引用本文： 徐萬林, 盧浩, 葉金海, 楊雯君. 載 VEGF165 多孔聚己內酯支架促進脂肪來源干細胞體內外成骨分化的實驗研究 . 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(3): 270-275. doi: 10.7507/1002-1892.201710064 復制
對于創傷、腫瘤切除術后、先天發育畸形等因素造成的骨缺損及骨愈合不全，臨床常采用自體骨移植、同種異體骨移植及鈦板等生物材料植入修復，但這些治療方式均存在著一定缺陷。隨著材料學及生物學的發展，組織工程骨有望成為修復重建骨缺損的理想方式[1-2]。作為組織工程三大核心要素之一的支架材料，在組織工程骨形成過程中起著重要作用，包括提供骨修復結構、負載種子細胞、傳遞生物活性物質等。聚己內酯 ［poly（ε-caprolactone），PCL］因其優越的生物相容性、可降解性及良好的物理性能，成為目前研究較多的支架材料之一[3-4]。細胞因子是構建組織工程骨的另一個重要因素，目前已有大量細胞因子被證實與成骨作用密切相關，包括 BMP-2[5-6]、FGF-2[7]、VEGF[6, 8]等。其中 VEGF，特別是 VEGF165 異構體，具有較強的促進成骨成血管作用[9-10]。本研究運用溶劑置換法、粒子浸出法及熱致相分離法制備載 VEGF165 多孔 PCL 支架，復合脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）后進行體外培養，并將細胞-支架復合體植入大鼠顱骨缺損模型內，以探討 VEGF 對 ADSCs 體內、外成骨分化的作用。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6 周齡雌性 SPF 級 SD 大鼠 15 只，體質量 100～200 g，供提取 ADSCs；成年雄性 SPF 級 SD 大鼠 6 只，體質量 350～400 g，供體內動物實驗；實驗動物均由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。明膠（上海晶純生化科技股份有限公司）；京尼平（南京道斯夫生物科技有限公司）；重組人 VEGF165（recombinant human VEGF165，rhVEGF165）、VEGF-ELISA 試劑盒（R&D 公司，美國）；茜素紅、氯化十六烷吡啶（Sigma 公司，美國）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；PrimeScript RT 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa 公司，日本）。JSM-6360LV 掃描電鏡（Jeol 公司，日本）；實時熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems 公司，美國）；Micro-CT（Scanco Medical 公司，瑞士）。
1.2 載 VEGF165 多孔 PCL 支架制備及檢測
1.2.1 多孔 PCL 支架制備
參考文獻[11]報道方法制備多孔 PCL 支架。然后使用含 0.02% 京尼平的 5% 明膠溶液作為支架交聯劑，制備明膠修飾的多孔 PCL 支架（記為 Sf-g）。另在明膠溶液中加入濃度為 1 μg/mL 的 rhVEGF165，將多孔 PCL 支架浸于其中，在室溫下引入負壓使溶液充分進入支架內部，然后真空干燥制得載 VEGF165 多孔 PCL 支架（記為 Sf-g/VEGF）。
1.2.2 Sf-g/VEGF 支架觀測
① 掃描電鏡觀察：取 Sf-g/VEGF 經液氮冷凍處理后進行脆斷，將其置于鋁板上，脆斷面朝上進行噴金處理，掃描電鏡觀察支架的表面形貌。②VEGF 釋放率測定：取 Sf-g/VEGF 采用 ELISA 法測算累積釋放率，公式為：
 |
其中，W釋放 為采用 ELISA 試劑盒測量的支架釋放的 VEGF165 量；W負載 是指支架中載入的 VEGF165 量，計算方法如下：
 |
其中，W濕支架 是指支架的濕重，W干支架 指支架的干重，W水、W明膠、W京尼平、WVEGF 分別指水、明膠、京尼平及 VEGF 含量。實驗重復 3 次，取均值。
1.3 細胞-支架復合體制備及觀測
1.3.1 細胞-支架復合體制備
取 15 只 SPF 級 SD 大鼠腹股溝脂肪，參考本課題組前期報道的實驗方法[12]分離培養 ADSCs 并傳代，取第 3～4 代細胞進行后續實驗。取 Sf-g 及 Sf-g/VEGF 兩種支架，經乙醇浸泡、紫外線照射消毒后，首先置于完全培養基中浸泡 24 h。將 20 μL 密度為 1×106個/mL 的單細胞懸液滴種于支架上，于 37℃、5%CO2 濃度培養箱中體外培養 2 h，以保證細胞在支架上的黏附。然后將細胞-支架復合體置于成骨誘導液中，于 37℃、5%CO2 濃度培養箱中培養 7 d 后進行觀測。
1.3.2 細胞-支架復合體觀測
① 茜素紅染色觀察：取出兩種細胞-支架復合體置于 95% 乙醇固定，然后 1% 茜素紅染液室溫下染色 30 min，沖洗 2 遍，拍照記錄。然后以 10% 氯化十六烷吡啶溶液洗脫支架中鈣結節，采用酶標儀在 520 nm 波長下測量吸光度（A）值表示茜素紅活性。實驗重復 3 次。
② 實時熒光定量 PCR 檢測：采用 Trizol 進行裂解以提取細胞總 RNA，使用 PrimeScript RT 試劑盒進行逆轉錄反應。以 GAPDH 為內參，檢測成骨特異性指標特異 AT 序列結合蛋白 2（special AT-rich sequence protein 2，Satb2）、ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）mRNA 相對表達量。所有 PCR 引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下：GAPDH，上游：5′-AAGAAACCCTGGACCACCCAGC-3′，下游：5′-TGGTATTCGAGAGAAGGGAGGG-3′；Satb2，上游：5′-CACAGCTGCCATTTATGACGAGA-3′，下游：5′-CTTCCAACGAAGCAGTTCACAGAG-3′；ALP，上游：5′-TCATGTTCCTGGGAGATGGTATG-3′，下游：5′-GCATTAGCTGATAGGCGATGTCC-3′；OCN，上游：5′-TGCAAAGCCCAGCGACTCT-3′，下游：5′-TTGAGCTCACACACCTCCCTGT-3′；OPN，上游：5′-GCCGAGGTGATAGCTTGGCTTA-3′，下游：5′-TTGATAGCCTCATCGGACTCCTG-3′。
1.4 動物體內實驗
1.4.1 實驗分組及方法
取 SPF 級 SD 大鼠 6 只，腹腔注射苯巴比妥（3.5 mg/100 g），在顱骨表面皮膚作切口，暴露顱骨，并以低速齒科鉆在顱骨左、右側各作一直徑為 5 mm 的缺損。將 12 處缺損隨機分為 3 組（n=4），陰性對照組不作任何處理，Sf-g 組植入細胞-Sf-g 支架復合體，Sf-g/VEGF 組植入細胞-Sf-g/VEGF 支架復合體。8 周后取出含細胞-支架復合體的顱骨進行觀測。
1.4.2 觀測指標
① Micro-CT 掃描：將顱骨進行 Micro-CT 掃描，為避免掃描過程中樣本移位，在樣本周圍放置泡沫墊固定。具體參數設置如下：圖像分辨率 1 024×1 024，層間距 20 μm。CT 值高于 225 定為骨組織，測量新生骨體積。② 組織學觀察：Micro-CT 掃描后對樣本進行常規脫鈣、包埋、脫蠟制片，HE 染色，光鏡下觀察。每個標本隨機選取 5 個不重復視野進行觀察，通過 Image-Pro plus 6.0 軟件進行圖像分析測定新生骨面積。以未植入體內的兩種支架作為對照。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Sf-g/VEGF 支架觀測
大體觀察，制備的 Sf-g/VEGF 支架呈淡藍色（圖 1a）。掃描電鏡下，可見 Sf-g/VEGF 支架呈多孔結構（圖 1b）。通過藥物釋放實驗繪制的 VEGF 釋放曲線見圖 1c。VEGF 的釋放曲線呈二階段釋放，120 h 累積釋放率為 80%；前 12 h 內（一階段）約有 35%VEGF 突釋出來，隨后 108 h 內（二階段）約有 45%VEGF 緩慢釋放。提示通過溶劑置換法、粒子浸出法及熱致相分離法可成功制備載 VEGF165 的多孔 PCL 支架。
圖1
Sf-g/VEGF 支架觀測
a. 大體觀察；b. 掃描電鏡；c. VEGF 釋放曲線
Figure1. Observation of the Sf-g/VEGF scaffoldsa. Gross morphological observation; b. SEM observation; c. The release curve of the VEGF protein
2.2 細胞-支架復合體觀測
體外培養 7 d 后茜素紅染色顯示，Sf-g/VEGF 染色較 Sf-g 深（圖 2a），且茜素紅活性半定量檢測顯示，Sf-g/VEGF 組 A 值為 2.273±0.162，顯著高于 Sf-g 組的 0.980±0.131，比較差異有統計學意義（t=10.761，P=0.000）。
實時熒光定量 PCR 檢測，Sf-g/VEGF 組 Satb2、ALP、OCN 和 OPN mRNA 相對表達量均較 Sf-g 組升高，分別上調了約 2.413、3.212、2.117 及 4.026 倍，比較差異有統計學意義（t=6.796，P=0.002；t=14.789，P=0.000；t=6.969，P=0.002；t=11.272，P=0.000）。見圖 2b。
圖2
細胞-支架復合體觀察
a. 茜素紅染色，左側為 Sf-g、右側為 Sf-g/VEGF；b. 兩組 Satb2、ALP、OCN 和 OPN mRNA 相對表達量比較
Figure2. Observation of the ADSCs-scaffold complexa. The ARS staining of the Sf-g (left) and Sf-g/VEGF (right); b. The mRNA relative expressions of Satb2, ALP, OCN, and OPN in 2 groups
2.3 動物體內實驗
術后 8 周 Micro-CT 掃描顯示，陰性對照組僅在缺損邊緣見極少量點狀阻射影，未測量新生骨量。Sf-g 組骨缺損區域部分被修復，而 Sf-g/VEGF 組骨缺損修復區域明顯較 Sf-g 組增多（圖 3a、b）；Sf-g 組、Sf-g/VEGF 組新生骨體積分別為（1.933±0.170）、（3.967±0.205）mm3，Sf-g/VEGF 組顯著高于 Sf-g 組，比較差異有統計學意義（t=15.210，P=0.000）。
組織學觀察示，未植入體內的 Sf-g、Sf-g/VEGF 支架均呈多孔結構；植入體內 8 周后，Sf-g 組支架邊緣可見少量新生骨質形成，而 Sf-g/VEGF 組支架中可見較多新生骨（圖 3 c、d）。Sf-g/VEGF 組新生骨面積為 19.445%±2.579%，顯著高于 Sf-g 組的 8.367%±0.723%，比較差異有統計學意義（t=10.131，P=0.000）。
圖3
細胞-支架復合體體內植入后觀察
a. Micro-CT 掃描冠狀面圖像 從左至右分別為陰性對照組、Sf-g 組、Sf-g/VEGF 組；b. Micro-CT 掃描矢狀面圖像 從左至右分別為陰性對照組、Sf-g 組、Sf-g/VEGF 組; c. 兩組支架植入體內前 HE 染色（×100） 左側為 Sf-g 組、右側為 Sf-g/VEGF 組；d. 兩組支架植入體內 8 周時 HE 染色（×100） 左側為 Sf-g 組、右側為 Sf-g/VEGF 組
Figure3. Radiological and histological observations of the ADSCs-scaffold complex at 8 weeks after transplantation in vivoa. Image of coronal sections by Micro-CT From left to right for negative control group, Sf-g group, and Sf-g/VEGF group; b. Image of sagittal sections by Micro-CT From left to right for negative control group, Sf-g group, and Sf-g/VEGF group; c. HE staining of Sf-g group (left) and Sf-g/VEGF group (right) before transplantation (×100); d. HE staining of Sf-g group (left) and Sf-g/VEGF group (right) at 8 weeks after transplantation (×100)
3 討論
本研究通過溶劑置換法、粒子浸出法及熱致相分離法，成功制備多孔 PCL 支架，多孔結構既方便了細胞的黏附，又利于支架內外氧氣等營養物質的交換，符合骨組織工程對支架材料的要求。而單純的多孔 PCL 支架親水性較差，故本研究中引入了明膠體系改善其親水性，同時明膠溶液可包裹 VEGF 蛋白進入支架內部，形成最終的載 VEGF165 的多孔 PCL 支架。本方法制備的 Sf-g/VEGF 支架呈淡藍色，這是交聯劑京尼平交聯后所致。藥物釋放實驗提示，我們所構建的 Sf-g/VEGF 支架呈二階段釋藥性質，分析原因為第 1 階段釋放的 VEGF 主要是黏附在支架表面及未被明膠成功包裹的 VEGF，在振蕩培養后，從支架中快速地釋放出來，形成類似于突釋現象；第 2 階段釋放的 VEGF 則主要是隨著明膠發生降解，被明膠包被的 VEGF 蛋白從支架中逐漸釋放出來。這與 Singh 等[13]報道的膠原包被的多孔 PCL 支架的釋藥性能一致。同時，本課題組前期研究結果表明，經明膠包被后的支架，其物理性能得到進一步改善，壓縮強度較未交聯前增強，使得支架中新生骨質強度更接近天然骨質[12]。
組織工程骨的再生是多種因素共同作用的結果，其中包括具有生物活性的細胞因子的調節作用。VEGF 是成血管過程中非常重要的調節因子[14]，而成骨與成血管是一個相互耦合的過程，在成骨過程中必定有新生血管的形成[8, 15-16]。Leach 等[17]研究發現，載 VEGF 的生物玻璃支架可促進血管化及骨化，最終促進了大鼠顱骨缺損模型的修復。Hu 等[18]研究發現，在骨缺損修復過程中 VEGF 可能在多個階段發揮重要作用，包括在炎癥期 VEGF 促進巨噬細胞的募集及成血管反應，膜內成骨時同樣需要 VEGF 的參與以促進骨質新生。Proksch 等[19]發現間充質細胞來源的 VEGF 可促進牙槽骨中成骨細胞的骨向分化，從而促進了牙槽骨修復。以上研究結果均證實了 VEGF 在成骨過程中具有促進作用。本研究中，體外茜素紅染色及半定量分析提示，VEGF 復合后的支架利于 ADSCs 的成骨分化，Sf-g/VEGF 組中成骨特異性指標 Satb2、ALP、OCN 和 OPN mRNA 相對表達量較 Sf-g 組顯著上調。更進一步，體內實驗 Micro-CT 與 HE 染色結果均顯示 Sf-g/VEGF 支架可促進 ADSCs 成骨分化。
本研究的不足之處在于在檢測成骨指標的同時未檢測成血管相關指標，無法說明 VEGF 的促成骨作用是直接誘導 ADSCs 成骨分化，還是間接通過誘導成血管從而促進成骨作用。此外，有研究報道 VEGF 與細胞的增殖[20]、自噬[21]等生物學行為相關，但本研究中支架所釋放出的 VEGF 對 ADSCs 除促進成骨分化外，是否存在其他作用尚未明確，需要在后期研究中進一步探索。
綜上述，本研究成功構建載 VEGF165 的多孔 PCL 支架，并證實 VEGF 蛋白的釋放可促進 ADSCs 的體內外成骨分化，為構建質量更佳的組織工程骨及用于臨床修復骨缺損奠定理論基礎。
對于創傷、腫瘤切除術后、先天發育畸形等因素造成的骨缺損及骨愈合不全，臨床常采用自體骨移植、同種異體骨移植及鈦板等生物材料植入修復，但這些治療方式均存在著一定缺陷。隨著材料學及生物學的發展，組織工程骨有望成為修復重建骨缺損的理想方式[1-2]。作為組織工程三大核心要素之一的支架材料，在組織工程骨形成過程中起著重要作用，包括提供骨修復結構、負載種子細胞、傳遞生物活性物質等。聚己內酯 ［poly（ε-caprolactone），PCL］因其優越的生物相容性、可降解性及良好的物理性能，成為目前研究較多的支架材料之一[3-4]。細胞因子是構建組織工程骨的另一個重要因素，目前已有大量細胞因子被證實與成骨作用密切相關，包括 BMP-2[5-6]、FGF-2[7]、VEGF[6, 8]等。其中 VEGF，特別是 VEGF165 異構體，具有較強的促進成骨成血管作用[9-10]。本研究運用溶劑置換法、粒子浸出法及熱致相分離法制備載 VEGF165 多孔 PCL 支架，復合脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）后進行體外培養，并將細胞-支架復合體植入大鼠顱骨缺損模型內，以探討 VEGF 對 ADSCs 體內、外成骨分化的作用。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6 周齡雌性 SPF 級 SD 大鼠 15 只，體質量 100～200 g，供提取 ADSCs；成年雄性 SPF 級 SD 大鼠 6 只，體質量 350～400 g，供體內動物實驗；實驗動物均由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。明膠（上海晶純生化科技股份有限公司）；京尼平（南京道斯夫生物科技有限公司）；重組人 VEGF165（recombinant human VEGF165，rhVEGF165）、VEGF-ELISA 試劑盒（R&D 公司，美國）；茜素紅、氯化十六烷吡啶（Sigma 公司，美國）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；PrimeScript RT 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa 公司，日本）。JSM-6360LV 掃描電鏡（Jeol 公司，日本）；實時熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems 公司，美國）；Micro-CT（Scanco Medical 公司，瑞士）。
1.2 載 VEGF165 多孔 PCL 支架制備及檢測
1.2.1 多孔 PCL 支架制備
參考文獻[11]報道方法制備多孔 PCL 支架。然后使用含 0.02% 京尼平的 5% 明膠溶液作為支架交聯劑，制備明膠修飾的多孔 PCL 支架（記為 Sf-g）。另在明膠溶液中加入濃度為 1 μg/mL 的 rhVEGF165，將多孔 PCL 支架浸于其中，在室溫下引入負壓使溶液充分進入支架內部，然后真空干燥制得載 VEGF165 多孔 PCL 支架（記為 Sf-g/VEGF）。
1.2.2 Sf-g/VEGF 支架觀測
① 掃描電鏡觀察：取 Sf-g/VEGF 經液氮冷凍處理后進行脆斷，將其置于鋁板上，脆斷面朝上進行噴金處理，掃描電鏡觀察支架的表面形貌。②VEGF 釋放率測定：取 Sf-g/VEGF 采用 ELISA 法測算累積釋放率，公式為：
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其中，W釋放 為采用 ELISA 試劑盒測量的支架釋放的 VEGF165 量；W負載 是指支架中載入的 VEGF165 量，計算方法如下：
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其中，W濕支架 是指支架的濕重，W干支架 指支架的干重，W水、W明膠、W京尼平、WVEGF 分別指水、明膠、京尼平及 VEGF 含量。實驗重復 3 次，取均值。
1.3 細胞-支架復合體制備及觀測
1.3.1 細胞-支架復合體制備
取 15 只 SPF 級 SD 大鼠腹股溝脂肪，參考本課題組前期報道的實驗方法[12]分離培養 ADSCs 并傳代，取第 3～4 代細胞進行后續實驗。取 Sf-g 及 Sf-g/VEGF 兩種支架，經乙醇浸泡、紫外線照射消毒后，首先置于完全培養基中浸泡 24 h。將 20 μL 密度為 1×106個/mL 的單細胞懸液滴種于支架上，于 37℃、5%CO2 濃度培養箱中體外培養 2 h，以保證細胞在支架上的黏附。然后將細胞-支架復合體置于成骨誘導液中，于 37℃、5%CO2 濃度培養箱中培養 7 d 后進行觀測。
1.3.2 細胞-支架復合體觀測
① 茜素紅染色觀察：取出兩種細胞-支架復合體置于 95% 乙醇固定，然后 1% 茜素紅染液室溫下染色 30 min，沖洗 2 遍，拍照記錄。然后以 10% 氯化十六烷吡啶溶液洗脫支架中鈣結節，采用酶標儀在 520 nm 波長下測量吸光度（A）值表示茜素紅活性。實驗重復 3 次。
② 實時熒光定量 PCR 檢測：采用 Trizol 進行裂解以提取細胞總 RNA，使用 PrimeScript RT 試劑盒進行逆轉錄反應。以 GAPDH 為內參，檢測成骨特異性指標特異 AT 序列結合蛋白 2（special AT-rich sequence protein 2，Satb2）、ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）mRNA 相對表達量。所有 PCR 引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下：GAPDH，上游：5′-AAGAAACCCTGGACCACCCAGC-3′，下游：5′-TGGTATTCGAGAGAAGGGAGGG-3′；Satb2，上游：5′-CACAGCTGCCATTTATGACGAGA-3′，下游：5′-CTTCCAACGAAGCAGTTCACAGAG-3′；ALP，上游：5′-TCATGTTCCTGGGAGATGGTATG-3′，下游：5′-GCATTAGCTGATAGGCGATGTCC-3′；OCN，上游：5′-TGCAAAGCCCAGCGACTCT-3′，下游：5′-TTGAGCTCACACACCTCCCTGT-3′；OPN，上游：5′-GCCGAGGTGATAGCTTGGCTTA-3′，下游：5′-TTGATAGCCTCATCGGACTCCTG-3′。
1.4 動物體內實驗
1.4.1 實驗分組及方法
取 SPF 級 SD 大鼠 6 只，腹腔注射苯巴比妥（3.5 mg/100 g），在顱骨表面皮膚作切口，暴露顱骨，并以低速齒科鉆在顱骨左、右側各作一直徑為 5 mm 的缺損。將 12 處缺損隨機分為 3 組（n=4），陰性對照組不作任何處理，Sf-g 組植入細胞-Sf-g 支架復合體，Sf-g/VEGF 組植入細胞-Sf-g/VEGF 支架復合體。8 周后取出含細胞-支架復合體的顱骨進行觀測。
1.4.2 觀測指標
① Micro-CT 掃描：將顱骨進行 Micro-CT 掃描，為避免掃描過程中樣本移位，在樣本周圍放置泡沫墊固定。具體參數設置如下：圖像分辨率 1 024×1 024，層間距 20 μm。CT 值高于 225 定為骨組織，測量新生骨體積。② 組織學觀察：Micro-CT 掃描后對樣本進行常規脫鈣、包埋、脫蠟制片，HE 染色，光鏡下觀察。每個標本隨機選取 5 個不重復視野進行觀察，通過 Image-Pro plus 6.0 軟件進行圖像分析測定新生骨面積。以未植入體內的兩種支架作為對照。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Sf-g/VEGF 支架觀測
大體觀察，制備的 Sf-g/VEGF 支架呈淡藍色（圖 1a）。掃描電鏡下，可見 Sf-g/VEGF 支架呈多孔結構（圖 1b）。通過藥物釋放實驗繪制的 VEGF 釋放曲線見圖 1c。VEGF 的釋放曲線呈二階段釋放，120 h 累積釋放率為 80%；前 12 h 內（一階段）約有 35%VEGF 突釋出來，隨后 108 h 內（二階段）約有 45%VEGF 緩慢釋放。提示通過溶劑置換法、粒子浸出法及熱致相分離法可成功制備載 VEGF165 的多孔 PCL 支架。
圖1
Sf-g/VEGF 支架觀測
a. 大體觀察；b. 掃描電鏡；c. VEGF 釋放曲線
Figure1. Observation of the Sf-g/VEGF scaffoldsa. Gross morphological observation; b. SEM observation; c. The release curve of the VEGF protein
2.2 細胞-支架復合體觀測
體外培養 7 d 后茜素紅染色顯示，Sf-g/VEGF 染色較 Sf-g 深（圖 2a），且茜素紅活性半定量檢測顯示，Sf-g/VEGF 組 A 值為 2.273±0.162，顯著高于 Sf-g 組的 0.980±0.131，比較差異有統計學意義（t=10.761，P=0.000）。
實時熒光定量 PCR 檢測，Sf-g/VEGF 組 Satb2、ALP、OCN 和 OPN mRNA 相對表達量均較 Sf-g 組升高，分別上調了約 2.413、3.212、2.117 及 4.026 倍，比較差異有統計學意義（t=6.796，P=0.002；t=14.789，P=0.000；t=6.969，P=0.002；t=11.272，P=0.000）。見圖 2b。
圖2
細胞-支架復合體觀察
a. 茜素紅染色，左側為 Sf-g、右側為 Sf-g/VEGF；b. 兩組 Satb2、ALP、OCN 和 OPN mRNA 相對表達量比較
Figure2. Observation of the ADSCs-scaffold complexa. The ARS staining of the Sf-g (left) and Sf-g/VEGF (right); b. The mRNA relative expressions of Satb2, ALP, OCN, and OPN in 2 groups
2.3 動物體內實驗
術后 8 周 Micro-CT 掃描顯示，陰性對照組僅在缺損邊緣見極少量點狀阻射影，未測量新生骨量。Sf-g 組骨缺損區域部分被修復，而 Sf-g/VEGF 組骨缺損修復區域明顯較 Sf-g 組增多（圖 3a、b）；Sf-g 組、Sf-g/VEGF 組新生骨體積分別為（1.933±0.170）、（3.967±0.205）mm3，Sf-g/VEGF 組顯著高于 Sf-g 組，比較差異有統計學意義（t=15.210，P=0.000）。
組織學觀察示，未植入體內的 Sf-g、Sf-g/VEGF 支架均呈多孔結構；植入體內 8 周后，Sf-g 組支架邊緣可見少量新生骨質形成，而 Sf-g/VEGF 組支架中可見較多新生骨（圖 3 c、d）。Sf-g/VEGF 組新生骨面積為 19.445%±2.579%，顯著高于 Sf-g 組的 8.367%±0.723%，比較差異有統計學意義（t=10.131，P=0.000）。
圖3
細胞-支架復合體體內植入后觀察
a. Micro-CT 掃描冠狀面圖像 從左至右分別為陰性對照組、Sf-g 組、Sf-g/VEGF 組；b. Micro-CT 掃描矢狀面圖像 從左至右分別為陰性對照組、Sf-g 組、Sf-g/VEGF 組; c. 兩組支架植入體內前 HE 染色（×100） 左側為 Sf-g 組、右側為 Sf-g/VEGF 組；d. 兩組支架植入體內 8 周時 HE 染色（×100） 左側為 Sf-g 組、右側為 Sf-g/VEGF 組
Figure3. Radiological and histological observations of the ADSCs-scaffold complex at 8 weeks after transplantation in vivoa. Image of coronal sections by Micro-CT From left to right for negative control group, Sf-g group, and Sf-g/VEGF group; b. Image of sagittal sections by Micro-CT From left to right for negative control group, Sf-g group, and Sf-g/VEGF group; c. HE staining of Sf-g group (left) and Sf-g/VEGF group (right) before transplantation (×100); d. HE staining of Sf-g group (left) and Sf-g/VEGF group (right) at 8 weeks after transplantation (×100)
3 討論
本研究通過溶劑置換法、粒子浸出法及熱致相分離法，成功制備多孔 PCL 支架，多孔結構既方便了細胞的黏附，又利于支架內外氧氣等營養物質的交換，符合骨組織工程對支架材料的要求。而單純的多孔 PCL 支架親水性較差，故本研究中引入了明膠體系改善其親水性，同時明膠溶液可包裹 VEGF 蛋白進入支架內部，形成最終的載 VEGF165 的多孔 PCL 支架。本方法制備的 Sf-g/VEGF 支架呈淡藍色，這是交聯劑京尼平交聯后所致。藥物釋放實驗提示，我們所構建的 Sf-g/VEGF 支架呈二階段釋藥性質，分析原因為第 1 階段釋放的 VEGF 主要是黏附在支架表面及未被明膠成功包裹的 VEGF，在振蕩培養后，從支架中快速地釋放出來，形成類似于突釋現象；第 2 階段釋放的 VEGF 則主要是隨著明膠發生降解，被明膠包被的 VEGF 蛋白從支架中逐漸釋放出來。這與 Singh 等[13]報道的膠原包被的多孔 PCL 支架的釋藥性能一致。同時，本課題組前期研究結果表明，經明膠包被后的支架，其物理性能得到進一步改善，壓縮強度較未交聯前增強，使得支架中新生骨質強度更接近天然骨質[12]。
組織工程骨的再生是多種因素共同作用的結果，其中包括具有生物活性的細胞因子的調節作用。VEGF 是成血管過程中非常重要的調節因子[14]，而成骨與成血管是一個相互耦合的過程，在成骨過程中必定有新生血管的形成[8, 15-16]。Leach 等[17]研究發現，載 VEGF 的生物玻璃支架可促進血管化及骨化，最終促進了大鼠顱骨缺損模型的修復。Hu 等[18]研究發現，在骨缺損修復過程中 VEGF 可能在多個階段發揮重要作用，包括在炎癥期 VEGF 促進巨噬細胞的募集及成血管反應，膜內成骨時同樣需要 VEGF 的參與以促進骨質新生。Proksch 等[19]發現間充質細胞來源的 VEGF 可促進牙槽骨中成骨細胞的骨向分化，從而促進了牙槽骨修復。以上研究結果均證實了 VEGF 在成骨過程中具有促進作用。本研究中，體外茜素紅染色及半定量分析提示，VEGF 復合后的支架利于 ADSCs 的成骨分化，Sf-g/VEGF 組中成骨特異性指標 Satb2、ALP、OCN 和 OPN mRNA 相對表達量較 Sf-g 組顯著上調。更進一步，體內實驗 Micro-CT 與 HE 染色結果均顯示 Sf-g/VEGF 支架可促進 ADSCs 成骨分化。
本研究的不足之處在于在檢測成骨指標的同時未檢測成血管相關指標，無法說明 VEGF 的促成骨作用是直接誘導 ADSCs 成骨分化，還是間接通過誘導成血管從而促進成骨作用。此外，有研究報道 VEGF 與細胞的增殖[20]、自噬[21]等生物學行為相關，但本研究中支架所釋放出的 VEGF 對 ADSCs 除促進成骨分化外，是否存在其他作用尚未明確，需要在后期研究中進一步探索。
綜上述，本研究成功構建載 VEGF165 的多孔 PCL 支架，并證實 VEGF 蛋白的釋放可促進 ADSCs 的體內外成骨分化，為構建質量更佳的組織工程骨及用于臨床修復骨缺損奠定理論基礎。
