引用本文： 葛禮豪, 于德水, 蘇瑞超, 曹陽. 缺氧誘導因子 1α 對人羊膜間充質干細胞耐受缺氧能力影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(3): 264-269. doi: 10.7507/1002-1892.201710104 復制
人羊膜間充質干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）移植能促進脊髓損傷神經功能恢復，既往研究發現其主要通過提高 VEGF 和 BDNF 表達，促進血管和神經再生來改善脊髓損傷后神經功能的恢復[1]。近年研究發現，脊髓損傷動物模型體內移植 hAMSCs 后，hAMSCs 具有明顯的耐受缺氧能力，同時能顯著減少脊髓組織梗死和繼發性神經元的損傷[2-3]。這為采用 hAMSCs 移植治療脊髓損傷提供了新的理論依據。然而如何提高 hAMSCs 耐受缺氧的能力，目前少有報道。缺氧誘導因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）是目前發現的唯一一個高度特異性的、在缺氧條件下能夠發揮活性的核轉錄因子，是專一調節氧穩態的重要介質，同時參與調控 MSCs 增殖、凋亡和耐受缺氧等作用[4]。研究發現，HIF-1α 可提高 BMSCs 耐受缺氧的能力[5]。我們分析 HIF-1α 可能是調節 hAMSCs 耐受缺氧能力的重要轉錄因子之一。本研究通過轉染 HIF-1α 基因，觀察缺氧處理后 hAMSCs 的成活與凋亡情況，以探討 HIF-1α 基因對 hAMSCs 耐受缺氧能力的影響。
1 材料與方法
1.1 主要材料及試劑、儀器
羊膜組織取自錦州醫科大學附屬第一醫院 10 例健康剖宮產產婦，經醫院倫理委員會批準使用，產婦均知情同意。
膠原酶Ⅳ（Sigma 公司，美國）；兔抗人 HIF-1α 單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；兔抗人 B 細胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bax、活化型半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3，C-Caspase-3）多克隆抗體（Absci 公司，美國）；質粒（上海吉瑪制藥技術有限公司）；LipofectamineTM3000（Invitrogen 公司，美國）；實時熒光定量 PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）試劑盒（Dojindo 公司，日本）；AnnexinV-PE-7AAD 試劑盒（天津三箭生物技術股份有限公司）。CO2 培養箱（Thermo Fisher 公司，美國）；CKX-31 倒置相差顯微鏡、IX-71 倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Tecan Infinite M200 多功能酶標儀（Tecan 公司，瑞士）；實時熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）；流式細胞儀（Roche 公司，瑞士）。
1.2 hAMSCs 分離、培養及鑒定
參照文獻[6]報道的 hAMSCs 分離方法并加以改進。取羊膜組織，剪碎至約 1 mm×1 mm 大小，0.25% 胰蛋白酶消化 10 min 后，200 目細胞篩過濾，加入 1 mg/mL 膠原酶Ⅳ，37℃ 消化 1 h；再次過濾，濾液以離心半徑 25 cm、1 500 r/min 離心 5 min，重復 2 次，收集細胞。加入含 10%FBS、1% 青霉素/鏈霉素的 DMEM/F12 培養基，37℃、5%CO2 孵箱培養。3 d 后換液，之后隔天換液，約 10 d 細胞密度達 80%～90% 時進行傳代培養。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。取第 3 代 hAMSCs，參照文獻[7]方法采用免疫熒光法檢測干細胞標志物 OCT-4、NANOG 的表達。
1.3 實驗分組及方法
實驗分為 5 組：A 組為 hAMSCs 空白組，不進行任何處理；B 組為 pcDNA3.1 陰性對照組，細胞轉染 pcDNA3.1 過表達空載質粒；C 組為 shRNA 陰性對照組，細胞轉染 shRNA 干擾空載質粒；D 組為 shRNA-HIF-1α 干擾組，細胞轉染 shRNA-HIF-1α 干擾質粒；E 組為 pcDNA3.1-HIF-1α 過表達組，細胞轉染 pcDNA3.1-HIF-1α 過表達質粒。具體操作：參照文獻[8]方法，取第 3 代 hAMSCs，經 200 μmol/L CoCl2 缺氧處理 12、24、48 h 后，按以上分組瞬時轉染相應質粒，將質粒和 LipofectamineTM3000 復合物輕輕吹打混勻，均勻緩慢加入培養皿中，37℃、5%CO2 孵育 10 min，備用。
1.4 觀測指標
1.4.1 CCK-8 法檢測細胞成活率
各組分別于缺氧處理后 12、24、48 h，每孔加入 10 μL CCK-8 細胞計數試劑，37℃、5%CO2 孵育 4 h 后，于 540 nm 波長下測定各孔吸光度（A）值，按以下公式計算各組細胞成活率：各組 A 值/A 組 A 值。比較不同時間點處理后細胞成活率，選擇成活率最高的時間點細胞進行流式細胞術以及Western blot檢測。
1.4.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率
參照1.4.1觀測結果，各組取對應時間點細胞，消化、收集后調整細胞密度為 1×105個/mL，常規采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡率。
1.4.3 Western blot 檢測 HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Bax、C-Caspase-3 蛋白表達
參照1.4.1觀測結果，各組取對應時間點細胞消化、收集，冰上裂解、勻漿、離心、取上清棄沉淀、測定蛋白含量。等量蛋白（10 μg）樣本上樣，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，濕轉法至聚偏氟乙烯膜上，5% 牛血清白蛋白封閉 1 h；加入兔抗人 HIF-1α（1∶1 000）抗體，兔抗人 VEGF、Bcl-2、Bax、C-Caspase-3 抗體（1∶500），4℃ 孵育過夜，TBST 洗 3 次；加入山羊抗兔 IgG 二抗（1∶5 000）室溫孵育 2 h，TBST 漂洗；化學發光試劑 ECL 發光，顯影。以內參 β-actin 為對照，Gel-Pro Analyzer 軟件分析 HIF-1α 與 β-actin 的積分吸光度（IA）值的比值，表示 HIF-1α 蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hAMSCs 形態觀察及鑒定
培養 3 d，倒置相差顯微鏡下可見少量 hAMSCs 貼壁，呈長梭形，其中混雜有橢圓形人羊膜上皮細胞；7 d 后細胞開始增殖并形成細胞集落，呈放射狀或漩渦狀分布；14 d 后細胞達 80%～90% 融合。傳代后，細胞增殖速度加快，2～3 d 即可長滿培養瓶底；隨著傳代代數增加，細胞形態較一致，并呈漩渦狀或放射狀排列生長。見圖 1。
細胞免疫熒光法檢測示，細胞核中可見 OCT-4、NANOG 表達，提示所培養細胞為 hAMSCs。見圖 2。
2.2 hAMSCs 缺氧處理后相關觀測
2.2.1 CCK-8 法檢測細胞成活率
缺氧處理后 12、24、48 h，與 A、C 組比較，D 組細胞成活率明顯降低；與 A、B 組比較，E 組細胞成活率明顯升高；其中 24 h 時組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。E 組組內比較，與 12、48 h 比較，24 h 時細胞成活率明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），12、48 h 間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。根據比較結果，選擇缺氧處理后 24 h 細胞進行下一步檢測。
2.2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率
缺氧處理后 24 h，A～E 組細胞凋亡率分別為 2.80%±0.28%、3.75%±0.35%、3.60%±0.26%、8.56%±0.94%、1.90%±0.14%。與 A、C 組比較，D 組細胞凋亡率顯著升高，與 A、B 組比較，E 組細胞凋亡率顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
2.2.3 Western blot 檢測細胞各蛋白表達
缺氧處理后 24 h，與 A、C 組比較，D 組細胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表達明顯減少，Bax、C-Caspase-3 蛋白表達明顯增加，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；而 E 組結果相反，與 A、B 組比較，E 組細胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表達明顯增加，Bax、C-Caspase-3 蛋白表達明顯減少，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、6。
圖1
第 3 代 hAMSCs 形態觀察（倒置相差顯微鏡×10）
Figure1.
Morphological observation of the third generation hAMSCs (Inverted phase contrast microscope×10)
圖2
免疫熒光法鑒定 OCT-4、NANOG 在 hAMSCs 中的表達（熒光顯微鏡×20）
從左至右依次為 DAPI、FITC、二者重疊 a. OCT-4；b. NANOG
Figure2. Expressions of OCT-4 and NANOG in hAMSCs by immunofluorescence assay (Fluorescence microscope×20)From left to right for DAPI, FITC, and merge, respectively a. OCT-4; b. NANOG
圖3
CCK-8 法檢測各時間點各組細胞成活率
Figure3.
The survival rate of each group at different time points detected by CCK-8 method
圖4
流式細胞儀檢測各組缺氧處理后 24 h 細胞凋亡率
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure4. The apoptosis rate of cells at 24 hours after hypoxia treatment by flow cytometrya. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D;e. Group E
圖5
Western blot 檢測各組缺氧處理后 24 h 各蛋白表達
Mr：相對分子質量 1: A組 2：B組 3：C組 4：D組 5：E組 a. HIF-1α、VEGF；b. Bcl-2、Bax 和 C-Caspase-3
Figure5. Protein expressions of each group at 24 hours after hypoxia treatment by Western blotMr:Relative molecular mass1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group Ea. HIF-1α and VEGF; b. Bcl-2, Bax, and C-Caspase-3
圖6
Western blot 檢測各組缺氧處理后 24 h 各蛋白相對表達量
Figure6.
The relative expression of protein in each group at 24 hours after hypoxia treatment by Western blot
3 討論
hAMSCs 移植治療脊髓損傷成為近年研究熱點，主要原因是 hAMSCs 屬于多能干細胞，能調節機體免疫功能、避免同種異體移植的免疫排斥反應[9]，且其不具有成瘤性，安全性好[10]；同時，hAMSCs 在缺氧條件下具有更強的繁殖能力，在損傷的脊髓組織中能長期存活[11]。而 hAMSCs 繁殖和存活能力是治療脊髓損傷的關鍵因素之一。hAMSCs 繁殖和存活能力主要與 MSCs 的耐受缺氧能力相關[12]。研究證實在缺氧條件下，MSCs 氧自由基減少，對細胞的破壞作用降低或減弱，同時持續 HIF-1α 的表達并誘導相關生長因子表達，促進缺氧區域新生血管形成，增加細胞對缺氧的耐受能力[13]。
HIF-1α 是調控缺氧效應的一類極為重要的轉錄因子，其分布和作用十分廣泛，可通過調控下游靶基因來增強 MSCs 對缺氧的耐受性[14]。VEGF 是目前最強的促血管生成因子，也是 HIF-1α 重要的靶基因。已有研究證實 VEGF 具有抗凋亡和促進血管新生的作用[15]。在腦缺血動物模型中發現，缺血區 HIF-1α 表達上調的同時 VEGF 表達亦增加，從而促進血管生成來對抗缺血缺氧性損傷；而通過實驗干預減少 HIF-1α 的降解，則能誘導 VEGF 表達上調，減少神經細胞凋亡，促進新生血管形成，增強細胞耐受缺氧能力[16-17]。本實驗對 hAMSCs 缺氧處理后檢測各組細胞成活率，發現 A 組高于 B、C 組，這可能與 B、C 組 hAMSCs 受損程度及 HIF-1α 未明顯表達有關。E 組 HIF-1α 高表達時 hAMSCs 成活率明顯升高，而 D 組 hAMSCs 成活率明顯下降，提示 HIF-1α 基因參與調控 hAMSCs 的成活能力。實驗結果還顯示，hAMSCs 成活率有時間依賴性，24 h 時明顯高于其他時間點，提示缺氧時間對 hAMSCs 成活率有干預作用。Western blot 結果顯示，在 E 組中 HIF-1α 和 VEGF 蛋白表達水平同步增加，而 D 組同步減少。表明 HIF-1α 表達上調的同時 VEGF 表達增多，促進新生血管生成，參與了 hAMSCs 成活能力的調節作用。
HIF-1α 還參與了細胞凋亡的調控，其機制主要是缺氧條件下促進 HIF-1α 表達，從而使 VEGF 上調，激活 PI3K-Akt 通路，增加細胞活性及血管通透性，降低細胞凋亡[18]。其中 PI3K-Akt-HIF 通路的激活促進抗凋亡因子（如 Bcl-2）表達，同時抑制促凋亡因子（如 Bax）的表達[19]。Bcl-2 和 Bax 是調節細胞凋亡的兩個重要相關基因，它們通過激活一系列下游基因在細胞凋亡中發揮作用。研究表明[20]在腦缺血再灌注損傷中，Bcl-2 過表達能抑制細胞凋亡，Bax 過表達可通過抑制 Bcl-2 的作用而促使細胞凋亡。Bcl-2/Bax 蛋白表達比例也是決定細胞凋亡的關鍵，當比例增大時細胞凋亡受抑制，反之則促進凋亡[21]。本實驗 Western blot 結果顯示，E 組 HIF-1α 蛋白表達增加的同時 Bcl-2 蛋白表達增加，Bax 蛋白表達降低，Bcl-2/Bax 比例變大，提示 HIF-1α 過表達對 hAMSCs 的 Bcl-2 和 Bax 表達水平具有明顯調節作用。干預 C-Caspase-3 的激活，可有效抑制細胞凋亡的發生[22]。E 組 HIF-1α 蛋白表達增加而 C-Caspase-3 蛋白表達降低，活性減弱，提示 HIF-1α 過表達對 C-Caspase-3 蛋白的表達水平具有調節作用。流式細胞儀檢測結果示，E 組 hAMSCs 凋亡率明顯降低，提示 HIF-1α 基因高表達可降低 hAMSCs 凋亡。上述結果表明，HIF-1α 表達上調同時 VEGF 表達也增多，可促進 Bcl-2 表達并抑制 Bax 表達，降低 C-Caspase-3 活性，從而增強 hAMSCs 抗凋亡能力。
綜上述，hAMSCs 缺氧處理后 HIF-1α 基因過表達可提高其細胞成活及抗凋亡能力，改善 hAMSCs 耐受缺氧的能力，其可能機制與上調 VEGF 和相關凋亡基因 Bcl-2 表達及下調 Bax 和 C-Caspase-3 表達作用相關。
人羊膜間充質干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）移植能促進脊髓損傷神經功能恢復，既往研究發現其主要通過提高 VEGF 和 BDNF 表達，促進血管和神經再生來改善脊髓損傷后神經功能的恢復[1]。近年研究發現，脊髓損傷動物模型體內移植 hAMSCs 后，hAMSCs 具有明顯的耐受缺氧能力，同時能顯著減少脊髓組織梗死和繼發性神經元的損傷[2-3]。這為采用 hAMSCs 移植治療脊髓損傷提供了新的理論依據。然而如何提高 hAMSCs 耐受缺氧的能力，目前少有報道。缺氧誘導因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）是目前發現的唯一一個高度特異性的、在缺氧條件下能夠發揮活性的核轉錄因子，是專一調節氧穩態的重要介質，同時參與調控 MSCs 增殖、凋亡和耐受缺氧等作用[4]。研究發現，HIF-1α 可提高 BMSCs 耐受缺氧的能力[5]。我們分析 HIF-1α 可能是調節 hAMSCs 耐受缺氧能力的重要轉錄因子之一。本研究通過轉染 HIF-1α 基因，觀察缺氧處理后 hAMSCs 的成活與凋亡情況，以探討 HIF-1α 基因對 hAMSCs 耐受缺氧能力的影響。
1 材料與方法
1.1 主要材料及試劑、儀器
羊膜組織取自錦州醫科大學附屬第一醫院 10 例健康剖宮產產婦，經醫院倫理委員會批準使用，產婦均知情同意。
膠原酶Ⅳ（Sigma 公司，美國）；兔抗人 HIF-1α 單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；兔抗人 B 細胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bax、活化型半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3，C-Caspase-3）多克隆抗體（Absci 公司，美國）；質粒（上海吉瑪制藥技術有限公司）；LipofectamineTM3000（Invitrogen 公司，美國）；實時熒光定量 PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）試劑盒（Dojindo 公司，日本）；AnnexinV-PE-7AAD 試劑盒（天津三箭生物技術股份有限公司）。CO2 培養箱（Thermo Fisher 公司，美國）；CKX-31 倒置相差顯微鏡、IX-71 倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Tecan Infinite M200 多功能酶標儀（Tecan 公司，瑞士）；實時熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）；流式細胞儀（Roche 公司，瑞士）。
1.2 hAMSCs 分離、培養及鑒定
參照文獻[6]報道的 hAMSCs 分離方法并加以改進。取羊膜組織，剪碎至約 1 mm×1 mm 大小，0.25% 胰蛋白酶消化 10 min 后，200 目細胞篩過濾，加入 1 mg/mL 膠原酶Ⅳ，37℃ 消化 1 h；再次過濾，濾液以離心半徑 25 cm、1 500 r/min 離心 5 min，重復 2 次，收集細胞。加入含 10%FBS、1% 青霉素/鏈霉素的 DMEM/F12 培養基，37℃、5%CO2 孵箱培養。3 d 后換液，之后隔天換液，約 10 d 細胞密度達 80%～90% 時進行傳代培養。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。取第 3 代 hAMSCs，參照文獻[7]方法采用免疫熒光法檢測干細胞標志物 OCT-4、NANOG 的表達。
1.3 實驗分組及方法
實驗分為 5 組：A 組為 hAMSCs 空白組，不進行任何處理；B 組為 pcDNA3.1 陰性對照組，細胞轉染 pcDNA3.1 過表達空載質粒；C 組為 shRNA 陰性對照組，細胞轉染 shRNA 干擾空載質粒；D 組為 shRNA-HIF-1α 干擾組，細胞轉染 shRNA-HIF-1α 干擾質粒；E 組為 pcDNA3.1-HIF-1α 過表達組，細胞轉染 pcDNA3.1-HIF-1α 過表達質粒。具體操作：參照文獻[8]方法，取第 3 代 hAMSCs，經 200 μmol/L CoCl2 缺氧處理 12、24、48 h 后，按以上分組瞬時轉染相應質粒，將質粒和 LipofectamineTM3000 復合物輕輕吹打混勻，均勻緩慢加入培養皿中，37℃、5%CO2 孵育 10 min，備用。
1.4 觀測指標
1.4.1 CCK-8 法檢測細胞成活率
各組分別于缺氧處理后 12、24、48 h，每孔加入 10 μL CCK-8 細胞計數試劑，37℃、5%CO2 孵育 4 h 后，于 540 nm 波長下測定各孔吸光度（A）值，按以下公式計算各組細胞成活率：各組 A 值/A 組 A 值。比較不同時間點處理后細胞成活率，選擇成活率最高的時間點細胞進行流式細胞術以及Western blot檢測。
1.4.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率
參照1.4.1觀測結果，各組取對應時間點細胞，消化、收集后調整細胞密度為 1×105個/mL，常規采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡率。
1.4.3 Western blot 檢測 HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Bax、C-Caspase-3 蛋白表達
參照1.4.1觀測結果，各組取對應時間點細胞消化、收集，冰上裂解、勻漿、離心、取上清棄沉淀、測定蛋白含量。等量蛋白（10 μg）樣本上樣，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，濕轉法至聚偏氟乙烯膜上，5% 牛血清白蛋白封閉 1 h；加入兔抗人 HIF-1α（1∶1 000）抗體，兔抗人 VEGF、Bcl-2、Bax、C-Caspase-3 抗體（1∶500），4℃ 孵育過夜，TBST 洗 3 次；加入山羊抗兔 IgG 二抗（1∶5 000）室溫孵育 2 h，TBST 漂洗；化學發光試劑 ECL 發光，顯影。以內參 β-actin 為對照，Gel-Pro Analyzer 軟件分析 HIF-1α 與 β-actin 的積分吸光度（IA）值的比值，表示 HIF-1α 蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hAMSCs 形態觀察及鑒定
培養 3 d，倒置相差顯微鏡下可見少量 hAMSCs 貼壁，呈長梭形，其中混雜有橢圓形人羊膜上皮細胞；7 d 后細胞開始增殖并形成細胞集落，呈放射狀或漩渦狀分布；14 d 后細胞達 80%～90% 融合。傳代后，細胞增殖速度加快，2～3 d 即可長滿培養瓶底；隨著傳代代數增加，細胞形態較一致，并呈漩渦狀或放射狀排列生長。見圖 1。
細胞免疫熒光法檢測示，細胞核中可見 OCT-4、NANOG 表達，提示所培養細胞為 hAMSCs。見圖 2。
2.2 hAMSCs 缺氧處理后相關觀測
2.2.1 CCK-8 法檢測細胞成活率
缺氧處理后 12、24、48 h，與 A、C 組比較，D 組細胞成活率明顯降低；與 A、B 組比較，E 組細胞成活率明顯升高；其中 24 h 時組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。E 組組內比較，與 12、48 h 比較，24 h 時細胞成活率明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），12、48 h 間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。根據比較結果，選擇缺氧處理后 24 h 細胞進行下一步檢測。
2.2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率
缺氧處理后 24 h，A～E 組細胞凋亡率分別為 2.80%±0.28%、3.75%±0.35%、3.60%±0.26%、8.56%±0.94%、1.90%±0.14%。與 A、C 組比較，D 組細胞凋亡率顯著升高，與 A、B 組比較，E 組細胞凋亡率顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
2.2.3 Western blot 檢測細胞各蛋白表達
缺氧處理后 24 h，與 A、C 組比較，D 組細胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表達明顯減少，Bax、C-Caspase-3 蛋白表達明顯增加，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；而 E 組結果相反，與 A、B 組比較，E 組細胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表達明顯增加，Bax、C-Caspase-3 蛋白表達明顯減少，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、6。
圖1
第 3 代 hAMSCs 形態觀察（倒置相差顯微鏡×10）
Figure1.
Morphological observation of the third generation hAMSCs (Inverted phase contrast microscope×10)
圖2
免疫熒光法鑒定 OCT-4、NANOG 在 hAMSCs 中的表達（熒光顯微鏡×20）
從左至右依次為 DAPI、FITC、二者重疊 a. OCT-4；b. NANOG
Figure2. Expressions of OCT-4 and NANOG in hAMSCs by immunofluorescence assay (Fluorescence microscope×20)From left to right for DAPI, FITC, and merge, respectively a. OCT-4; b. NANOG
圖3
CCK-8 法檢測各時間點各組細胞成活率
Figure3.
The survival rate of each group at different time points detected by CCK-8 method
圖4
流式細胞儀檢測各組缺氧處理后 24 h 細胞凋亡率
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure4. The apoptosis rate of cells at 24 hours after hypoxia treatment by flow cytometrya. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D;e. Group E
圖5
Western blot 檢測各組缺氧處理后 24 h 各蛋白表達
Mr：相對分子質量 1: A組 2：B組 3：C組 4：D組 5：E組 a. HIF-1α、VEGF；b. Bcl-2、Bax 和 C-Caspase-3
Figure5. Protein expressions of each group at 24 hours after hypoxia treatment by Western blotMr:Relative molecular mass1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group Ea. HIF-1α and VEGF; b. Bcl-2, Bax, and C-Caspase-3
圖6
Western blot 檢測各組缺氧處理后 24 h 各蛋白相對表達量
Figure6.
The relative expression of protein in each group at 24 hours after hypoxia treatment by Western blot
3 討論
hAMSCs 移植治療脊髓損傷成為近年研究熱點，主要原因是 hAMSCs 屬于多能干細胞，能調節機體免疫功能、避免同種異體移植的免疫排斥反應[9]，且其不具有成瘤性，安全性好[10]；同時，hAMSCs 在缺氧條件下具有更強的繁殖能力，在損傷的脊髓組織中能長期存活[11]。而 hAMSCs 繁殖和存活能力是治療脊髓損傷的關鍵因素之一。hAMSCs 繁殖和存活能力主要與 MSCs 的耐受缺氧能力相關[12]。研究證實在缺氧條件下，MSCs 氧自由基減少，對細胞的破壞作用降低或減弱，同時持續 HIF-1α 的表達并誘導相關生長因子表達，促進缺氧區域新生血管形成，增加細胞對缺氧的耐受能力[13]。
HIF-1α 是調控缺氧效應的一類極為重要的轉錄因子，其分布和作用十分廣泛，可通過調控下游靶基因來增強 MSCs 對缺氧的耐受性[14]。VEGF 是目前最強的促血管生成因子，也是 HIF-1α 重要的靶基因。已有研究證實 VEGF 具有抗凋亡和促進血管新生的作用[15]。在腦缺血動物模型中發現，缺血區 HIF-1α 表達上調的同時 VEGF 表達亦增加，從而促進血管生成來對抗缺血缺氧性損傷；而通過實驗干預減少 HIF-1α 的降解，則能誘導 VEGF 表達上調，減少神經細胞凋亡，促進新生血管形成，增強細胞耐受缺氧能力[16-17]。本實驗對 hAMSCs 缺氧處理后檢測各組細胞成活率，發現 A 組高于 B、C 組，這可能與 B、C 組 hAMSCs 受損程度及 HIF-1α 未明顯表達有關。E 組 HIF-1α 高表達時 hAMSCs 成活率明顯升高，而 D 組 hAMSCs 成活率明顯下降，提示 HIF-1α 基因參與調控 hAMSCs 的成活能力。實驗結果還顯示，hAMSCs 成活率有時間依賴性，24 h 時明顯高于其他時間點，提示缺氧時間對 hAMSCs 成活率有干預作用。Western blot 結果顯示，在 E 組中 HIF-1α 和 VEGF 蛋白表達水平同步增加，而 D 組同步減少。表明 HIF-1α 表達上調的同時 VEGF 表達增多，促進新生血管生成，參與了 hAMSCs 成活能力的調節作用。
HIF-1α 還參與了細胞凋亡的調控，其機制主要是缺氧條件下促進 HIF-1α 表達，從而使 VEGF 上調，激活 PI3K-Akt 通路，增加細胞活性及血管通透性，降低細胞凋亡[18]。其中 PI3K-Akt-HIF 通路的激活促進抗凋亡因子（如 Bcl-2）表達，同時抑制促凋亡因子（如 Bax）的表達[19]。Bcl-2 和 Bax 是調節細胞凋亡的兩個重要相關基因，它們通過激活一系列下游基因在細胞凋亡中發揮作用。研究表明[20]在腦缺血再灌注損傷中，Bcl-2 過表達能抑制細胞凋亡，Bax 過表達可通過抑制 Bcl-2 的作用而促使細胞凋亡。Bcl-2/Bax 蛋白表達比例也是決定細胞凋亡的關鍵，當比例增大時細胞凋亡受抑制，反之則促進凋亡[21]。本實驗 Western blot 結果顯示，E 組 HIF-1α 蛋白表達增加的同時 Bcl-2 蛋白表達增加，Bax 蛋白表達降低，Bcl-2/Bax 比例變大，提示 HIF-1α 過表達對 hAMSCs 的 Bcl-2 和 Bax 表達水平具有明顯調節作用。干預 C-Caspase-3 的激活，可有效抑制細胞凋亡的發生[22]。E 組 HIF-1α 蛋白表達增加而 C-Caspase-3 蛋白表達降低，活性減弱，提示 HIF-1α 過表達對 C-Caspase-3 蛋白的表達水平具有調節作用。流式細胞儀檢測結果示，E 組 hAMSCs 凋亡率明顯降低，提示 HIF-1α 基因高表達可降低 hAMSCs 凋亡。上述結果表明，HIF-1α 表達上調同時 VEGF 表達也增多，可促進 Bcl-2 表達并抑制 Bax 表達，降低 C-Caspase-3 活性，從而增強 hAMSCs 抗凋亡能力。
綜上述，hAMSCs 缺氧處理后 HIF-1α 基因過表達可提高其細胞成活及抗凋亡能力，改善 hAMSCs 耐受缺氧的能力，其可能機制與上調 VEGF 和相關凋亡基因 Bcl-2 表達及下調 Bax 和 C-Caspase-3 表達作用相關。
