引用本文： 陳國飛, 崔磊, 陳鵬, 李偉, 尤田, 王琛, 江長青, 劉崗. 化學萃取同種異體肌腱聯合同種異體軟骨細胞重建兔肩關節前盂唇實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(9): 1184-1189. doi: 10.7507/1002-1892.201911156 復制
盂唇損傷在體育運動中較常見，尤其是做投擲動作的運動項目中。盂唇損傷可導致肩關節疼痛及活動障礙，目前關節鏡下盂唇修復被認為是治療肩關節脫位和盂唇損傷的最佳方法[1-2]。隨著關節鏡技術的發展，大多數盂唇損傷通過關節鏡修復縫合都可治愈[3]。但對于反復發生肩關節脫位的患者，盂唇損傷伴缺損難以縫合修復，需采用自體組織重建修補盂唇缺損。Paulos 等[4]采用盂唇重建術修復肩關節前盂唇不穩定，取得了滿意效果。Bateman 等[5]報道可采用自體肌腱或同種異體肌腱移植重建治療肩關節盂唇損傷。因此，盂唇重建可能是治療肩關節疾病的一種有希望的方法。
盂唇缺損重建需要組織填充缺損處，組織來源包括自體或同種異體。有學者曾采用同種異體半月板組織移植替代盂唇[6]，但半月板組織來源有限。本研究基于同種異體組織填充盂唇缺損的可行性，設計在兔肩關節前盂唇缺損模型中采用同種異體肌腱重建盂唇。同種異體肌腱使用前需處理抗原排斥反應，可采用輻射照射方法，但容易破壞肌腱膠原結構導致生物力學特性降低[7]，生物力學改變又可導致移植物失去原有物理特性，出現移植物磨損失敗。而采用化學萃取方法可對抗原進行滅活，最大程度保留肌腱膠原結構[8]，在移植物的選擇上能夠提供良好的生物力學特性。
另外，同種異體肌腱抗原滅活后移植體內需進一步考慮細胞長入替代愈合以及移植物吸收可能。本研究將同種異體軟骨細胞體外分離培養后，再注射至已移植滅活抗原同種異體肌腱的關節腔內，通過與未注射軟骨細胞模型比較，觀察注射軟骨細胞對促進移植物愈合、縮短愈合時間的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性新西蘭大白兔 45 只，體質量 2.5～3.0 kg，購自北京華富康生物科技有限公司。
無水乙醇、中性樹脂、二甲苯（中國醫藥集團有限公司）；脫氧膽酸鈉、多聚甲醛、Triton X-100（上海生工生物工程有限公司）；水合氯醛（阿拉丁控股集團有限公司）；PBS 粉末、ALP 標記鏈霉卵白素、中性樹膠（北京中杉金橋生物有限公司）；蘇木素染液、糖原染液（南京建成科技有限公司）；伊紅染液（上海碧云天生物技術有限公司）；兔抗Ⅱ型膠原抗體（Abcam 公司，美國）；小牛血清、胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；DMEM 培養基、FBS（GIBCO 公司，美國）；DMSO（Amresco 公司，美國）；阿利新藍染色試劑盒（北京雷根生物技術有限公司）。Sanyo-382AT 超低溫冰箱、CO2 培養箱（Sanyo 公司，日本）；80、150、200 目不銹鋼細胞篩（上海生工生物工程有限公司）；電熱壓力蒸汽消毒器（浙江紹興醫療器械總廠）；倒置顯微鏡、照像系統（Olympus 公司，日本）；細胞計數板（上海醫用儀器廠）；細胞培養瓶、細胞培養板（Costar 公司，美國）。
1.2 同種異體肌腱準備
取 15 只新西蘭大白兔，腹腔注射 7% 水合氯醛（0.5 mL/100 g）麻醉后，剪開腿部皮膚，分離肌肉并充分暴露肌腱，剪下小腿跟腱組織，并修剪成每條長約 2 cm、直徑約 0.3 cm，注意避免操作過程中夾取或牽拉肌腱。每只兔制作 4 條肌腱，共計 60 條。將其中 50 條肌腱采用化學萃取法處理[8]。取其中 10 條處理后肌腱（萃取組）與未經任何處理的 10 條肌腱（對照組），行 HE 染色并計數細胞核數量，采用 Masson 染色對比兩組肌腱膠原纖維結構。
1.3 同種異體軟骨細胞分離培養
取上述 15 只麻醉后新西蘭大白兔，無菌條件下取出膝關節軟骨，PBS 沖洗。將軟骨組織剪成 1 mm×1 mm×1 mm 大小，移至離心管中，加 3 倍體積 0.25% 胰蛋白酶，置入 37℃ 恒溫搖床中振蕩消化 15～20 min，期間吹打 1 次；加入等體積完全培養基（含 10%FBS 的 DMEM 培養基）終止消化，然后以離心半徑 13 cm、1 000 r/min 離心 5 min，棄上清； PBS 洗滌，去上清；加入 0.2%Ⅱ型膠原酶，置入 37℃ 恒溫搖床中振蕩消化 2 h；加入生長培養基（含 10%FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的 DMED 培養基）終止消化，反復吹打后依次通過 200 目濾網；收集濾液，以離心半徑 13 cm、1 200 r/min 離心 8 min，棄上清，用完全培養基重懸細胞。放入 37℃、5%CO2 細胞培養箱中培養，隔天換液，待細胞達 80% 融合時傳代。細胞傳代后放入預置有薄骨片或蓋玻片的培養板中進行培養。細胞完全貼壁后即可固定，采用Ⅱ型膠原免疫組織化學染色對細胞進行鑒定，取第 3 代細胞進行后續實驗。
1.4 兔肩關節損傷模型相關觀測
1.4.1 兔肩關節損傷模型建立及肌腱移植
參照 Abe 等[9]的方法制備兔前盂唇缺損模型。取剩余 30 只新西蘭大白兔，7% 水合氯醛（0.5 mL/100 g）耳緣靜脈注射麻醉，右前肢備皮、脫毛后仰臥位固定于操作臺。于肩關節前側縱向剪開皮膚約 4 cm，切開皮下組織及關節囊，鈍性分離，切斷肩胛下肌肌腱，暴露肱骨大、小結節；分離周圍組織，極度外旋右前肢，暴露肱骨結節對側關節盂，切除肩關節前下盂唇約 2 cm。將 30 條經化學萃取處理的同種異體肌腱植入兔肩關節，與肩關節內剩余盂唇吻合，填充被切除的盂唇，邊緣與關節囊和關節盂周圍軟組織用 8-0 Prolene 線縫合固定。肌腱移植完畢后無菌 PBS、雙氧水、聚維酮碘溶液反復沖洗關節腔，內旋肩關節，縫合肩胛下肌肌腱及關節囊，逐層縫合肌肉組織及皮膚。見圖 1a、b。
圖1
手術過程
a. 兔肩關節前盂唇缺損模型；b. 同種異體肌腱移植；c. 肩關節內注射同種異體軟骨細胞
Figure1. Operation processa. Preparation of a rabbit model of anterior glenoid labrum defect; b. Allogeneic tendon transplantation; c. Intraarticular injection of allogeneic chondrocytes into the shoulder
1.4.2 實驗分組及方法
將已移植同種異體肌腱的 30 只兔隨機分為兩組，A 組于關節間隙注射 2 mL 同種異體軟骨細胞（含 4×105個細胞）[10]，見圖 1c；B 組不作任何處理。術后動物分籠飼養，肌肉注射青霉素 80 萬 U/只 3 d，保持充足飼料及飲水。
1.4.3 觀測指標
① 大體觀察：分別于術后 4、6、8 周，每組各取 5 只兔，同上法麻醉后取出移植肌腱，大體觀察移植肌腱與周邊組織愈合情況。② AB 染色觀察：大體觀察后取肌腱標本，常規行 AB 染色，用酶標儀于 600 nm 波長下測定吸光度（A）值，并根據標準曲線計算樣品的糖胺聚糖含量。③ HE、Masson 染色觀察：術后 6 周取肌腱標本，常規行 HE 染色計數肌腱組織中細胞核數量，Masson 染色觀察肌腱內纖維組織情況。
1.5 統計學方法
采用 STATA21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 同種異體肌腱觀測
Masson 染色示，萃取組和對照組肌腱的膠原纖維均平行排列成束，形態色澤及組織結構差別不大，萃取組較對照組稍松散。見圖 2。HE 染色示，在 400 倍倒置顯微鏡下，萃取組肌腱中細胞核數量為 0，而對照組為（10±2）個/視野，差異有統計學意義（t=30.999，P=0.000）。見圖 3。
圖2
化學萃取前后肌腱 Masson 染色觀察（倒置顯微鏡×400）
a. 萃取組；b. 對照組
Figure2. Masson staining of tendon before and after chemical extraction (Inverted microscope×400)a. Extraction group; b. Control group
圖3
化學萃取前后肌腱 HE 染色觀察（倒置顯微鏡×400）a. 萃取組；b. 對照組
Figure3.
HE staining of tendon before and after chemical extraction (Inverted microscope×400)
a. Extraction group; b. Control group
2.2 軟骨細胞原代鑒定
Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，軟骨細胞細胞質及細胞膜被染成棕黃色，細胞核不著色，提示培養細胞為軟骨細胞。見圖 4。
圖4
軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組織化學染色鑒定倒置顯微鏡觀察
a. ×100；b. ×400
Figure4. Identification of chondrocytes by collagen type Ⅱ immunohistochemistry staining under inverted microscopea.×100; b. ×400
2.3 兔肩關節損傷模型相關觀測
2.3.1 大體觀察
術后 4 周，A、B 組移植肌腱均未愈合，但 A 組肌腱與肩關節周圍組織縫隙小于 B 組。術后 6 周，A 組均已完全愈合；B 組移植肌腱僅 2 例完全愈合，2 例仍有約長 0.5 cm、寬 0.3 cm 未完全愈合，1 例未見愈合。術后 8 周，A 組完全愈合無變化；而 B 組移植肌腱仍僅有 2 例完全愈合，1 例肌腱出現部分吸收縮小，2 例部分愈合存留縫隙。見圖 5。
圖5
術后 8 周兩組移植肌腱大體觀察
a. A 組完全愈合；b. B 組 1 例肌腱吸收
Figure5. General observation of tendon grafts in two groups at 8 weeks after operationa. Complete healing in group A; b. One case of tendon absorption in group B
2.3.2 AB 染色觀察
A 組術后 6、8 周糖胺聚糖含量顯著高于術后 4 周，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 6、8 周間差異無統計學意義（P>0.05）。B 組術后 8 周糖胺聚糖含量顯著高于術后 4、6 周，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 4、6 周間差異無統計學意義（P>0.05）。術后各時間點 A 組糖胺聚糖含量均顯著高于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1、圖 6。
表1
術后各時間點兩組 AB 染色檢測糖胺聚糖含量（n=5，
，μg/mL）
Table1.
Detection of glycosaminoglycan content by AB staining at each time point after operation (n=5, 
, μg/mL)
圖6
術后 6 周兩組肌腱組織 AB 染色觀察（倒置顯微鏡×400）
a. A 組；b. B 組
Figure6. AB staining of tendon tissue at 6 weeks after operation (Inverted microscope×400)a. Group A; b. Group B
2.3.3 HE 染色
術后 6 周 400 倍鏡下觀察示，A 組肌腱組織內的細胞核數量為（69.8±3.8）個/視野，明顯多于 B 組的（34.4±3.4）個/視野，差異有統計學意義（t=20.043，P=0.000）。見圖 7。
圖7
術后 6 周兩組肌腱組織 HE 染色觀察（倒置顯微鏡×400）
a. A 組；b. B 組
Figure7. HE staining of tendon tissue at 6 weeks after operation (Inverted microscope×400)a. Group A; b. Group B
2.3.4 Masson 染色
術后 6 周，A 組肌腱組織中的細胞核明顯增多，肌纖維及膠原纖維相互交錯，組織結構更加緊湊，肌腱組織以藍染為主；而 B 組細胞核較少，主要為原移植物的膠原纖維。見圖 8。
圖8
術后 6 周兩組肌腱組織 Masson 染色觀察（倒置顯微鏡×400）
a. A 組；b. B 組
Figure8. Masson staining of tendon tissue at 6 weeks after operation (Inverted microscope×400)a. Group A; b. Group B
3 討論
3.1 肌腱移植物的來源
肩關節盂唇損傷常見的是前盂唇損傷或缺損，重建盂唇是比較有效的方法。可選擇肌腱移植重建[10-11]，肌腱來源包括自體肌腱及同種異體肌腱。自體肌腱雖無排斥反應[12]，但來源有限，難以滿足臨床需求，且取自體肌腱會增加切口創傷。而同種異體肌腱來源廣泛，能夠滿足臨床需求，但其應用面臨免疫排斥反應的問題[13-14]，直接將未經抗原滅活處理的同種異體肌腱移植至體內，可導致手術失敗甚至危及患者生命安全。所以采用同種異體肌腱必須經過抗原滅活處理，但同種異體肌腱經滅活處理后，可能導致組織結構破壞而引起強度改變。目前最常用的同種異體肌腱滅活方法為輻射照射，經輻照后的肌腱常出現肌腱纖維組織破壞，抗拉性及組織韌性降低[7]。另外，經過輻射照射的同種異體肌腱保存方法多采用低溫冰凍保存，這加重了對肌腱結構的損傷，導致肌腱生物力學性能下降[14]，肌腱抗拉強度及拉伸強度下降將導致手術失敗。
因此，應盡可能地保留同種異體肌腱強度來降低手術失敗風險，盡可能保護肌腱原有的纖維組織結構不受破壞，肌腱原有纖維組織保存越好，肌腱的抗拉性及組織韌性越完整。本研究中，我們采用化學萃取法滅活肌腱的抗原活性[8，15]，既滅活了抗原活性，對肌腱的纖維結構破壞也較小。HE 和 Masson 染色結果顯示，經化學萃取后的肌腱中細胞核消失，且肌腱纖維未被破壞，保證了肌腱的韌性結構。提示采用該方法滅活抗原后的同種異體肌腱能夠為盂唇重建提供支架材料，保證了力學穩定性和移植安全性。
3.2 肌腱移植后的狀況
實驗中我們采用兔肩關節進行造模，打開兔肩關節并切除部分前盂唇，模擬肩關節前盂唇缺損；再將經化學萃取處理的同種異體肌腱移植至肩關節與剩余盂唇吻合，模擬了肩關節盂唇損傷重建。將化學萃取后的同種異體肌腱移植后需觀察愈合情況，肌腱如帶有抗原活性，容易造成免疫排斥反應及相關炎癥反應，導致切口不愈合及感染可能。本研究中實驗動物均未發生切口感染不愈合現象，提示經化學萃取后的肌腱與受體有較好的組織相容性。將同種異體肌腱移植至兔肩關節內需考慮細胞附著成活生長問題，肌腱在體內愈合時間越長，越可能出現不愈合或吸收。為了促進移植肌腱的愈合，縮短愈合時間，防止移植后肌腱吸收，本研究在肌腱移植后于關節內注射同種異體軟骨細胞（A 組），并與移植后未作任何處理的 B 組進行比較。大體觀察愈合情況顯示，同時間點 B 組肌腱與周邊組織縫隙大于 A 組，說明未注射同種異體軟骨細胞的 B 組愈合速度慢于 A 組，并且隨時間增加，不愈合肌腱可出現肌腱的吸收消失。而 A 組移植肌腱術后 6 周與周邊組織完全愈合，并且未出現肌腱移植后吸收，說明注射軟骨細胞有助于肌腱組織爬行替代。
3.3 關于種子細胞的選擇
盂唇組織細胞以纖維軟骨細胞為主，在移植細胞方面可選擇纖維軟骨細胞、BMSCs 及透明軟骨細胞。纖維軟骨細胞可來源于半月板組織，但取纖維軟骨細胞可能損傷正常的半月板或供體組織；BMSCs 分化能力較強，且取材方便，但向肌纖維組織或其他組織細胞分化可能難以控制。透明軟骨細胞在生物力學抗壓及彈性方面優于纖維軟骨細胞，取材方便，臨床中可使用非功能區的透明軟骨細胞[16]。透明軟骨細胞的培養國內外已有較多研究和方法，而且細胞分化固定，軟骨細胞常在培養至第 3 代時出現生長抑制及向纖維細胞分化[17]，而盂唇組織雖為軟骨細胞組織，但以纖維軟骨細胞為主，即使透明軟骨細胞向纖維細胞分化也接近盂唇組織細胞，所以本實驗中選擇透明軟骨細胞進行培養及后續的注射。
3.4 細胞與肌腱的體內或體外聯合培養
在細胞聯合培養方面，可采用肌腱與細胞體外聯合培養再回植。但肌腱體外聯合細胞培養時，需考慮到細胞培養周期，周期短難以長入，而周期長會出現細胞增殖能力減弱并老化[18]，還容易增加細胞污染概率導致失敗。所以我們采用肌腱移植后再注射軟骨細胞，于體外軟骨細胞培養增殖后[19]，再將富含軟骨細胞的細胞液回植到已移植同種異體肌腱的肩關節內。
在將細胞液注射到肩關節內時機的選擇上，主要考慮肩關節內軟骨細胞濃度的維持。如術中將軟骨細胞直接注射到肌腱，關節囊未縫合關閉情況下容易發生細胞外漏，細胞濃度難以控制。所以我們待關節周圍軟組織縫合，關節腔已封閉后立即將富含軟骨細胞的細胞液注入，不易發生細胞外漏，能夠維持細胞濃度。術后取材時機的選擇主要根據細胞注射移植后 4 周為細胞增生期，同時組織 4 周左右會有替代細胞長入及部分愈合，6～8 周是細胞過渡期，一般會有大量膠原細胞分泌[20]，所以我們分別于 4、6、8 周進行取樣對比。
經過對比實驗動物體內注射（A 組）與未注射軟骨細胞的同種異體肌腱（B 組）中細胞的生長情況，結果顯示前者能夠更好地促進肌腱內細胞的爬行生長。與 B 組相比，HE 染色可見 A 組細胞數明顯增多，AB 染色示 A 組糖胺聚糖水平明顯增高，Masson 染色示 A 組肌纖維及膠原纖維相互交錯、組織結構更加緊湊。說明移植同種異體肌腱后聯合軟骨細胞注射的 A 組肌腱內有纖維細胞或非軟骨細胞存在，其膠原纖維更加緊密，在生物力學性能方面更優異。
綜上述，經化學萃取法滅活抗原的同種異體肌腱，能夠治療兔肩關節前盂唇缺損，且聯合同種異體軟骨細胞能夠促進肌腱移植的愈合。雖然未注射軟骨細胞的同種異體肌腱也愈合，但肌腱內的細胞爬行替代較少。本研究不足之處在于未將術后兩組肌腱進行生物力學對比檢測，將在后續研究中進一步改善。
作者貢獻：陳國飛負責實驗資料收集，參與整個實驗過程；崔磊查閱文獻并提供相關資料參考；陳鵬在肌腱化學萃取方法上提供技術指導；李偉、尤田、王琛、劉崗在動物模型上幫助手術及協助動物管理；江長青為課題總負責人，主導實驗進程。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：所有動物實驗經北京大學深圳醫院實驗動物倫理委員會批準（2018031682）。實驗動物使用許可證號：SYXK-（粵）2018-0106。
盂唇損傷在體育運動中較常見，尤其是做投擲動作的運動項目中。盂唇損傷可導致肩關節疼痛及活動障礙，目前關節鏡下盂唇修復被認為是治療肩關節脫位和盂唇損傷的最佳方法[1-2]。隨著關節鏡技術的發展，大多數盂唇損傷通過關節鏡修復縫合都可治愈[3]。但對于反復發生肩關節脫位的患者，盂唇損傷伴缺損難以縫合修復，需采用自體組織重建修補盂唇缺損。Paulos 等[4]采用盂唇重建術修復肩關節前盂唇不穩定，取得了滿意效果。Bateman 等[5]報道可采用自體肌腱或同種異體肌腱移植重建治療肩關節盂唇損傷。因此，盂唇重建可能是治療肩關節疾病的一種有希望的方法。
盂唇缺損重建需要組織填充缺損處，組織來源包括自體或同種異體。有學者曾采用同種異體半月板組織移植替代盂唇[6]，但半月板組織來源有限。本研究基于同種異體組織填充盂唇缺損的可行性，設計在兔肩關節前盂唇缺損模型中采用同種異體肌腱重建盂唇。同種異體肌腱使用前需處理抗原排斥反應，可采用輻射照射方法，但容易破壞肌腱膠原結構導致生物力學特性降低[7]，生物力學改變又可導致移植物失去原有物理特性，出現移植物磨損失敗。而采用化學萃取方法可對抗原進行滅活，最大程度保留肌腱膠原結構[8]，在移植物的選擇上能夠提供良好的生物力學特性。
另外，同種異體肌腱抗原滅活后移植體內需進一步考慮細胞長入替代愈合以及移植物吸收可能。本研究將同種異體軟骨細胞體外分離培養后，再注射至已移植滅活抗原同種異體肌腱的關節腔內，通過與未注射軟骨細胞模型比較，觀察注射軟骨細胞對促進移植物愈合、縮短愈合時間的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性新西蘭大白兔 45 只，體質量 2.5～3.0 kg，購自北京華富康生物科技有限公司。
無水乙醇、中性樹脂、二甲苯（中國醫藥集團有限公司）；脫氧膽酸鈉、多聚甲醛、Triton X-100（上海生工生物工程有限公司）；水合氯醛（阿拉丁控股集團有限公司）；PBS 粉末、ALP 標記鏈霉卵白素、中性樹膠（北京中杉金橋生物有限公司）；蘇木素染液、糖原染液（南京建成科技有限公司）；伊紅染液（上海碧云天生物技術有限公司）；兔抗Ⅱ型膠原抗體（Abcam 公司，美國）；小牛血清、胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；DMEM 培養基、FBS（GIBCO 公司，美國）；DMSO（Amresco 公司，美國）；阿利新藍染色試劑盒（北京雷根生物技術有限公司）。Sanyo-382AT 超低溫冰箱、CO2 培養箱（Sanyo 公司，日本）；80、150、200 目不銹鋼細胞篩（上海生工生物工程有限公司）；電熱壓力蒸汽消毒器（浙江紹興醫療器械總廠）；倒置顯微鏡、照像系統（Olympus 公司，日本）；細胞計數板（上海醫用儀器廠）；細胞培養瓶、細胞培養板（Costar 公司，美國）。
1.2 同種異體肌腱準備
取 15 只新西蘭大白兔，腹腔注射 7% 水合氯醛（0.5 mL/100 g）麻醉后，剪開腿部皮膚，分離肌肉并充分暴露肌腱，剪下小腿跟腱組織，并修剪成每條長約 2 cm、直徑約 0.3 cm，注意避免操作過程中夾取或牽拉肌腱。每只兔制作 4 條肌腱，共計 60 條。將其中 50 條肌腱采用化學萃取法處理[8]。取其中 10 條處理后肌腱（萃取組）與未經任何處理的 10 條肌腱（對照組），行 HE 染色并計數細胞核數量，采用 Masson 染色對比兩組肌腱膠原纖維結構。
1.3 同種異體軟骨細胞分離培養
取上述 15 只麻醉后新西蘭大白兔，無菌條件下取出膝關節軟骨，PBS 沖洗。將軟骨組織剪成 1 mm×1 mm×1 mm 大小，移至離心管中，加 3 倍體積 0.25% 胰蛋白酶，置入 37℃ 恒溫搖床中振蕩消化 15～20 min，期間吹打 1 次；加入等體積完全培養基（含 10%FBS 的 DMEM 培養基）終止消化，然后以離心半徑 13 cm、1 000 r/min 離心 5 min，棄上清； PBS 洗滌，去上清；加入 0.2%Ⅱ型膠原酶，置入 37℃ 恒溫搖床中振蕩消化 2 h；加入生長培養基（含 10%FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的 DMED 培養基）終止消化，反復吹打后依次通過 200 目濾網；收集濾液，以離心半徑 13 cm、1 200 r/min 離心 8 min，棄上清，用完全培養基重懸細胞。放入 37℃、5%CO2 細胞培養箱中培養，隔天換液，待細胞達 80% 融合時傳代。細胞傳代后放入預置有薄骨片或蓋玻片的培養板中進行培養。細胞完全貼壁后即可固定，采用Ⅱ型膠原免疫組織化學染色對細胞進行鑒定，取第 3 代細胞進行后續實驗。
1.4 兔肩關節損傷模型相關觀測
1.4.1 兔肩關節損傷模型建立及肌腱移植
參照 Abe 等[9]的方法制備兔前盂唇缺損模型。取剩余 30 只新西蘭大白兔，7% 水合氯醛（0.5 mL/100 g）耳緣靜脈注射麻醉，右前肢備皮、脫毛后仰臥位固定于操作臺。于肩關節前側縱向剪開皮膚約 4 cm，切開皮下組織及關節囊，鈍性分離，切斷肩胛下肌肌腱，暴露肱骨大、小結節；分離周圍組織，極度外旋右前肢，暴露肱骨結節對側關節盂，切除肩關節前下盂唇約 2 cm。將 30 條經化學萃取處理的同種異體肌腱植入兔肩關節，與肩關節內剩余盂唇吻合，填充被切除的盂唇，邊緣與關節囊和關節盂周圍軟組織用 8-0 Prolene 線縫合固定。肌腱移植完畢后無菌 PBS、雙氧水、聚維酮碘溶液反復沖洗關節腔，內旋肩關節，縫合肩胛下肌肌腱及關節囊，逐層縫合肌肉組織及皮膚。見圖 1a、b。
圖1
手術過程
a. 兔肩關節前盂唇缺損模型；b. 同種異體肌腱移植；c. 肩關節內注射同種異體軟骨細胞
Figure1. Operation processa. Preparation of a rabbit model of anterior glenoid labrum defect; b. Allogeneic tendon transplantation; c. Intraarticular injection of allogeneic chondrocytes into the shoulder
1.4.2 實驗分組及方法
將已移植同種異體肌腱的 30 只兔隨機分為兩組，A 組于關節間隙注射 2 mL 同種異體軟骨細胞（含 4×105個細胞）[10]，見圖 1c；B 組不作任何處理。術后動物分籠飼養，肌肉注射青霉素 80 萬 U/只 3 d，保持充足飼料及飲水。
1.4.3 觀測指標
① 大體觀察：分別于術后 4、6、8 周，每組各取 5 只兔，同上法麻醉后取出移植肌腱，大體觀察移植肌腱與周邊組織愈合情況。② AB 染色觀察：大體觀察后取肌腱標本，常規行 AB 染色，用酶標儀于 600 nm 波長下測定吸光度（A）值，并根據標準曲線計算樣品的糖胺聚糖含量。③ HE、Masson 染色觀察：術后 6 周取肌腱標本，常規行 HE 染色計數肌腱組織中細胞核數量，Masson 染色觀察肌腱內纖維組織情況。
1.5 統計學方法
采用 STATA21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 同種異體肌腱觀測
Masson 染色示，萃取組和對照組肌腱的膠原纖維均平行排列成束，形態色澤及組織結構差別不大，萃取組較對照組稍松散。見圖 2。HE 染色示，在 400 倍倒置顯微鏡下，萃取組肌腱中細胞核數量為 0，而對照組為（10±2）個/視野，差異有統計學意義（t=30.999，P=0.000）。見圖 3。
圖2
化學萃取前后肌腱 Masson 染色觀察（倒置顯微鏡×400）
a. 萃取組；b. 對照組
Figure2. Masson staining of tendon before and after chemical extraction (Inverted microscope×400)a. Extraction group; b. Control group
圖3
化學萃取前后肌腱 HE 染色觀察（倒置顯微鏡×400）a. 萃取組；b. 對照組
Figure3.
HE staining of tendon before and after chemical extraction (Inverted microscope×400)
a. Extraction group; b. Control group
2.2 軟骨細胞原代鑒定
Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，軟骨細胞細胞質及細胞膜被染成棕黃色，細胞核不著色，提示培養細胞為軟骨細胞。見圖 4。
圖4
軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組織化學染色鑒定倒置顯微鏡觀察
a. ×100；b. ×400
Figure4. Identification of chondrocytes by collagen type Ⅱ immunohistochemistry staining under inverted microscopea.×100; b. ×400
2.3 兔肩關節損傷模型相關觀測
2.3.1 大體觀察
術后 4 周，A、B 組移植肌腱均未愈合，但 A 組肌腱與肩關節周圍組織縫隙小于 B 組。術后 6 周，A 組均已完全愈合；B 組移植肌腱僅 2 例完全愈合，2 例仍有約長 0.5 cm、寬 0.3 cm 未完全愈合，1 例未見愈合。術后 8 周，A 組完全愈合無變化；而 B 組移植肌腱仍僅有 2 例完全愈合，1 例肌腱出現部分吸收縮小，2 例部分愈合存留縫隙。見圖 5。
圖5
術后 8 周兩組移植肌腱大體觀察
a. A 組完全愈合；b. B 組 1 例肌腱吸收
Figure5. General observation of tendon grafts in two groups at 8 weeks after operationa. Complete healing in group A; b. One case of tendon absorption in group B
2.3.2 AB 染色觀察
A 組術后 6、8 周糖胺聚糖含量顯著高于術后 4 周，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 6、8 周間差異無統計學意義（P>0.05）。B 組術后 8 周糖胺聚糖含量顯著高于術后 4、6 周，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 4、6 周間差異無統計學意義（P>0.05）。術后各時間點 A 組糖胺聚糖含量均顯著高于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1、圖 6。
表1
術后各時間點兩組 AB 染色檢測糖胺聚糖含量（n=5，，μg/mL）
Table1.
Detection of glycosaminoglycan content by AB staining at each time point after operation (n=5, , μg/mL)
圖6
術后 6 周兩組肌腱組織 AB 染色觀察（倒置顯微鏡×400）
a. A 組；b. B 組
Figure6. AB staining of tendon tissue at 6 weeks after operation (Inverted microscope×400)a. Group A; b. Group B
2.3.3 HE 染色
術后 6 周 400 倍鏡下觀察示，A 組肌腱組織內的細胞核數量為（69.8±3.8）個/視野，明顯多于 B 組的（34.4±3.4）個/視野，差異有統計學意義（t=20.043，P=0.000）。見圖 7。
圖7
術后 6 周兩組肌腱組織 HE 染色觀察（倒置顯微鏡×400）
a. A 組；b. B 組
Figure7. HE staining of tendon tissue at 6 weeks after operation (Inverted microscope×400)a. Group A; b. Group B
2.3.4 Masson 染色
術后 6 周，A 組肌腱組織中的細胞核明顯增多，肌纖維及膠原纖維相互交錯，組織結構更加緊湊，肌腱組織以藍染為主；而 B 組細胞核較少，主要為原移植物的膠原纖維。見圖 8。
圖8
術后 6 周兩組肌腱組織 Masson 染色觀察（倒置顯微鏡×400）
a. A 組；b. B 組
Figure8. Masson staining of tendon tissue at 6 weeks after operation (Inverted microscope×400)a. Group A; b. Group B
3 討論
3.1 肌腱移植物的來源
肩關節盂唇損傷常見的是前盂唇損傷或缺損，重建盂唇是比較有效的方法。可選擇肌腱移植重建[10-11]，肌腱來源包括自體肌腱及同種異體肌腱。自體肌腱雖無排斥反應[12]，但來源有限，難以滿足臨床需求，且取自體肌腱會增加切口創傷。而同種異體肌腱來源廣泛，能夠滿足臨床需求，但其應用面臨免疫排斥反應的問題[13-14]，直接將未經抗原滅活處理的同種異體肌腱移植至體內，可導致手術失敗甚至危及患者生命安全。所以采用同種異體肌腱必須經過抗原滅活處理，但同種異體肌腱經滅活處理后，可能導致組織結構破壞而引起強度改變。目前最常用的同種異體肌腱滅活方法為輻射照射，經輻照后的肌腱常出現肌腱纖維組織破壞，抗拉性及組織韌性降低[7]。另外，經過輻射照射的同種異體肌腱保存方法多采用低溫冰凍保存，這加重了對肌腱結構的損傷，導致肌腱生物力學性能下降[14]，肌腱抗拉強度及拉伸強度下降將導致手術失敗。
因此，應盡可能地保留同種異體肌腱強度來降低手術失敗風險，盡可能保護肌腱原有的纖維組織結構不受破壞，肌腱原有纖維組織保存越好，肌腱的抗拉性及組織韌性越完整。本研究中，我們采用化學萃取法滅活肌腱的抗原活性[8，15]，既滅活了抗原活性，對肌腱的纖維結構破壞也較小。HE 和 Masson 染色結果顯示，經化學萃取后的肌腱中細胞核消失，且肌腱纖維未被破壞，保證了肌腱的韌性結構。提示采用該方法滅活抗原后的同種異體肌腱能夠為盂唇重建提供支架材料，保證了力學穩定性和移植安全性。
3.2 肌腱移植后的狀況
實驗中我們采用兔肩關節進行造模，打開兔肩關節并切除部分前盂唇，模擬肩關節前盂唇缺損；再將經化學萃取處理的同種異體肌腱移植至肩關節與剩余盂唇吻合，模擬了肩關節盂唇損傷重建。將化學萃取后的同種異體肌腱移植后需觀察愈合情況，肌腱如帶有抗原活性，容易造成免疫排斥反應及相關炎癥反應，導致切口不愈合及感染可能。本研究中實驗動物均未發生切口感染不愈合現象，提示經化學萃取后的肌腱與受體有較好的組織相容性。將同種異體肌腱移植至兔肩關節內需考慮細胞附著成活生長問題，肌腱在體內愈合時間越長，越可能出現不愈合或吸收。為了促進移植肌腱的愈合，縮短愈合時間，防止移植后肌腱吸收，本研究在肌腱移植后于關節內注射同種異體軟骨細胞（A 組），并與移植后未作任何處理的 B 組進行比較。大體觀察愈合情況顯示，同時間點 B 組肌腱與周邊組織縫隙大于 A 組，說明未注射同種異體軟骨細胞的 B 組愈合速度慢于 A 組，并且隨時間增加，不愈合肌腱可出現肌腱的吸收消失。而 A 組移植肌腱術后 6 周與周邊組織完全愈合，并且未出現肌腱移植后吸收，說明注射軟骨細胞有助于肌腱組織爬行替代。
3.3 關于種子細胞的選擇
盂唇組織細胞以纖維軟骨細胞為主，在移植細胞方面可選擇纖維軟骨細胞、BMSCs 及透明軟骨細胞。纖維軟骨細胞可來源于半月板組織，但取纖維軟骨細胞可能損傷正常的半月板或供體組織；BMSCs 分化能力較強，且取材方便，但向肌纖維組織或其他組織細胞分化可能難以控制。透明軟骨細胞在生物力學抗壓及彈性方面優于纖維軟骨細胞，取材方便，臨床中可使用非功能區的透明軟骨細胞[16]。透明軟骨細胞的培養國內外已有較多研究和方法，而且細胞分化固定，軟骨細胞常在培養至第 3 代時出現生長抑制及向纖維細胞分化[17]，而盂唇組織雖為軟骨細胞組織，但以纖維軟骨細胞為主，即使透明軟骨細胞向纖維細胞分化也接近盂唇組織細胞，所以本實驗中選擇透明軟骨細胞進行培養及后續的注射。
3.4 細胞與肌腱的體內或體外聯合培養
在細胞聯合培養方面，可采用肌腱與細胞體外聯合培養再回植。但肌腱體外聯合細胞培養時，需考慮到細胞培養周期，周期短難以長入，而周期長會出現細胞增殖能力減弱并老化[18]，還容易增加細胞污染概率導致失敗。所以我們采用肌腱移植后再注射軟骨細胞，于體外軟骨細胞培養增殖后[19]，再將富含軟骨細胞的細胞液回植到已移植同種異體肌腱的肩關節內。
在將細胞液注射到肩關節內時機的選擇上，主要考慮肩關節內軟骨細胞濃度的維持。如術中將軟骨細胞直接注射到肌腱，關節囊未縫合關閉情況下容易發生細胞外漏，細胞濃度難以控制。所以我們待關節周圍軟組織縫合，關節腔已封閉后立即將富含軟骨細胞的細胞液注入，不易發生細胞外漏，能夠維持細胞濃度。術后取材時機的選擇主要根據細胞注射移植后 4 周為細胞增生期，同時組織 4 周左右會有替代細胞長入及部分愈合，6～8 周是細胞過渡期，一般會有大量膠原細胞分泌[20]，所以我們分別于 4、6、8 周進行取樣對比。
經過對比實驗動物體內注射（A 組）與未注射軟骨細胞的同種異體肌腱（B 組）中細胞的生長情況，結果顯示前者能夠更好地促進肌腱內細胞的爬行生長。與 B 組相比，HE 染色可見 A 組細胞數明顯增多，AB 染色示 A 組糖胺聚糖水平明顯增高，Masson 染色示 A 組肌纖維及膠原纖維相互交錯、組織結構更加緊湊。說明移植同種異體肌腱后聯合軟骨細胞注射的 A 組肌腱內有纖維細胞或非軟骨細胞存在，其膠原纖維更加緊密，在生物力學性能方面更優異。
綜上述，經化學萃取法滅活抗原的同種異體肌腱，能夠治療兔肩關節前盂唇缺損，且聯合同種異體軟骨細胞能夠促進肌腱移植的愈合。雖然未注射軟骨細胞的同種異體肌腱也愈合，但肌腱內的細胞爬行替代較少。本研究不足之處在于未將術后兩組肌腱進行生物力學對比檢測，將在后續研究中進一步改善。
作者貢獻：陳國飛負責實驗資料收集，參與整個實驗過程；崔磊查閱文獻并提供相關資料參考；陳鵬在肌腱化學萃取方法上提供技術指導；李偉、尤田、王琛、劉崗在動物模型上幫助手術及協助動物管理；江長青為課題總負責人，主導實驗進程。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：所有動物實驗經北京大學深圳醫院實驗動物倫理委員會批準（2018031682）。實驗動物使用許可證號：SYXK-（粵）2018-0106。
