∶1 混合，分別制備 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 成骨條件培養基。將 BMSCs 以 1×105個/孔密度鋪于 6 孔板中，24 h 后分別更換為 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 成骨條件培養基，3 d 后同 1.3.4 方法檢測成骨相關基因 Col-Ⅰ、ALP、Runx-2、OPG、OPN 的 mRNA 相對表達量。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 3D 打印 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件的表征
通過 3D 打印制備的 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件外觀均呈金屬光澤，表面光滑，直徑 15 mm、厚度 1 mm，二者無明顯區別（圖 1a）。Ti6Al4V-4Cu 合金掃描電鏡觀察示，深灰色為針狀 α 相（密排六方結構），銀灰色為 β 相（體心立方結構），合金組織是以 β 相為基體，與針狀 α 相密集排列組成（圖 1b）。EDS 分析顯示，銅元素質量百分比為4.08%±0.83%，說明成功制備 Ti6Al4V-4Cu 合金（圖 1c）。
圖1
3D 打印 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金樣件表征
a. 材料外觀；b. 掃描電鏡觀察（×2 000）；c. EDS 分析
Figure1. Characterization of 3D printed Ti6Al4V and Ti6Al4V-4Cu alloy samplesa. Material appearance; b. Scanning electron microscope observation (×2 000); c. Energy dispersive spectrometer analysis
2.2 Ti6Al4V-4Cu 合金生物相容性及成骨性能檢測
2.2.1 CCK-8 法檢測細胞增殖
① 浸提液對 BMSCs 的影響：第 1 天，B、C 組 A 值顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。第 3、5 天，各組間 A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。② 浸提液對 RAW264.7 細胞的影響：除第 1、2 天，B 組 A 值顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）外，其余各時間點各組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
CCK-8 法檢測細胞增殖
a. 浸提液對 BMSCs 的影響；b. 浸提液對 RAW264.7 細胞的影響
Figure2. Detection of cell proliferation by CCK-8 methoda. Effect of extract on BMSCs; b. Effect of extract on RAW264.7 cells
2.2.2 實時熒光定量 PCR 檢測
① 對 BMSCs 成骨相關基因表達的影響：除 B 組 OPG mRNA 相對表達量顯著高于 A 組，差異有統計學意義（t=9.168，P=0.001）外，兩組 Col-Ⅰ、ALP、Runx-2、OPN mRNA 相對表達量比較差異均無統計學意義（P>0.05）。② 對小鼠 RAW264.7 細胞炎癥相關基因表達的影響：與 A 組比較，B 組 IL-4 mRNA 相對表達量明顯增加，iNOS mRNA 相對表達量明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
實時熒光定量 PCR 檢測成骨及炎癥相關基因表達
a. 對 BMSCs 成骨相關基因表達的影響；b. 對小鼠 RAW264.7 細胞炎癥相關基因表達的影響
Figure3. Detection of osteogenesis- and inflammation-related genes expression by real-time fluorescence quantitative PCRa. Effect on the expression of osteogenesis-related genes in BMSCs; b. Effect on the expression of inflammation-related genes in mouse RAW264.7 cells
2.2.3 ELISA 法檢測小鼠 RAW264.7 細胞分泌的相關因子
B 組上清液中 VEGF-a 與 BMP-2 的含量分別為（11.169±0.984）ng/L、（0.163±0.063）μg/L，顯著高于 A 組的（9.070±0.518）ng/L、（0.070±0.013）μg/L，差異均有統計學意義（t=3.269，P=0.017；t=2.506，P=0.046）。
2.2.4 RAW264.7 細胞條件培養基對 BMSCs 成骨相關基因表達的影響
B 組 BMSCs 成骨相關基因 Col-Ⅰ、ALP、Runx-2、OPG、OPN mRNA 相對表達量均顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
實時熒光定量 PCR 檢測 RAW264.7 條件培養基對 BMSCs 成骨相關基因表達的影響
Figure4.
Real-time fluorescence quantitative PCR to detect the effect of RAW264.7 conditioned medium on expression of osteogenesis-related genes in BMSCs
3 討論
近年來，許多研究報道了生物材料具有良好的骨誘導作用[21-24]，但具體作用機制仍未明確[25]。生物材料在體內外的差異表現，使得人們越來越關注體內的免疫調節機制研究[26]。骨生物材料植入后，免疫細胞通常首先產生應答反應[27]，由此形成免疫微環境，在組織修復與再生中起著核心作用[11]。巨噬細胞作為調節免疫微環境最重要的細胞之一，在骨形成中也發揮著重要作用[28]，這為研究者們開發具有骨免疫調節作用的材料奠定了理論基礎[12]。Liu 等[29]為聚醚醚酮材料制備鋅涂層，Shi 等[30]將銅離子摻入二氧化硅納米球中，Zhang 等[31]制備了摻鋅的納米涂層，Zhang 等[32]制備了含有 β-磷酸鈣涂層的鎂支架，均是利用了金屬元素調節巨噬細胞，營造一個適當的免疫微環境，從而促進成骨發生。Honda 等[33]研究也驗證了當細胞外鈣離子濃度達 14 mmol/L 時可促進小鼠巨噬細胞 J774A.1 分泌 BMP-2，從而促進成骨發生。此外，動物實驗也證明，沒有巨噬細胞的及時參與，骨折無法修復[26]。這些都說明了巨噬細胞在成骨發生中具有重要作用，然而如何利用巨噬細胞的可塑性達到促成骨發生目的，將是未來開發新型骨科材料的方向。
我們認為銅離子可以通過調節巨噬細胞從而影響成骨發生，因此本研究通過 3D 打印制備了 Ti6Al4V 及 Ti6Al4V-4Cu 合金，觀測 Ti6Al4V-4Cu 合金中銅離子對小鼠 BMSCs 與小鼠 RAW264.7 細胞增殖的影響，確定了 Ti6Al4V-4Cu 合金對細胞無毒性作用。其次，通過 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液分別與小鼠 RAW264.7 細胞共培養 24 h 后，觀測到銅離子可增強抗炎因子 IL-4 的表達，減少炎癥因子 iNOS 的表達，從而減少了炎癥發生，營造了一個良好的免疫微環境；同時，我們從兩種培養上清液中均檢測出巨噬細胞分泌的 BMP-2 和 VEGF-a，且 Ti6Al4V-4Cu 合金組含量較高。另外，我們將 Ti6Al4V 與 Ti6Al4V-4Cu 合金浸提液分別與小鼠 BMSCs 共培養 3 d，檢測成骨相關基因的表達，發現相比于 Ti6Al4V，Ti6Al4V-4Cu 促進了 OPG mRNA 表達，但 Col-Ⅰ、ALP、Runx-2、OPN mRNA 的表達卻無明顯差異。然而，將培養基換為 RAW264.7 細胞條件培養基，分別與小鼠 BMSCs 共培養 3 d 后發現，Ti6Al4V-4Cu 組各成骨相關基因表達均顯著增加。結合前期檢測結果顯示，條件培養基中有巨噬細胞分泌的 BMP-2 和 VEGF-a，而且有文獻報道巨噬細胞可以通過分泌 BMP-2[33-35]和 VEGF-a[36]促進成骨發生，因此我們認為銅離子可以降低小鼠 RAW264.7 細胞向炎癥方向極化的可能，同時促進細胞分泌 BMP-2 和 VEGF-a，從而通過免疫調節營造一個良好的成骨微環境，促進成骨發生（圖 5），為金屬假體的應用提供了理論依據。同時，也有研究表明銅具有模擬缺氧的能力[30]，從而促進血管生成。Zhang 等[37]在磷酸鈣骨水泥材料中引入銅離子，使其兼具成骨和成血管功能。究其原因，Weng 等[38]認為銅離子以劑量依賴方式促進內皮細胞增殖；Li 等[39]的研究表明銅離子是通過缺氧誘導因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）通路增強 VEGF-a 的表達，從而增強血管生成；Rigiracciolo 等[40]在對乳腺癌的研究中發現，銅離子劑量依賴性誘導 HIF-1α 和 VEGF-a 基因表達，而施以銅離子螯合劑時，又抑制了乳腺癌中血管的生成。因此，銅離子在促血管生成方面具有很大潛力，是生物材料中比較有前景的添加劑，當然本實驗所用 Ti6Al4V-4Cu 合金是否也具有促血管生成的能力，有待進一步研究。
圖5
銅離子通過骨免疫調節促進成骨發生的機制
Figure5.
Mechanism of copper ion promoting osteogenesis through bone immunomodulation
綜上述，與不含銅的 Ti6Al4V 合金相比，銅離子能夠賦予材料良好的免疫調節性能，通過改變巨噬細胞炎癥表型，促使其分泌 BMP-2 和 VEGF-a，從而促進成骨發生。本研究為了解生物材料誘導成骨發生的機制奠定了基礎，為骨誘導材料的設計及研究提供了新的策略。下一步我們將繼續完善該材料在成血管及動物體內的相關研究，進一步探究成骨發生機制。
作者貢獻：張臣科參與實驗設計與實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；盧衍錦參與 Ti6Al4V 和 Ti6Al4V-4Cu 材料的設計制備及成分分析；郭宇鵬參與實驗設計及文章內容審閱；陳萬參與實驗設計；唐紅、李懷勝參與部分實驗的實施；唐康來負責文章審閱；何清義參與實驗設計、數據分析及對文章內容進行批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：所有動物實驗均經中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物福利倫理審查委員會批準（AMUWEC2018602）。實驗動物生產許可證號：SCXK（渝）20170002，使用許可證號：SYXK（渝）2017002。
