引用本文： 黃成龍, 趙松, 程飚, 陳剛, 潘界恩. 微骨折技術聯合仿生水凝膠支架促進兔肩袖腱-骨愈合的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(9): 1177-1183. doi: 10.7507/1002-1892.202001029 復制
隨著手術技術和材料的不斷進步，肩袖損傷修補術的臨床療效已顯著提高，但仍有 13%～43% 患者術后發生再撕裂[1]，分析原因為術后肩袖是通過在腱-骨界面形成瘢痕組織實現愈合，缺乏正常的多層過渡結構，無法有效傳遞載荷，容易發生再撕裂[2]。為此，國內外學者們希望通過添加生長因子、干細胞以及采用生物材料、生物補片等技術來促進腱-骨愈合[3-4]。研究表明，將生物材料和細胞共培養可以構建正常腱-骨結構[5]，但細胞在體外培養存在污染、活性降低等風險[6]。生長因子等生物活性物質可以誘導和促進細胞生長和分化，有效促進腱-骨愈合，但存在半衰期短、容易降解等不足，而且無法精確調控最佳劑量[7]。生物補片雖然能加強修補肩袖，而且制備工藝也在不斷完善，但存在免疫反應導致的排斥反應，失敗率仍超過 30%[8]。利用靜電紡絲技術制備人工補片具有臨床應用潛力，但目前仍處于研究階段[9-10]。
BMSCs 具有多向分化潛能，是目前研究最多的干細胞之一[8]。微骨折是目前臨床上修復軟骨損傷的常用方法之一，通過微骨折處理可以招募 BMSCs 進入損傷部位，參與組織修復。有研究應用肩袖止點骨床微骨折技術，使 BMSCs 向止點骨床遷移，促進肌腱纖維的修復和腱-骨愈合[11]。但是，因為缺乏合適的載體，微骨折過程中產生的 BMSCs 會流失到周圍組織，所以需要具有合適孔隙的支架材料用于富集干細胞，提高局部干細胞濃度，從而促進組織修復[12-13]。明膠是Ⅰ型膠原變性水解后的蛋白質產物，具有良好的生物降解性和組織相容性，以及成本低、易獲得、降解后無毒性等優點，同時還保留了膠原蛋白的細胞黏附特性，能夠負載細胞和生物活性物質，是制備組織工程支架的理想材料[14-15]。本實驗以明膠為主要原料構建仿生水凝膠支架，用其富集肩袖止點骨床微骨折產生的 BMSCs，觀察微骨折技術聯合仿生水凝膠支架對兔肩袖腱-骨愈合的影響。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
24 只成年新西蘭大白兔，雌雄不限，體質量 2.8～3.5 kg，由上海市松江區松聯實驗動物場提供。明膠、甲基丙烯酸酐、光引發劑 Irgacure2959（Sigma 公司，美國）；2-0 醫用滌綸編織線（上海浦東金環醫療用品股份有限公司）；2 號 Orthocord 縫線（強生公司，美國）；HE 染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）。冷凍干燥機（蘇州賽恩斯儀器有限公司）；掃描電鏡（TESCAN 公司，捷克）；Micro-CT（通用公司，美國）；生物力學測試機（Instron 公司，美國）。
1.2 仿生水凝膠支架的制備及觀測
1.2.1 支架制備方法
取 20 g 明膠加入 100 mL PBS 緩沖液，50℃ 恒溫水浴中攪拌至溶解；取 16 mL 甲基丙烯酸酐，以 0.5 mL/min 速度滴加至上述溶液，50℃ 恒溫搖床中震蕩反應 1 h；加入 500 mL PBS 緩沖液，不斷攪拌以終止反應。置入透析袋 [透析分子量 （12～14）×103] 中，于去離子水中透析 1 周；將透析后的溶液以離心半徑 15 cm，3 000 r/min 離心 10 min；取上清液，置于?20℃ 冰箱中過夜，冷凍干燥機中冷凍干燥，得到甲基丙烯酰胺基明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）備用 [15-16]。配置 0.25wt% Irgacure2959 水溶液 10 mL，取凍干后的 GelMA 加入溶液中攪拌溶解，獲得濃度為 5wt% 的 GelMA 單體預聚溶液，轉移至培養皿中，用波長 320～500 nm、光強 1.44 W/cm2的紫外光照射 2 min，置于?20℃ 冰箱中過夜，冷凍干燥機冷凍干燥后經 60Co 輻照滅菌，獲得仿生水凝膠支架。
1.2.2 觀測指標
① 大體及微觀結構觀察：大體觀察仿生水凝膠支架顏色、性狀后，將其修剪成合適大小，使用碳粉導電膠黏貼于樣品托上，噴金處理后，掃描電鏡下觀察微觀形貌。
② 體外降解性能測試：取凍干的仿生水凝膠支架，稱量其初始質量（W0）后，浸泡于含有 10 mL PBS 溶液的離心管中，置于 37℃ 恒溫水浴搖床中，設置降解時間點為 3、6、9、12、15、18 d，每個時間點放置 6 個樣本。取各時間點降解后的仿生水凝膠支架，凍干后再次稱重（Wt），計算降解率，公式為（W0-Wt）/W0×100%，觀察支架降解情況。
1.3 實驗分組及方法
取 24 只新西蘭大白兔制作雙前肢急性肩袖損傷模型后，肩袖止點骨床行微骨折處理；同一只兔隨機在一側肩袖與止點骨床上植入仿生水凝膠支架（實驗組），另一側不植入支架（對照組）。
具體操作步驟：實驗動物經耳緣靜脈推注 3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后側臥位固定，沿肱骨大結節外側作長約 2 cm 正中切口，逐層分離皮下組織；沿三角肌纖維走行方向鈍性分離三角肌，向兩側牽開，顯露岡上肌肌腱及其止點；在止點處全層切斷岡上肌肌腱，用刀片刮除肌腱止點足印區軟骨，用直徑 0.8 mm 克氏針在骨床上鉆 4 個 3 mm 深的孔。實驗組：將仿生水凝膠支架修剪成合適大小，覆蓋在微骨折處理后的骨床上，使用 2-0 醫用滌綸編織線將岡上肌肌腱采用穿骨固定方式固定于止點骨床上，可吸收縫線依次縫合深筋膜、淺筋膜及皮膚，適當加壓包扎；對照組不植入支架，按照實驗組方法直接縫合肌腱及切口。見圖 1。
圖1
實驗組動物模型制備示意圖
a. 急性肩袖損傷；b. 微骨折處理；c. 植入仿生水凝膠支架；d. 穿骨固定縫合肩袖
Figure1. Establishment of the experimental rabbit modela. Acute rotator cuff tear; b. Microfracture on the foot print; c. Implantation of biomimetic hydrogel scaffold; d. Rotator cuff was repaired by transosseous suture
術后即刻以及第 1 天，每只動物肌肉注射 80 萬 U 青霉素預防感染；正常飼養，允許自由活動。術后 4、8 周各取 12 只動物，采用空氣栓塞法處死。按原切口入路行大體觀察后，完整切取岡上肌肌腱-肱骨復合體。其中 6 只標本行生物力學測試，其余 6 只行 Micro-CT 檢查及組織學觀察。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
觀察兩組動物術后存活情況、切口愈合及肢體運動情況。
1.4.2 大體觀察
肉眼觀察岡上肌萎縮及腱-骨界面愈合情況。
1.4.3 Micro-CT 檢測
取標本采用 Micro-CT 評價肌腱止點骨床骨密度（bone mineral density，BMD）及骨發生情況，掃描參數：80 kV、450 mA，在腱-骨界面連接處選取一個直徑 6 mm、高 5 mm 的圓柱形區域作為感興趣區域。測量該區域 BMD、組織骨密度（tissue mineral density，TMD）和骨體積分數（bone volume/total volume，BV/TV）。
1.4.4 組織學觀察
標本置于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h 后，置于 0.25 mol/L EDTA 緩沖液中完全脫鈣，石蠟包埋；于岡上肌及大結節矢狀面平行方向切片，片厚 5 μm，常規 HE 染色。光鏡下觀察腱-骨愈合情況，并根據 Ide 等[17]的肌腱成熟度評分表，半定量評估肌腱在腱-骨止點處成熟度。
1.4.5 生物力學測定
切除標本肱骨上附著的軟組織，只保留岡上肌，剪斷大結節外側固定岡上肌肌腱線結。標本固定于生物力學測試機，骨端用定制夾具固定，肌腱端用 2 號 Orthocord 縫線編織后與載荷單元連接，維持岡上肌-肱骨外展 135°、前屈 165° 位。先加載 5 N 前負荷，使岡上肌肌腱保持適當張力。加載負荷區間為 5～30 N，固定往復位移 1 mm，頻率 0.25 Hz，循環牽拉 40 次，對岡上肌肌腱行應力松解。然后以 1 mm/s 速度牽拉岡上肌肌腱至斷裂，記錄拉斷時極限負荷和整個過程中負荷及位移變化，繪制負荷-應力曲線并計算剛度。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用配對 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 仿生水凝膠支架觀測
仿生水凝膠支架外觀呈白色，厚度約 1 mm。掃描電鏡觀察顯示，仿生水凝膠支架具有豐富多孔結構，孔徑為 31.7～89.9 μm，平均 60.2 μm。支架置于 PBS 溶液后緩慢降解，9 d 時降解率約為 48%，15 d 時約為 83%，18 d 時約為 95%。見圖 2。
圖2
仿生水凝膠支架觀測
a. 大體觀察；b. 掃描電鏡觀察（×500）；c. 支架降解率
Figure2. Observation of biomimetic hydrogel scaffolda. Gross observation; b. Scanning electron microscope observation (×500); c. Degradation rate of the scaffold
2.2 一般情況
術后動物均存活至實驗完成，恢復正常肢體活動。切口愈合良好，無感染發生。
2.3 大體觀察
術后 4、8 周，兩組標本岡上肌無萎縮，岡上肌肌腱與止點骨床愈合良好，腱-骨連接部界限不明顯，未見明顯缺損和再撕裂。兩組組內 4、8 周觀察情況無明顯差異。見圖 3。
圖3
術后各時間點兩組大體觀察
a. 對照組術后 4 周；b. 實驗組術后 4 周；c. 對照組術后 8 周；d. 實驗組術后 8 周
Figure3. Gross observation of tendon-to-bone healing in both groups at each time point after operationa. Control group at 4 weeks; b. Experimental group at 4 weeks; c. Control group at 8 weeks; d. Experimental group at 8 weeks
2.4 Micro-CT 檢測
術后 4、8 周，兩組肌腱止點骨床未見明顯差異。見圖 4。術后 4、8 周兩組 TMD、BMD 和 BV/TV 差異均無統計學意義（P>0.05）；對照組組內術后 4、8 周 BV/TV 差異有統計學意義（t=5.413，P=0.003），兩組組內其他指標 4、8 周間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點兩組 Micro-CT 檢測結果（n=6，
）
Table1.
Micro-CT analysis in both groups at each time point after operation (n=6, 
)
圖4
術后各時間點兩組 Micro-CT 觀察
a. 對照組術后 4 周；b. 實驗組術后 4 周；c. 對照組術后 8 周；d. 實驗組術后 8 周
Figure4. Micro-CT images of both groups at each time point after operationa. Control group at 4 weeks; b. Experimental group at 4 weeks; c. Control group at 8 weeks; d. Experimental group at 8 weeks
2.5 組織學觀察
術后 4 周，對照組腱-骨界面以纖維瘢痕為主，界面間無明顯間隙，肌腱纖維排列大致正常；實驗組腱-骨界面部分區域可見礦化軟骨和少量纖維軟骨形成，排列紊亂，界面間無明顯間隙，無支架殘留、炎癥反應和肉芽組織形成，肌腱纖維排列大致正常。術后 8 周，對照組腱-骨界面仍以纖維瘢痕為主，局部可見少量軟骨，肌腱纖維排列正常；實驗組腱-骨界面部分區域可見礦化軟骨和纖維軟骨有序排列成過渡結構，界面間無明顯間隙，肌腱纖維排列正常。見圖 5。
圖5
術后各時間點兩組 HE 染色觀察（×100）
B 表示骨組織，I 表示腱-骨界面，T 表示肌腱 a. 對照組術后 4 周；b. 實驗組術后4 周；c. 對照組術后 8 周；d. 實驗組術后 8 周
Figure5. HE staining of both groups at each time point after operation (×100)B indicated bone, I indicated tendon-to-bone interface, T indicated tendon a. Control group at 4 weeks; b. Experimental group at 4 weeks; c. Control group at 8 weeks; d. Experimental group at 8 weeks
對照組和實驗組術后 4 周肌腱成熟度評分分別為（12.5±1.0）、（16.8±0.8）分，術后 8 周分別為（16.2±0.8）、（23.0±1.1）分。術后 4、8 周，實驗組肌腱成熟度評分均優于對照組，差異有統計學意義（t=6.500，P=0.001；t=10.448，P=0.000）。 對照組和實驗組組內術后 4、8 周肌腱成熟度評分，差異均有統計學意義（t=7.416，P=0.001；t=12.921，P=0.000）。
2.6 生物力學測定
兩組標本均于腱-骨界面處拉斷。術后 4 周對照組和實驗組極限負荷、剛度差異均無統計學意義（P>0.05）；術后 8 周實驗組極限負荷明顯優于對照組，差異有統計學意義（t=4.162，P=0.009），剛度比較差異無統計學意義（t=2.286，P=0.071）。兩組組內術后 8 周極限負荷及剛度均優于 4 周，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
術后各時間點兩組生物力學測定結果（n=6，
）
Table2.
Biomechanical test in both groups at each time point after operation (n=6, 
)
3 討論
正常肩袖腱-骨界面由肌腱、纖維軟骨、礦化軟骨和骨組織四層逐漸過渡結構形成，而肩袖修補術后腱-骨界面的多層過渡結構被瘢痕替代，導致肩袖力學性能減弱，存在再斷裂可能。通過組織工程方法改變腱-骨界面愈合方式，重建正常腱-骨止點結構，是提高肩袖修補術療效的重要研究方向，近年相關研究對于種子細胞及生物材料的選擇、支架的設計、生長因子的應用等方面進行了深入探討[18]。
BMSCs、脂肪干細胞、滑囊干細胞、肌腱干細胞、骨膜干細胞等干細胞具有多向分化潛能，可以促進腱-骨止點的修復。但作為種子細胞，脂肪干細胞存在更新能力差、定向誘導機制仍不明確等不足；滑囊干細胞需要在體外分離和培養，目前仍處于研究早期；肌腱干細胞存在含量少、分離和純化困難等問題；骨膜干細胞數量較少，限制了其在肩袖修復中的應用[19]。而 BMSCs 是目前研究應用最多的干細胞，具有多向分化特性、分泌生物活性分子、提供再生微環境等優勢，是一種具有應用前景的組織工程種子細胞[20]。但目前干細胞技術面臨程序耗時、細胞來源缺乏、分化調節不確定、宿主可能發生免疫反應、難以儲存和運輸等問題，增加了臨床轉化的難度[21]。為了便于臨床應用，需要簡便快速的方法來獲取 BMSCs。微骨折技術是目前臨床上獲得 BMSCs 的有效途徑之一，可用于關節軟骨缺損的修復和促進肩袖腱-骨愈合[11-12]，手術過程中直接在肩袖止點骨床上鉆孔，無需通過額外侵襲性手術來獲取種子細胞，未明顯增加手術創傷和延長手術時間，很好地解決了干細胞來源問題。Kida 等[22]發現在大結節骨床鉆孔可以讓 BMSCs 從骨髓中滲透，參與肩袖修復，促進肩袖愈合。Bilsel 等[11]通過慢性肩袖損傷動物模型，研究微骨折技術對肩袖愈合的影響。生物力學和組織學觀察結果顯示，微骨折技術能夠促進腱-骨愈合。Milano 等[23]報道了關節鏡下肩袖修補術中應用微骨折技術的療效，對于涉及岡上肌和岡下肌的大肩袖撕裂，微骨折組的治愈率顯著提高。Snyder 等[24]認為通過微骨折技術能夠在肩袖止點骨床區域形成富含 BMSCs、生長因子和促血管生成因子的纖維蛋白凝塊，誘導細胞遷移和增殖，促進腱-骨愈合。
除了干細胞，組織工程支架也是促進腱-骨愈合的有效途徑之一。BMSCs 與組織工程支架的聯合應用能夠更好地修復肩袖損傷[25]。理想的組織工程支架降解速率應與組織形成速率匹配，同時具有適合細胞生長和營養物質交換的三維結構[26-27]。利用冷凍干燥法可以制備具有合適孔徑、孔隙相對均勻、連通性好的多孔支架，還能避免支架表面生物活性分子的破壞[26]。本研究選擇該方法制備了仿生水凝膠支架，掃描電鏡觀察顯示獲得的支架具有豐富的多孔結構，平均孔徑為 60.2 μm，這種大小的孔徑有利于細胞穿透和骨軟骨的形成[28]。體外降解性能測試顯示，支架 9 d 時降解率約為 48%，15 d 時約為 83%。而肩袖修補術后愈合過程可以分成炎癥反應期（0～7 d）、修復期（5～14 d）和重塑期（>14 d）3 個階段[29]，結合體外降解實驗結果，本研究制備的仿生水凝膠支架降解速率能夠滿足腱-骨界面修復的需求，不會阻礙腱-骨愈合。
本研究 Micro-CT 檢測未發現仿生水凝膠支架對腱-骨界面新骨形成有促進作用，但組織學觀察提示術后 4 周實驗組腱-骨界面部分區域有少量軟骨組織，未見支架殘留和炎癥反應，進一步說明制備的仿生水凝膠支架降解速率能滿足腱-骨界面修復的要求，同時具有良好的組織相容性，而且隨著時間的推移，實驗組軟骨排列更加有序。生物力學測試結果表明，術后 8 周實驗組極限負荷明顯大于對照組，說明實驗組腱-骨結構抗拉性能優于對照組。Dai 等[30]用制備的多孔纖維蛋白支架修復兔軟骨缺損，在不添加外源性細胞的前提下，實現了原位軟骨修復。Sofu 等[31]運用微骨折技術聯合透明質酸支架修復膝關節軟骨缺損，結果顯示與單純微骨折處理相比，聯合使用透明質酸支架能更好地促進軟骨修復，取得更好療效。本研究結果也表明，與單純微骨折處理相比，微骨折技術聯合仿生水凝膠支架能夠更好地促進腱-骨界面多層結構的修復。
綜上述，仿生水凝膠支架具有較好的理化性質和組織相容性，與微骨折技術聯合使用，可以更好地促進肩袖腱-骨愈合，增強腱-骨界面抗拉性能，有望用于肩袖損傷的再生與修復。但本研究還存在一些不足，如未進行體外細胞實驗，未設置假手術組和單純切斷縫合對照組、標本數量偏少，由于動物肩關節解剖結構和運動特點，無法完全模擬人肩袖損傷及愈合過程。另外，由于本研究使用的是急性肩袖損傷模型，仿生水凝膠支架對慢性肩袖損傷的修復作用有待進一步研究。
作者貢獻：程飚、趙松負責整體科研設計；黃成龍負責實驗實施、數據收集整理、統計分析及文章撰寫；陳剛和潘界恩參與實驗實施。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經嘉興學院附屬第二醫院醫學倫理委員會批準（jxey-2020SZ048）。實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0008，使用許可證號：SYXK（滬）2016-0020。
隨著手術技術和材料的不斷進步，肩袖損傷修補術的臨床療效已顯著提高，但仍有 13%～43% 患者術后發生再撕裂[1]，分析原因為術后肩袖是通過在腱-骨界面形成瘢痕組織實現愈合，缺乏正常的多層過渡結構，無法有效傳遞載荷，容易發生再撕裂[2]。為此，國內外學者們希望通過添加生長因子、干細胞以及采用生物材料、生物補片等技術來促進腱-骨愈合[3-4]。研究表明，將生物材料和細胞共培養可以構建正常腱-骨結構[5]，但細胞在體外培養存在污染、活性降低等風險[6]。生長因子等生物活性物質可以誘導和促進細胞生長和分化，有效促進腱-骨愈合，但存在半衰期短、容易降解等不足，而且無法精確調控最佳劑量[7]。生物補片雖然能加強修補肩袖，而且制備工藝也在不斷完善，但存在免疫反應導致的排斥反應，失敗率仍超過 30%[8]。利用靜電紡絲技術制備人工補片具有臨床應用潛力，但目前仍處于研究階段[9-10]。
BMSCs 具有多向分化潛能，是目前研究最多的干細胞之一[8]。微骨折是目前臨床上修復軟骨損傷的常用方法之一，通過微骨折處理可以招募 BMSCs 進入損傷部位，參與組織修復。有研究應用肩袖止點骨床微骨折技術，使 BMSCs 向止點骨床遷移，促進肌腱纖維的修復和腱-骨愈合[11]。但是，因為缺乏合適的載體，微骨折過程中產生的 BMSCs 會流失到周圍組織，所以需要具有合適孔隙的支架材料用于富集干細胞，提高局部干細胞濃度，從而促進組織修復[12-13]。明膠是Ⅰ型膠原變性水解后的蛋白質產物，具有良好的生物降解性和組織相容性，以及成本低、易獲得、降解后無毒性等優點，同時還保留了膠原蛋白的細胞黏附特性，能夠負載細胞和生物活性物質，是制備組織工程支架的理想材料[14-15]。本實驗以明膠為主要原料構建仿生水凝膠支架，用其富集肩袖止點骨床微骨折產生的 BMSCs，觀察微骨折技術聯合仿生水凝膠支架對兔肩袖腱-骨愈合的影響。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
24 只成年新西蘭大白兔，雌雄不限，體質量 2.8～3.5 kg，由上海市松江區松聯實驗動物場提供。明膠、甲基丙烯酸酐、光引發劑 Irgacure2959（Sigma 公司，美國）；2-0 醫用滌綸編織線（上海浦東金環醫療用品股份有限公司）；2 號 Orthocord 縫線（強生公司，美國）；HE 染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）。冷凍干燥機（蘇州賽恩斯儀器有限公司）；掃描電鏡（TESCAN 公司，捷克）；Micro-CT（通用公司，美國）；生物力學測試機（Instron 公司，美國）。
1.2 仿生水凝膠支架的制備及觀測
1.2.1 支架制備方法
取 20 g 明膠加入 100 mL PBS 緩沖液，50℃ 恒溫水浴中攪拌至溶解；取 16 mL 甲基丙烯酸酐，以 0.5 mL/min 速度滴加至上述溶液，50℃ 恒溫搖床中震蕩反應 1 h；加入 500 mL PBS 緩沖液，不斷攪拌以終止反應。置入透析袋 [透析分子量 （12～14）×103] 中，于去離子水中透析 1 周；將透析后的溶液以離心半徑 15 cm，3 000 r/min 離心 10 min；取上清液，置于?20℃ 冰箱中過夜，冷凍干燥機中冷凍干燥，得到甲基丙烯酰胺基明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）備用 [15-16]。配置 0.25wt% Irgacure2959 水溶液 10 mL，取凍干后的 GelMA 加入溶液中攪拌溶解，獲得濃度為 5wt% 的 GelMA 單體預聚溶液，轉移至培養皿中，用波長 320～500 nm、光強 1.44 W/cm2的紫外光照射 2 min，置于?20℃ 冰箱中過夜，冷凍干燥機冷凍干燥后經 60Co 輻照滅菌，獲得仿生水凝膠支架。
1.2.2 觀測指標
① 大體及微觀結構觀察：大體觀察仿生水凝膠支架顏色、性狀后，將其修剪成合適大小，使用碳粉導電膠黏貼于樣品托上，噴金處理后，掃描電鏡下觀察微觀形貌。
② 體外降解性能測試：取凍干的仿生水凝膠支架，稱量其初始質量（W0）后，浸泡于含有 10 mL PBS 溶液的離心管中，置于 37℃ 恒溫水浴搖床中，設置降解時間點為 3、6、9、12、15、18 d，每個時間點放置 6 個樣本。取各時間點降解后的仿生水凝膠支架，凍干后再次稱重（Wt），計算降解率，公式為（W0-Wt）/W0×100%，觀察支架降解情況。
1.3 實驗分組及方法
取 24 只新西蘭大白兔制作雙前肢急性肩袖損傷模型后，肩袖止點骨床行微骨折處理；同一只兔隨機在一側肩袖與止點骨床上植入仿生水凝膠支架（實驗組），另一側不植入支架（對照組）。
具體操作步驟：實驗動物經耳緣靜脈推注 3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后側臥位固定，沿肱骨大結節外側作長約 2 cm 正中切口，逐層分離皮下組織；沿三角肌纖維走行方向鈍性分離三角肌，向兩側牽開，顯露岡上肌肌腱及其止點；在止點處全層切斷岡上肌肌腱，用刀片刮除肌腱止點足印區軟骨，用直徑 0.8 mm 克氏針在骨床上鉆 4 個 3 mm 深的孔。實驗組：將仿生水凝膠支架修剪成合適大小，覆蓋在微骨折處理后的骨床上，使用 2-0 醫用滌綸編織線將岡上肌肌腱采用穿骨固定方式固定于止點骨床上，可吸收縫線依次縫合深筋膜、淺筋膜及皮膚，適當加壓包扎；對照組不植入支架，按照實驗組方法直接縫合肌腱及切口。見圖 1。
圖1
實驗組動物模型制備示意圖
a. 急性肩袖損傷；b. 微骨折處理；c. 植入仿生水凝膠支架；d. 穿骨固定縫合肩袖
Figure1. Establishment of the experimental rabbit modela. Acute rotator cuff tear; b. Microfracture on the foot print; c. Implantation of biomimetic hydrogel scaffold; d. Rotator cuff was repaired by transosseous suture
術后即刻以及第 1 天，每只動物肌肉注射 80 萬 U 青霉素預防感染；正常飼養，允許自由活動。術后 4、8 周各取 12 只動物，采用空氣栓塞法處死。按原切口入路行大體觀察后，完整切取岡上肌肌腱-肱骨復合體。其中 6 只標本行生物力學測試，其余 6 只行 Micro-CT 檢查及組織學觀察。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
觀察兩組動物術后存活情況、切口愈合及肢體運動情況。
1.4.2 大體觀察
肉眼觀察岡上肌萎縮及腱-骨界面愈合情況。
1.4.3 Micro-CT 檢測
取標本采用 Micro-CT 評價肌腱止點骨床骨密度（bone mineral density，BMD）及骨發生情況，掃描參數：80 kV、450 mA，在腱-骨界面連接處選取一個直徑 6 mm、高 5 mm 的圓柱形區域作為感興趣區域。測量該區域 BMD、組織骨密度（tissue mineral density，TMD）和骨體積分數（bone volume/total volume，BV/TV）。
1.4.4 組織學觀察
標本置于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h 后，置于 0.25 mol/L EDTA 緩沖液中完全脫鈣，石蠟包埋；于岡上肌及大結節矢狀面平行方向切片，片厚 5 μm，常規 HE 染色。光鏡下觀察腱-骨愈合情況，并根據 Ide 等[17]的肌腱成熟度評分表，半定量評估肌腱在腱-骨止點處成熟度。
1.4.5 生物力學測定
切除標本肱骨上附著的軟組織，只保留岡上肌，剪斷大結節外側固定岡上肌肌腱線結。標本固定于生物力學測試機，骨端用定制夾具固定，肌腱端用 2 號 Orthocord 縫線編織后與載荷單元連接，維持岡上肌-肱骨外展 135°、前屈 165° 位。先加載 5 N 前負荷，使岡上肌肌腱保持適當張力。加載負荷區間為 5～30 N，固定往復位移 1 mm，頻率 0.25 Hz，循環牽拉 40 次，對岡上肌肌腱行應力松解。然后以 1 mm/s 速度牽拉岡上肌肌腱至斷裂，記錄拉斷時極限負荷和整個過程中負荷及位移變化，繪制負荷-應力曲線并計算剛度。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用配對 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 仿生水凝膠支架觀測
仿生水凝膠支架外觀呈白色，厚度約 1 mm。掃描電鏡觀察顯示，仿生水凝膠支架具有豐富多孔結構，孔徑為 31.7～89.9 μm，平均 60.2 μm。支架置于 PBS 溶液后緩慢降解，9 d 時降解率約為 48%，15 d 時約為 83%，18 d 時約為 95%。見圖 2。
圖2
仿生水凝膠支架觀測
a. 大體觀察；b. 掃描電鏡觀察（×500）；c. 支架降解率
Figure2. Observation of biomimetic hydrogel scaffolda. Gross observation; b. Scanning electron microscope observation (×500); c. Degradation rate of the scaffold
2.2 一般情況
術后動物均存活至實驗完成，恢復正常肢體活動。切口愈合良好，無感染發生。
2.3 大體觀察
術后 4、8 周，兩組標本岡上肌無萎縮，岡上肌肌腱與止點骨床愈合良好，腱-骨連接部界限不明顯，未見明顯缺損和再撕裂。兩組組內 4、8 周觀察情況無明顯差異。見圖 3。
圖3
術后各時間點兩組大體觀察
a. 對照組術后 4 周；b. 實驗組術后 4 周；c. 對照組術后 8 周；d. 實驗組術后 8 周
Figure3. Gross observation of tendon-to-bone healing in both groups at each time point after operationa. Control group at 4 weeks; b. Experimental group at 4 weeks; c. Control group at 8 weeks; d. Experimental group at 8 weeks
2.4 Micro-CT 檢測
術后 4、8 周，兩組肌腱止點骨床未見明顯差異。見圖 4。術后 4、8 周兩組 TMD、BMD 和 BV/TV 差異均無統計學意義（P>0.05）；對照組組內術后 4、8 周 BV/TV 差異有統計學意義（t=5.413，P=0.003），兩組組內其他指標 4、8 周間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點兩組 Micro-CT 檢測結果（n=6，）
Table1.
Micro-CT analysis in both groups at each time point after operation (n=6, )
圖4
術后各時間點兩組 Micro-CT 觀察
a. 對照組術后 4 周；b. 實驗組術后 4 周；c. 對照組術后 8 周；d. 實驗組術后 8 周
Figure4. Micro-CT images of both groups at each time point after operationa. Control group at 4 weeks; b. Experimental group at 4 weeks; c. Control group at 8 weeks; d. Experimental group at 8 weeks
2.5 組織學觀察
術后 4 周，對照組腱-骨界面以纖維瘢痕為主，界面間無明顯間隙，肌腱纖維排列大致正常；實驗組腱-骨界面部分區域可見礦化軟骨和少量纖維軟骨形成，排列紊亂，界面間無明顯間隙，無支架殘留、炎癥反應和肉芽組織形成，肌腱纖維排列大致正常。術后 8 周，對照組腱-骨界面仍以纖維瘢痕為主，局部可見少量軟骨，肌腱纖維排列正常；實驗組腱-骨界面部分區域可見礦化軟骨和纖維軟骨有序排列成過渡結構，界面間無明顯間隙，肌腱纖維排列正常。見圖 5。
圖5
術后各時間點兩組 HE 染色觀察（×100）
B 表示骨組織，I 表示腱-骨界面，T 表示肌腱 a. 對照組術后 4 周；b. 實驗組術后4 周；c. 對照組術后 8 周；d. 實驗組術后 8 周
Figure5. HE staining of both groups at each time point after operation (×100)B indicated bone, I indicated tendon-to-bone interface, T indicated tendon a. Control group at 4 weeks; b. Experimental group at 4 weeks; c. Control group at 8 weeks; d. Experimental group at 8 weeks
對照組和實驗組術后 4 周肌腱成熟度評分分別為（12.5±1.0）、（16.8±0.8）分，術后 8 周分別為（16.2±0.8）、（23.0±1.1）分。術后 4、8 周，實驗組肌腱成熟度評分均優于對照組，差異有統計學意義（t=6.500，P=0.001；t=10.448，P=0.000）。 對照組和實驗組組內術后 4、8 周肌腱成熟度評分，差異均有統計學意義（t=7.416，P=0.001；t=12.921，P=0.000）。
2.6 生物力學測定
兩組標本均于腱-骨界面處拉斷。術后 4 周對照組和實驗組極限負荷、剛度差異均無統計學意義（P>0.05）；術后 8 周實驗組極限負荷明顯優于對照組，差異有統計學意義（t=4.162，P=0.009），剛度比較差異無統計學意義（t=2.286，P=0.071）。兩組組內術后 8 周極限負荷及剛度均優于 4 周，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
術后各時間點兩組生物力學測定結果（n=6，）
Table2.
Biomechanical test in both groups at each time point after operation (n=6, )
3 討論
正常肩袖腱-骨界面由肌腱、纖維軟骨、礦化軟骨和骨組織四層逐漸過渡結構形成，而肩袖修補術后腱-骨界面的多層過渡結構被瘢痕替代，導致肩袖力學性能減弱，存在再斷裂可能。通過組織工程方法改變腱-骨界面愈合方式，重建正常腱-骨止點結構，是提高肩袖修補術療效的重要研究方向，近年相關研究對于種子細胞及生物材料的選擇、支架的設計、生長因子的應用等方面進行了深入探討[18]。
BMSCs、脂肪干細胞、滑囊干細胞、肌腱干細胞、骨膜干細胞等干細胞具有多向分化潛能，可以促進腱-骨止點的修復。但作為種子細胞，脂肪干細胞存在更新能力差、定向誘導機制仍不明確等不足；滑囊干細胞需要在體外分離和培養，目前仍處于研究早期；肌腱干細胞存在含量少、分離和純化困難等問題；骨膜干細胞數量較少，限制了其在肩袖修復中的應用[19]。而 BMSCs 是目前研究應用最多的干細胞，具有多向分化特性、分泌生物活性分子、提供再生微環境等優勢，是一種具有應用前景的組織工程種子細胞[20]。但目前干細胞技術面臨程序耗時、細胞來源缺乏、分化調節不確定、宿主可能發生免疫反應、難以儲存和運輸等問題，增加了臨床轉化的難度[21]。為了便于臨床應用，需要簡便快速的方法來獲取 BMSCs。微骨折技術是目前臨床上獲得 BMSCs 的有效途徑之一，可用于關節軟骨缺損的修復和促進肩袖腱-骨愈合[11-12]，手術過程中直接在肩袖止點骨床上鉆孔，無需通過額外侵襲性手術來獲取種子細胞，未明顯增加手術創傷和延長手術時間，很好地解決了干細胞來源問題。Kida 等[22]發現在大結節骨床鉆孔可以讓 BMSCs 從骨髓中滲透，參與肩袖修復，促進肩袖愈合。Bilsel 等[11]通過慢性肩袖損傷動物模型，研究微骨折技術對肩袖愈合的影響。生物力學和組織學觀察結果顯示，微骨折技術能夠促進腱-骨愈合。Milano 等[23]報道了關節鏡下肩袖修補術中應用微骨折技術的療效，對于涉及岡上肌和岡下肌的大肩袖撕裂，微骨折組的治愈率顯著提高。Snyder 等[24]認為通過微骨折技術能夠在肩袖止點骨床區域形成富含 BMSCs、生長因子和促血管生成因子的纖維蛋白凝塊，誘導細胞遷移和增殖，促進腱-骨愈合。
除了干細胞，組織工程支架也是促進腱-骨愈合的有效途徑之一。BMSCs 與組織工程支架的聯合應用能夠更好地修復肩袖損傷[25]。理想的組織工程支架降解速率應與組織形成速率匹配，同時具有適合細胞生長和營養物質交換的三維結構[26-27]。利用冷凍干燥法可以制備具有合適孔徑、孔隙相對均勻、連通性好的多孔支架，還能避免支架表面生物活性分子的破壞[26]。本研究選擇該方法制備了仿生水凝膠支架，掃描電鏡觀察顯示獲得的支架具有豐富的多孔結構，平均孔徑為 60.2 μm，這種大小的孔徑有利于細胞穿透和骨軟骨的形成[28]。體外降解性能測試顯示，支架 9 d 時降解率約為 48%，15 d 時約為 83%。而肩袖修補術后愈合過程可以分成炎癥反應期（0～7 d）、修復期（5～14 d）和重塑期（>14 d）3 個階段[29]，結合體外降解實驗結果，本研究制備的仿生水凝膠支架降解速率能夠滿足腱-骨界面修復的需求，不會阻礙腱-骨愈合。
本研究 Micro-CT 檢測未發現仿生水凝膠支架對腱-骨界面新骨形成有促進作用，但組織學觀察提示術后 4 周實驗組腱-骨界面部分區域有少量軟骨組織，未見支架殘留和炎癥反應，進一步說明制備的仿生水凝膠支架降解速率能滿足腱-骨界面修復的要求，同時具有良好的組織相容性，而且隨著時間的推移，實驗組軟骨排列更加有序。生物力學測試結果表明，術后 8 周實驗組極限負荷明顯大于對照組，說明實驗組腱-骨結構抗拉性能優于對照組。Dai 等[30]用制備的多孔纖維蛋白支架修復兔軟骨缺損，在不添加外源性細胞的前提下，實現了原位軟骨修復。Sofu 等[31]運用微骨折技術聯合透明質酸支架修復膝關節軟骨缺損，結果顯示與單純微骨折處理相比，聯合使用透明質酸支架能更好地促進軟骨修復，取得更好療效。本研究結果也表明，與單純微骨折處理相比，微骨折技術聯合仿生水凝膠支架能夠更好地促進腱-骨界面多層結構的修復。
綜上述，仿生水凝膠支架具有較好的理化性質和組織相容性，與微骨折技術聯合使用，可以更好地促進肩袖腱-骨愈合，增強腱-骨界面抗拉性能，有望用于肩袖損傷的再生與修復。但本研究還存在一些不足，如未進行體外細胞實驗，未設置假手術組和單純切斷縫合對照組、標本數量偏少，由于動物肩關節解剖結構和運動特點，無法完全模擬人肩袖損傷及愈合過程。另外，由于本研究使用的是急性肩袖損傷模型，仿生水凝膠支架對慢性肩袖損傷的修復作用有待進一步研究。
作者貢獻：程飚、趙松負責整體科研設計；黃成龍負責實驗實施、數據收集整理、統計分析及文章撰寫；陳剛和潘界恩參與實驗實施。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經嘉興學院附屬第二醫院醫學倫理委員會批準（jxey-2020SZ048）。實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0008，使用許可證號：SYXK（滬）2016-0020。
