引用本文： 彭建強, 黃年盛, 黃勝, 李亮平, 凌澤民, 靳松, 黃愛軍, 林昆, 鄒學農. H2O2 下調 miR-21 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化影響的研究 . 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(3): 276-284. doi: 10.7507/1002-1892.201707030 復制
目前，如何提高骨修復材料的修復效率仍是骨組織工程面臨的重要問題。骨修復過程包括 MSCs 的招募、增殖、成骨分化等，其過程十分復雜，并且受生長因子、激素及細胞外基質等的調控[1-2]。在骨折局部及骨修復材料植入早期，局部 MSCs 可因組織缺血再灌注后發生低氧應激、氧化應激[3-4]。Chen 等[5]發現在豬腰椎融合模型中，microRNAs 對骨形成起到重要調控作用。microRNAs 是一類非編碼小 RNA 分子，通過裂解靶基因或抑制翻譯調控細胞增殖、分化、凋亡等生物活動。多項研究表明，在 H2O2 模擬的氧化應激模型中，H2O2 可調控 miR-21 表達，從而抑制細胞凋亡[6-8]，磷酸酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）在許多細胞系中為 miR-21 的靶基因，同樣受 H2O2 調控[6]。同時，miR-21 及 PTEN 在 MSCs 成骨分化方面有著重要調控作用[9-10]。因此，在骨修復材料植入早期，局部 MSCs 氧化應激狀態下，H2O2 可能通過調控 miR-21 影響細胞成骨分化。MC3T3-E1 細胞（小鼠顱頂前成骨細胞）由 MSCs 分化而來，是骨形成的關鍵細胞。本研究旨在觀察 H2O2 處理后的 MC3T3-E1 細胞，探索氧化應激狀態下 miR-21 表達及其對 MC3T3-E1 成骨分化的作用及機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
MC3T3-E1 細胞系由美國 ATCC 細胞庫提供；α-MEM 培養基（HyClone 公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；Trizol 試劑（Invitrogen 公司，美國）；MTS（上海碧云天生物技術有限公司）；PBS、H2O2、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒（Sigma 公司，美國）；氯仿、異丙醇（廣州化學試劑廠）；逆轉錄試劑盒、實時定量 PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；PTEN 抗體（Abcam 公司，英國）；轉染試劑 miR-21 抑制劑、miR-21 抑制劑陰性對照、siRNA-PTEN、siRNA-PTEN 陰性對照、riboFECTTM CP 轉染試劑（廣州銳博生物科技有限公司）。實驗引物均由華大基因公司合成。
細胞培養瓶、培養板（Corning 公司，美國）；TS100 倒置光學/熒光多功能顯微鏡（Nikon 公司，日本）；NanoDrop 2000 分光光度計、移液器、酶標儀（Thermo 公司，美國）；PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 細胞培養及傳代
取 MC3T3-E1 細胞系，加入完全培養液（含 10%FBS 的 α-MEM 培養基），置于 37℃、5% CO2 及 95% 飽和濕度的恒溫培養箱中培養，每 2～3 天換液 1 次。待細胞生長至 80%～90% 融合度時，棄原培養液，PBS 清洗 2～3 次，37℃、0.05% 胰蛋白酶消化 1～3 min，加入完全培養液終止反應，用移液器反復吹打若干次，室溫下，以離心半徑 10 cm、1 200 r/min 離心 5 min，棄上清后加入完全培養液重懸細胞，按 1∶4 比例進行傳代培養。取第 7 代細胞進行實驗。
1.3 不同濃度 H2O2 對 MC3T3-E1 細胞 miR-21 表達的影響
取 MC3T3-E1 細胞接種于 6 孔板，每孔 2×105 個，加入完全培養基培養，待細胞達 70%～80% 融合時，加入不同濃度 H2O2（0、40、80、160、320 μmol/L）。繼續培養 6 h 后取細胞行實時熒光定量 PCR 檢測 miR-21 表達。
按照 Trizol 說明書方法提取細胞總 RNA，NanoDrop 2000 分光光度計檢測總 RNA 純度及含量，逆轉錄總 RNA，cDNA 置于–20℃ 保存。根據實時定量 PCR 試劑盒說明書進行反應，反應總體系 10 μL；反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、35 s，40 個循環；miR-21 引物序列見表 1，以 U6 作為內參，采用 2–ΔΔCt 方法計算 miR-21 相對表達量。實驗重復 3 次。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes
1.4 不同濃度 H2O2 對 MC3T3-E1 細胞活力的影響
取 MC3T3-E1 細胞接種于 96 孔板，每孔 1×104 個，加入完全培養基培養 24 h 后，加入不同濃度 H2O2（0、40、80、160、320 μmol/L），每個濃度 3 復孔。繼續培養，2～3 d 換液 1 次。培養 1 周時采用 MTS 法檢測細胞活性，設無細胞孔為調零孔，于酶標檢測儀 490 nm 波長處測定吸光度（A）值。細胞活力=（H2O2 各濃度組 A 值—調零孔A 值）/（0 μmol/L 組 A 值—調零孔A 值）×100%。
根據 miR-21 表達及細胞活力檢測結果，選擇抑制細胞增殖的 H2O2 最佳濃度進行后續實驗。
1.5 H2O2 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響
1.5.1 實驗分組
根據培養條件不同，將 MC3T3-E1 細胞分為 4 組。空白對照組（A 組）：MC3T3-E1 細胞以完全培養基正常培養。H2O2 組（B 組）：首先采用含 H2O2 的完全培養基培養 1 周后，更換為不含 H2O2 的完全培養基繼續培養。成骨誘導組（C 組）：采用成骨誘導培養基（含 50 μg/mL 維生素 C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉及 100 nmol/L 地塞米松的完全培養基）培養。H2O2+成骨誘導組（D 組）：首先采用含 H2O2 的成骨誘導培養基培養，期間 2～3 d 換液 1 次，培養 1 周后更換為不含 H2O2 的成骨誘導培養基培養。
1.5.2 觀測指標
① 實時熒光定量 PCR 檢測：培養后第 1、2、3 周取 4 組細胞檢測 miR-21 表達，第 1、2 周檢測成骨標志基因 Runx2、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）及Ⅰ型膠原蛋白（collagen type I alpha 1，Col1a1）表達。參照 1.3 方法檢測 miR-21 表達，成骨標志基因檢測內參改為 GAPDH，反應條件為 95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、20 s，40 個循環，其余操作步驟相同，引物序列見表 1。實驗重復 3 次。
② Western blot 檢測：培養后第 2 周取 A、C、D 組細胞檢測 PTEN 蛋白表達。使用 RIPA 裂解液收集細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，上樣、SDS-PAGE 凝膠電泳、以 200 mA 恒流 1 h 轉印至聚偏氟乙烯膜、5% 脫脂奶粉中封閉 1 h，加入 PTEN 抗體（1∶1 000）或 GAPDH 抗體（1∶1 000），4℃ 過夜。TBST 洗 3 次，每次 10 min，加入二抗（1∶3 000）室溫孵育 1 h，TBST 洗 4 次，每次 10 min；加入 ECL 發光劑、顯影、定影。釆用 Image J 軟件測量條帶吸光度（A）值，以其與 GAPDH 的比值作為目標蛋白相對表達量。實驗重復 3 次。
③ 茜素紅染色：培養后第 3 周取 4 組細胞行茜素紅染色。吸去培養基，PBS 清洗 2 次，4% 多聚甲醛 1 mL 常溫下固定 15 min，吸去多聚甲醛，雙蒸水沖洗 3 次，常溫下加入 1 mL 40 mol/L 茜素紅，染色 15～20 min，雙蒸水沖洗 3～5 次洗去茜素紅。大體觀察細胞外鈣基質沉積情況。
1.6 下調 miR-21 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響
實驗分為 4 組，分別為 H2O2 組（A1 組）、H2O2+成骨誘導組（B1 組）、H2O2+miR-21 抑制劑+成骨誘導組（C1 組）、H2O2+miR-21 抑制劑陰性對照+成骨誘導組（D1 組）。A1、B1 組細胞處理方法參照 1.5.1 中 B、D 組；C1、D1 組：取 MC3T3-E1 細胞接種于 6 孔板，每孔 1×105 個，待細胞達 30%～50% 融合后，按照 riboFECTTM CP 轉染試劑說明書，將 100 nmol/L miR-21 抑制劑、miR-21 抑制劑陰性對照分別轉染至 MC3T3-E1 細胞，24 h 后換液，給予 H2O2 及成骨誘導處理，具體方法參照 1.5.1 中 D 組。
培養 24 h 后實時熒光定量 PCR 檢測A1、C1、D1 組的 miR-21 表達水平，評價轉染效率；48 h 時采用 Western blot 檢驗上述 3 組 PTEN 蛋白表達；第 1、2 周采用實時熒光定量 PCR 檢測 4 組細胞成骨標志基因（Runx2、OPN、Col1a1）表達，第 3 周行茜素紅染色觀察。方法參照 1.5.2。
1.7 沉默 PTEN 對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響
實驗分為 4 組，分別為 H2O2 組（A2 組）、H2O2+成骨誘導組（B2 組）、H2O2+siRNA-PTEN 陰性對照+成骨誘導組（C2 組）、H2O2+siRNA-PTEN+成骨誘導組（D2 組）。A2、B2 組細胞處理方法同 1.5.1 中的 B、D 組；C2、D2 組除分別采用 50 nmol/L siRNA-PTEN 陰性對照及 siRNA-PTEN 轉染細胞外，其余處理方法參照 1.6 中的 C1、D1 組。48 h 后 Western blot 檢測 A2、C2、D2 組 PTEN 蛋白表達，評價沉默效果。第 1、2 周采用實時熒光定量 PCR 檢測 4 組細胞成骨標志基因（Runx2、OPN、Col1a1）表達，第 3 周行茜素紅染色觀察。方法參照 1.5.2。
1.8 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 不同濃度 H2O2 對 MC3T3-E1 細胞 miR-21 表達及活力的影響
H2O2 處理細胞 6 h 后，160、320 μmol/L 組 miR-21 表達較 0 μmol/L 組明顯下調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
圖1
實時熒光定量 PCR 檢測不同濃度 H2O2 處理后 MC3T3- E1 細胞 miR-21 表達
Figure1.
The expression of miR-21 after exposing to different con centrations of H2O2 detected by RT-PCR
H2O2 處理細胞 1 周后，160、320 μmol/L 組細胞活力較 0 μmol/L 組明顯下降，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
MTS 測定不同濃度 H2O2 處理后 MC3T3-E1 細胞活力
Figure2.
The cell viability after exposing to different concentra tions of H2O2 determined by MTS
綜合以上結果，選擇 160 μmol/L H2O2 進行下一步實驗。
2.2 H2O2 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化過程中 miR-21 及 PTEN 表達的影響
2.2.1 實時熒光定量 PCR 檢測
與 A 組相比，第 1、2、3 周 C、D 組 miR-21 相對表達量增高，第 1、2 周 B 組降低；與 B 組相比，第 1、2、3 周 C、D 組 miR-21 相對表達量表達增高；與 C 組相比，第 1、2 周 D 組 miR-21 相對表達量表達降低；以上組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。其余各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3a。
圖3
H2O2 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化過程中 miR-21 及 PTEN 表達的影響
a. 實時熒光定量 PCR 檢測 miR-21 表達；b. Western blot 檢測 PTEN 蛋白表達 1：A 組 2：C 組 3：D 組
Figure3. The effect of H2O2 on the expression of miR-21 and PTEN after inducing osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cellsa. The expression of miR-21 detected by RT-PCR; b. The expression of PTEN protein detected by Western blot 1: Group A 2: Group C 3: Group D
2.2.2 Western blot 檢測
第 2 周 A、C、D 組 PTEN 蛋白相對表達量分別為 0.77±0.02、0.47±0.04、0.71±0.03。與 A 組相比，C、D 組 PTEN 蛋白相對表達量降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）；與 C 組相比，D 組表達升高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3b。
2.3 H2O2 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響
2.3.1 實時熒光定量 PCR 檢測
第 1 周，C、D 組 Runx2、OPN mRNA 相對表達量均高于 A、B 組，C 組 Col1a1 mRNA 相對表達量高于 A、B 組，D 組 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 相對表達量均低于 C 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
第 2 周，C、D 組 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 相對表達量均高于 A、B 組，D 組均低于 C 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
各組成骨標志基因表達比較（n=3，
）
Table2.
Comparison of expressions of osteogenesis related genes between groups (n=3,
)
2.3.2 茜素紅染色
與 A、B 組相比，C、D 組鈣基質沉積增多；D 組鈣基質沉積較 C 組減少。見圖 4。
圖4
茜素紅染色大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure4. Observation of alizarin red staininga. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.4 下調 miR-21 對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響
2.4.1 轉染效率檢測
培養 24 h ，實時熒光定量 PCR 檢測示 A1、C1、D1 組 miR-21 相對表達量分別為 1.00±0.08、0.27±0.02、0.94±0.05。C1 組 miR-21 相對表達量低于 A1 組及 D1 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A1 組及 D1 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.4.2 Western blot 檢驗
培養 48 h，Western blot 顯示 A1、C1、D1 組 PTEN 蛋白相對表達量分別為 0.45±0.03、0.57±0.03、0.43±0.02。C1 組 PTEN 蛋白相對表達量均高于 A1 組及 D1 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A1 組及 D1 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
miR-21 抑制劑轉染后 Western blot 檢測 PTEN 蛋白表達
1：A1 組 2：C1 組 3：D1 組
Figure5. The expression of PTEN protein after the transfection of miR-21 inhibitor detected by Western blot1: Group A1 2: Group C1 3: Group D1
2.4.3 實時熒光定量 PCR 檢測
第 1 周，B1、D1 組 Runx2、OPN mRNA 相對表達量均高于 A1、C1 組，C1 組 OPN mRNA 相對表達量高于 A1 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
第 2 周，B1、C1、D1 組 Runx2、OPN mRNA 相對表達量均高于 A1 組，B1、D1 組 Col1a1 mRNA 相對表達量均高于 A1 組，B1、D1 組 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 均高于 C1 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3。
表3
miR-21 抑制劑轉染后各組成骨標志基因表達比較（n=3，
）
Table3.
Comparison of expressions of osteogenesis related genes after the transfection of miR-21 inhibitor between groups (n=3,
)
2.4.4 茜素紅染色
第 3 周茜素紅染色示 B1、C1、D1 組鈣基質沉積多于 A1 組，C1 組鈣基質沉積明顯少于 B1、D1 組，B1、D1 組間無明顯差異。見圖 6。
圖6
miR-21 抑制劑轉染后各組茜素紅染色大體觀察
a. A1 組；b. B1 組；c. C1 組；d. D1 組
Figure6. Observation of alizarin red staining after the transfection of miR-21 inhibitora. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Group D1
2.5 沉默 PTEN 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響
2.5.1 轉染效率檢測
培養 48 h，Western blot 檢測示 A2、C2、D2 組 PTEN 蛋白相對表達量分別為 0.50±0.04、0.48±0.06、0.15±0.03。D2 組 PTEN 蛋白相對表達量明顯低于 A2、C2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A2 組及 C2 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 7。
圖7
siRNA-PTEN 轉染后 Western blot 檢測 PTEN 蛋白表達1：A2組 2：C2 組 3：D2 組
Figure7.
The expression of PTEN protein after the transfection of siRNA-PTEN detected by Western blot
1: Group A2 2: Group C2 3: Group D2
2.5.2 實時熒光定量 PCR 檢測
第 1 周，B2、C2、D2 組 Runx2、OPN mRNA 相對表達量均高于 A2 組，D2 組 OPN mRNA 相對表達量高于 B2、C2 組，D2 組 Col1a1 mRNA 相對表達量高于 A2、B2、C2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
第 2 周，B2、C2、D2 組 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 相對表達量均高于 A2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 4。
表4
siRNA-PTEN 轉染后各組成骨標志基因表達比較（n=3，
）
Table4.
Comparison of expressions of osteogenesis related genes after the transfection of siRNA-PTEN between groups (n=3,
)
2.5.3 茜素紅染色
第 3 周茜素紅染色 B2、C2、D2 組鈣基質沉積多于 A2 組，D2 組鈣基質沉積多于 B2、C2 組，B2、C2 組間無明顯差異。見圖 8。
圖8
siRNA-PTEN 轉染后茜素紅染色大體觀察
a. A2 組；b. B2 組；c. C2 組；d. D2 組
Figure8. Observation of alizarin red staining after the transfection of siRNA-PTENa. Group A2; b. Group B2; c. Group C2; d. Group D2
3 討論
骨修復材料植入早期，局部組織缺血缺氧，再灌注后會產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），使周圍 MSCs 發生低氧應激、氧化應激。ROS 主要包括超氧陰離子、H2O2 及羥自由基，其中 H2O2 有更高的氧化活性及穩定性，被廣泛應用于制作氧化應激模型[11-12]。ROS 濃度的提高對機體主要有兩方面的影響：一方面是通過蛋白質、脂質及 DNA 過氧化導致細胞壞死；另一方面則是通過在半胱氨酸殘基，可逆性氧化激活細胞的生理信號通路[13]。ROS 可調控相關基因的表達，對細胞的增殖、分化、生存及凋亡等生命過程有著重要作用。由于 miRNAs 調控著細胞大約 30% 基因的變化，因此 ROS 對細胞生命活動的影響，可能源于 ROS 對 microRNAs 的調控。研究表明，miR-21 與腫瘤細胞的低氧、氧化應激反應密切相關[6]，此外，Cheng 等[7]及 Lin 等[8]發現 H2O2 處理心肌細胞、血管平滑肌細胞 6 h 后，miR-21 表達上調并促進細胞成活。Lv 等[6]則發現 H2O2 處理 BMSCs 6 h 后，miR-21 表達下調，通過上調 miR-21 可抑制細胞凋亡。本研究通過不同濃度 H2O2 處理 MC3T3-E1 細胞 6 h，發現經濃度超過 160 μmol/L 的H2O2 處理后細胞 miR-21 表達下調，表明 H2O2 有下調 miR-21 表達的趨勢，與 Lv 等[6]結果相似，而與 Cheng 等[7]及 Lin 等[8]結果不同，分析可能與細胞來源不同有關。同時，多項研究表明，miR-21 可促進 MSCs 成骨分化[9, 14]。因此，在骨修復材料植入早期，局部產生的 ROS 可能通過調控 miR-21，進而影響 MSCs 成骨分化進程。
正常情況下，機體可通過抗氧化系統及時清除產生的 ROS，若 ROS 的產生與抗氧化系統失衡則引發機體發生氧化應激[15]，而氧化應激反應與骨質疏松、骨關節炎等疾病密切相關[16]。研究發現，在氧化應激狀態下，細胞成骨分化活動被抑制[17-18]。本研究通過 H2O2 模擬 MSCs 植入早期的氧化應激反應，按照 Lee 等[18]采用 MC3T3-E1 細胞建立氧化應激模型方法，通過不同濃度 H2O2 處理 MC3T3-E1 細胞 1 周，發現 160 μmol/L H2O2 濃度時細胞活力在 80% 以上，低于此濃度對細胞活力無明顯影響；而濃度 320 μmol/L的 H2O2 培養后，細胞活力受到明顯影響。為保證細胞活性，本研究選擇 160 μmol/L H2O2 處理 MC3T3-E1 細胞，進一步探討其對細胞成骨分化及分化過程中對 miR-21 表達的影響。
在細胞成骨誘導分化過程中，miR-21 隨著細胞成骨分化過程表達逐漸上調，在第 2 周達到高峰，這表明 miR-21 參與細胞的成骨分化進程。在第 1、2 周 D 組 miR-21 表達較 C 組下調，表明 H2O2 可抑制 miR-21 在成骨分化中的表達，并且 B 組第 1、2 周時 miR-21 表達較 A 組下調，這與我們不同濃度 H2O2 處理 6 h 后觀察結果相符。而在第 3 周時，A、B 組 miR-21 表達無顯著差異，這可能是由于 H2O2 處理后，miR-21 在第 3 周恢復到了生理水平。與大部分研究結果相似[17-18]，我們發現 H2O2 抑制了 MC3T3-E1 細胞成骨標志基因表達，并且抑制其礦化，結合 H2O2 處理下 miR-21 表達的變化，提示 H2O2 抑制 MC3T3-E1 細胞成骨分化可能與 miR-21 表達下調有關。由于 miR-21 在成骨分化進程中表達逐漸上調，提示 miR-21 參與了細胞成骨分化過程。因此，我們選擇在 H2O2 處理的同時下調 miR-21 表達，發現 miR-21 的下調抑制了 MC3T3-E1 細胞成骨分化。進一步說明 H2O2 抑制 MC3T3-E1 細胞成骨分化可能與 H2O2 抑制了 miR-21 表達有關。
PTEN 在細胞的生長、凋亡、黏附、遷移、分化進程中發揮重要作用，其主要通過抑制 PI3K 信號通路發揮作用[19]。在成骨分化過程中，抑制 PTEN 表達可激活 PI3K 信號通路，進而促進細胞成骨分化[10]。Burgers 等[20]發現通過敲除小鼠成骨細胞中 的 PTEN，可提高膜內成骨及軟骨內成骨，促進骨折愈合；Guntur 等[21]發現敲除 PTEN 可激活 FGF 及 Hedgehog 信號，促進細胞成骨分化；以上研究表明敲除 PTEN 能促進細胞成骨分化。此外，H2O2 可激活 PTEN 抑制 PI3K/AKT 通路參與 BMSCs 的凋亡過程[6]；在視網膜色素上皮細胞中，氧化應激狀態下可激活 PI3K/AKT 通路抑制細胞凋亡[22]。這些研究都表明 PTEN 及 PI3K 信號通路在氧化應激反應中都扮演了重要角色。在多個細胞系中 PTEN 為 miR-21 靶基因，miR-21 在翻譯水平可靶向 PTEN 調控 PI3K 信號通路[23-24]。然而，在氧化應激狀態下，miR-21 與 PTEN 是否參與了 MC3T3-E1 細胞成骨分化過程尚不清楚。本研究通過 H2O2 模擬的氧化應激反應，發現在成骨誘導第 2 周，C 組 PTEN 蛋白表達較 A 組及 D 組下調，與 miR-21 表達相反，提示 PTEN 表達與 miR-21、成骨分化進程及 H2O2 處理有關。下調 miR-21 可促進 PTEN 表達上調，因此在 MC3T3-E1 細胞中，我們分析 PTEN 可能為 miR-21 靶基因。當沉默 PTEN 表達時，Runx2 表達無明顯差異，但在第 1 周 OPN 及 Col1a1 表達上調，并且在第 3 周促進細胞礦化。OPN 是細胞外基質蛋白，在成骨分化早期就表達升高，Col1a1 是細胞外基質蛋白黏附的支架，誘導鈣、磷在細胞外基質中沉積，提示 H2O2 處理的同時沉默 PTEN 能促進 MC3T3-E1 細胞成骨分化。
FoxO（forkhead box O）轉錄因子是叉頭框蛋白的一個亞類，可將外界刺激（激素變化、炎癥、氧化應激等）轉化為特定基因轉錄，參與機體病理生理活動的調控。氧化應激狀態下，大量 ROS 可激活 FoxOs，從而誘導 DNA 修復相關基因及抗氧化酶基因轉錄，有助于損傷 DNA 的修復及細胞的應激反應[25]。研究表明，FoxOs 是氧化應激狀態下成骨分化及骨穩態的重要調控者[26-27]。FoxO3a 可抑制 miR-21 轉錄[28]，可見氧化應激狀態激活的 FoxO3a 可抑制 miR-21 表達，這與本研究 B 組及 D 組 miR-21 表達下調結果一致。但本次研究未探討氧化應激下 FoxOs 表達及其與 miR-21、成骨分化的具體關系；同時，PI3K 信號通路是否參與氧化應激狀態下成骨分化的調控，也是進一步研究的方向。
綜上述，本研究結果提示 H2O2 抑制 MC3T3-E1 成骨分化可能與下調 miR-21 有關，并且 PTEN 參與其中的調控。FoxOs 及 PI3K 信號通路可能參與了氧化應激狀態下的成骨分化調控，其與 miR-21 及 PTEN 之間的具體關系尚待深入研究，并且需進行動物實驗進一步驗證。
目前，如何提高骨修復材料的修復效率仍是骨組織工程面臨的重要問題。骨修復過程包括 MSCs 的招募、增殖、成骨分化等，其過程十分復雜，并且受生長因子、激素及細胞外基質等的調控[1-2]。在骨折局部及骨修復材料植入早期，局部 MSCs 可因組織缺血再灌注后發生低氧應激、氧化應激[3-4]。Chen 等[5]發現在豬腰椎融合模型中，microRNAs 對骨形成起到重要調控作用。microRNAs 是一類非編碼小 RNA 分子，通過裂解靶基因或抑制翻譯調控細胞增殖、分化、凋亡等生物活動。多項研究表明，在 H2O2 模擬的氧化應激模型中，H2O2 可調控 miR-21 表達，從而抑制細胞凋亡[6-8]，磷酸酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）在許多細胞系中為 miR-21 的靶基因，同樣受 H2O2 調控[6]。同時，miR-21 及 PTEN 在 MSCs 成骨分化方面有著重要調控作用[9-10]。因此，在骨修復材料植入早期，局部 MSCs 氧化應激狀態下，H2O2 可能通過調控 miR-21 影響細胞成骨分化。MC3T3-E1 細胞（小鼠顱頂前成骨細胞）由 MSCs 分化而來，是骨形成的關鍵細胞。本研究旨在觀察 H2O2 處理后的 MC3T3-E1 細胞，探索氧化應激狀態下 miR-21 表達及其對 MC3T3-E1 成骨分化的作用及機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
MC3T3-E1 細胞系由美國 ATCC 細胞庫提供；α-MEM 培養基（HyClone 公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；Trizol 試劑（Invitrogen 公司，美國）；MTS（上海碧云天生物技術有限公司）；PBS、H2O2、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒（Sigma 公司，美國）；氯仿、異丙醇（廣州化學試劑廠）；逆轉錄試劑盒、實時定量 PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；PTEN 抗體（Abcam 公司，英國）；轉染試劑 miR-21 抑制劑、miR-21 抑制劑陰性對照、siRNA-PTEN、siRNA-PTEN 陰性對照、riboFECTTM CP 轉染試劑（廣州銳博生物科技有限公司）。實驗引物均由華大基因公司合成。
細胞培養瓶、培養板（Corning 公司，美國）；TS100 倒置光學/熒光多功能顯微鏡（Nikon 公司，日本）；NanoDrop 2000 分光光度計、移液器、酶標儀（Thermo 公司，美國）；PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 細胞培養及傳代
取 MC3T3-E1 細胞系，加入完全培養液（含 10%FBS 的 α-MEM 培養基），置于 37℃、5% CO2 及 95% 飽和濕度的恒溫培養箱中培養，每 2～3 天換液 1 次。待細胞生長至 80%～90% 融合度時，棄原培養液，PBS 清洗 2～3 次，37℃、0.05% 胰蛋白酶消化 1～3 min，加入完全培養液終止反應，用移液器反復吹打若干次，室溫下，以離心半徑 10 cm、1 200 r/min 離心 5 min，棄上清后加入完全培養液重懸細胞，按 1∶4 比例進行傳代培養。取第 7 代細胞進行實驗。
1.3 不同濃度 H2O2 對 MC3T3-E1 細胞 miR-21 表達的影響
取 MC3T3-E1 細胞接種于 6 孔板，每孔 2×105 個，加入完全培養基培養，待細胞達 70%～80% 融合時，加入不同濃度 H2O2（0、40、80、160、320 μmol/L）。繼續培養 6 h 后取細胞行實時熒光定量 PCR 檢測 miR-21 表達。
按照 Trizol 說明書方法提取細胞總 RNA，NanoDrop 2000 分光光度計檢測總 RNA 純度及含量，逆轉錄總 RNA，cDNA 置于–20℃ 保存。根據實時定量 PCR 試劑盒說明書進行反應，反應總體系 10 μL；反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、35 s，40 個循環；miR-21 引物序列見表 1，以 U6 作為內參，采用 2–ΔΔCt 方法計算 miR-21 相對表達量。實驗重復 3 次。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes
1.4 不同濃度 H2O2 對 MC3T3-E1 細胞活力的影響
取 MC3T3-E1 細胞接種于 96 孔板，每孔 1×104 個，加入完全培養基培養 24 h 后，加入不同濃度 H2O2（0、40、80、160、320 μmol/L），每個濃度 3 復孔。繼續培養，2～3 d 換液 1 次。培養 1 周時采用 MTS 法檢測細胞活性，設無細胞孔為調零孔，于酶標檢測儀 490 nm 波長處測定吸光度（A）值。細胞活力=（H2O2 各濃度組 A 值—調零孔A 值）/（0 μmol/L 組 A 值—調零孔A 值）×100%。
根據 miR-21 表達及細胞活力檢測結果，選擇抑制細胞增殖的 H2O2 最佳濃度進行后續實驗。
1.5 H2O2 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響
1.5.1 實驗分組
根據培養條件不同，將 MC3T3-E1 細胞分為 4 組。空白對照組（A 組）：MC3T3-E1 細胞以完全培養基正常培養。H2O2 組（B 組）：首先采用含 H2O2 的完全培養基培養 1 周后，更換為不含 H2O2 的完全培養基繼續培養。成骨誘導組（C 組）：采用成骨誘導培養基（含 50 μg/mL 維生素 C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉及 100 nmol/L 地塞米松的完全培養基）培養。H2O2+成骨誘導組（D 組）：首先采用含 H2O2 的成骨誘導培養基培養，期間 2～3 d 換液 1 次，培養 1 周后更換為不含 H2O2 的成骨誘導培養基培養。
1.5.2 觀測指標
① 實時熒光定量 PCR 檢測：培養后第 1、2、3 周取 4 組細胞檢測 miR-21 表達，第 1、2 周檢測成骨標志基因 Runx2、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）及Ⅰ型膠原蛋白（collagen type I alpha 1，Col1a1）表達。參照 1.3 方法檢測 miR-21 表達，成骨標志基因檢測內參改為 GAPDH，反應條件為 95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、20 s，40 個循環，其余操作步驟相同，引物序列見表 1。實驗重復 3 次。
② Western blot 檢測：培養后第 2 周取 A、C、D 組細胞檢測 PTEN 蛋白表達。使用 RIPA 裂解液收集細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，上樣、SDS-PAGE 凝膠電泳、以 200 mA 恒流 1 h 轉印至聚偏氟乙烯膜、5% 脫脂奶粉中封閉 1 h，加入 PTEN 抗體（1∶1 000）或 GAPDH 抗體（1∶1 000），4℃ 過夜。TBST 洗 3 次，每次 10 min，加入二抗（1∶3 000）室溫孵育 1 h，TBST 洗 4 次，每次 10 min；加入 ECL 發光劑、顯影、定影。釆用 Image J 軟件測量條帶吸光度（A）值，以其與 GAPDH 的比值作為目標蛋白相對表達量。實驗重復 3 次。
③ 茜素紅染色：培養后第 3 周取 4 組細胞行茜素紅染色。吸去培養基，PBS 清洗 2 次，4% 多聚甲醛 1 mL 常溫下固定 15 min，吸去多聚甲醛，雙蒸水沖洗 3 次，常溫下加入 1 mL 40 mol/L 茜素紅，染色 15～20 min，雙蒸水沖洗 3～5 次洗去茜素紅。大體觀察細胞外鈣基質沉積情況。
1.6 下調 miR-21 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響
實驗分為 4 組，分別為 H2O2 組（A1 組）、H2O2+成骨誘導組（B1 組）、H2O2+miR-21 抑制劑+成骨誘導組（C1 組）、H2O2+miR-21 抑制劑陰性對照+成骨誘導組（D1 組）。A1、B1 組細胞處理方法參照 1.5.1 中 B、D 組；C1、D1 組：取 MC3T3-E1 細胞接種于 6 孔板，每孔 1×105 個，待細胞達 30%～50% 融合后，按照 riboFECTTM CP 轉染試劑說明書，將 100 nmol/L miR-21 抑制劑、miR-21 抑制劑陰性對照分別轉染至 MC3T3-E1 細胞，24 h 后換液，給予 H2O2 及成骨誘導處理，具體方法參照 1.5.1 中 D 組。
培養 24 h 后實時熒光定量 PCR 檢測A1、C1、D1 組的 miR-21 表達水平，評價轉染效率；48 h 時采用 Western blot 檢驗上述 3 組 PTEN 蛋白表達；第 1、2 周采用實時熒光定量 PCR 檢測 4 組細胞成骨標志基因（Runx2、OPN、Col1a1）表達，第 3 周行茜素紅染色觀察。方法參照 1.5.2。
1.7 沉默 PTEN 對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響
實驗分為 4 組，分別為 H2O2 組（A2 組）、H2O2+成骨誘導組（B2 組）、H2O2+siRNA-PTEN 陰性對照+成骨誘導組（C2 組）、H2O2+siRNA-PTEN+成骨誘導組（D2 組）。A2、B2 組細胞處理方法同 1.5.1 中的 B、D 組；C2、D2 組除分別采用 50 nmol/L siRNA-PTEN 陰性對照及 siRNA-PTEN 轉染細胞外，其余處理方法參照 1.6 中的 C1、D1 組。48 h 后 Western blot 檢測 A2、C2、D2 組 PTEN 蛋白表達，評價沉默效果。第 1、2 周采用實時熒光定量 PCR 檢測 4 組細胞成骨標志基因（Runx2、OPN、Col1a1）表達，第 3 周行茜素紅染色觀察。方法參照 1.5.2。
1.8 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 不同濃度 H2O2 對 MC3T3-E1 細胞 miR-21 表達及活力的影響
H2O2 處理細胞 6 h 后，160、320 μmol/L 組 miR-21 表達較 0 μmol/L 組明顯下調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
圖1
實時熒光定量 PCR 檢測不同濃度 H2O2 處理后 MC3T3- E1 細胞 miR-21 表達
Figure1.
The expression of miR-21 after exposing to different con centrations of H2O2 detected by RT-PCR
H2O2 處理細胞 1 周后，160、320 μmol/L 組細胞活力較 0 μmol/L 組明顯下降，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
MTS 測定不同濃度 H2O2 處理后 MC3T3-E1 細胞活力
Figure2.
The cell viability after exposing to different concentra tions of H2O2 determined by MTS
綜合以上結果，選擇 160 μmol/L H2O2 進行下一步實驗。
2.2 H2O2 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化過程中 miR-21 及 PTEN 表達的影響
2.2.1 實時熒光定量 PCR 檢測
與 A 組相比，第 1、2、3 周 C、D 組 miR-21 相對表達量增高，第 1、2 周 B 組降低；與 B 組相比，第 1、2、3 周 C、D 組 miR-21 相對表達量表達增高；與 C 組相比，第 1、2 周 D 組 miR-21 相對表達量表達降低；以上組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。其余各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3a。
圖3
H2O2 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化過程中 miR-21 及 PTEN 表達的影響
a. 實時熒光定量 PCR 檢測 miR-21 表達；b. Western blot 檢測 PTEN 蛋白表達 1：A 組 2：C 組 3：D 組
Figure3. The effect of H2O2 on the expression of miR-21 and PTEN after inducing osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cellsa. The expression of miR-21 detected by RT-PCR; b. The expression of PTEN protein detected by Western blot 1: Group A 2: Group C 3: Group D
2.2.2 Western blot 檢測
第 2 周 A、C、D 組 PTEN 蛋白相對表達量分別為 0.77±0.02、0.47±0.04、0.71±0.03。與 A 組相比，C、D 組 PTEN 蛋白相對表達量降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）；與 C 組相比，D 組表達升高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3b。
2.3 H2O2 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響
2.3.1 實時熒光定量 PCR 檢測
第 1 周，C、D 組 Runx2、OPN mRNA 相對表達量均高于 A、B 組，C 組 Col1a1 mRNA 相對表達量高于 A、B 組，D 組 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 相對表達量均低于 C 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
第 2 周，C、D 組 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 相對表達量均高于 A、B 組，D 組均低于 C 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
各組成骨標志基因表達比較（n=3，
）
Table2.
Comparison of expressions of osteogenesis related genes between groups (n=3,
)
2.3.2 茜素紅染色
與 A、B 組相比，C、D 組鈣基質沉積增多；D 組鈣基質沉積較 C 組減少。見圖 4。
圖4
茜素紅染色大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure4. Observation of alizarin red staininga. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.4 下調 miR-21 對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響
2.4.1 轉染效率檢測
培養 24 h ，實時熒光定量 PCR 檢測示 A1、C1、D1 組 miR-21 相對表達量分別為 1.00±0.08、0.27±0.02、0.94±0.05。C1 組 miR-21 相對表達量低于 A1 組及 D1 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A1 組及 D1 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.4.2 Western blot 檢驗
培養 48 h，Western blot 顯示 A1、C1、D1 組 PTEN 蛋白相對表達量分別為 0.45±0.03、0.57±0.03、0.43±0.02。C1 組 PTEN 蛋白相對表達量均高于 A1 組及 D1 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A1 組及 D1 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
miR-21 抑制劑轉染后 Western blot 檢測 PTEN 蛋白表達
1：A1 組 2：C1 組 3：D1 組
Figure5. The expression of PTEN protein after the transfection of miR-21 inhibitor detected by Western blot1: Group A1 2: Group C1 3: Group D1
2.4.3 實時熒光定量 PCR 檢測
第 1 周，B1、D1 組 Runx2、OPN mRNA 相對表達量均高于 A1、C1 組，C1 組 OPN mRNA 相對表達量高于 A1 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
第 2 周，B1、C1、D1 組 Runx2、OPN mRNA 相對表達量均高于 A1 組，B1、D1 組 Col1a1 mRNA 相對表達量均高于 A1 組，B1、D1 組 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 均高于 C1 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3。
表3
miR-21 抑制劑轉染后各組成骨標志基因表達比較（n=3，
）
Table3.
Comparison of expressions of osteogenesis related genes after the transfection of miR-21 inhibitor between groups (n=3,
)
2.4.4 茜素紅染色
第 3 周茜素紅染色示 B1、C1、D1 組鈣基質沉積多于 A1 組，C1 組鈣基質沉積明顯少于 B1、D1 組，B1、D1 組間無明顯差異。見圖 6。
圖6
miR-21 抑制劑轉染后各組茜素紅染色大體觀察
a. A1 組；b. B1 組；c. C1 組；d. D1 組
Figure6. Observation of alizarin red staining after the transfection of miR-21 inhibitora. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Group D1
2.5 沉默 PTEN 對 MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響
2.5.1 轉染效率檢測
培養 48 h，Western blot 檢測示 A2、C2、D2 組 PTEN 蛋白相對表達量分別為 0.50±0.04、0.48±0.06、0.15±0.03。D2 組 PTEN 蛋白相對表達量明顯低于 A2、C2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A2 組及 C2 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 7。
圖7
siRNA-PTEN 轉染后 Western blot 檢測 PTEN 蛋白表達1：A2組 2：C2 組 3：D2 組
Figure7.
The expression of PTEN protein after the transfection of siRNA-PTEN detected by Western blot
1: Group A2 2: Group C2 3: Group D2
2.5.2 實時熒光定量 PCR 檢測
第 1 周，B2、C2、D2 組 Runx2、OPN mRNA 相對表達量均高于 A2 組，D2 組 OPN mRNA 相對表達量高于 B2、C2 組，D2 組 Col1a1 mRNA 相對表達量高于 A2、B2、C2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
第 2 周，B2、C2、D2 組 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 相對表達量均高于 A2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 4。
表4
siRNA-PTEN 轉染后各組成骨標志基因表達比較（n=3，
）
Table4.
Comparison of expressions of osteogenesis related genes after the transfection of siRNA-PTEN between groups (n=3,
)
2.5.3 茜素紅染色
第 3 周茜素紅染色 B2、C2、D2 組鈣基質沉積多于 A2 組，D2 組鈣基質沉積多于 B2、C2 組，B2、C2 組間無明顯差異。見圖 8。
圖8
siRNA-PTEN 轉染后茜素紅染色大體觀察
a. A2 組；b. B2 組；c. C2 組；d. D2 組
Figure8. Observation of alizarin red staining after the transfection of siRNA-PTENa. Group A2; b. Group B2; c. Group C2; d. Group D2
3 討論
骨修復材料植入早期，局部組織缺血缺氧，再灌注后會產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），使周圍 MSCs 發生低氧應激、氧化應激。ROS 主要包括超氧陰離子、H2O2 及羥自由基，其中 H2O2 有更高的氧化活性及穩定性，被廣泛應用于制作氧化應激模型[11-12]。ROS 濃度的提高對機體主要有兩方面的影響：一方面是通過蛋白質、脂質及 DNA 過氧化導致細胞壞死；另一方面則是通過在半胱氨酸殘基，可逆性氧化激活細胞的生理信號通路[13]。ROS 可調控相關基因的表達，對細胞的增殖、分化、生存及凋亡等生命過程有著重要作用。由于 miRNAs 調控著細胞大約 30% 基因的變化，因此 ROS 對細胞生命活動的影響，可能源于 ROS 對 microRNAs 的調控。研究表明，miR-21 與腫瘤細胞的低氧、氧化應激反應密切相關[6]，此外，Cheng 等[7]及 Lin 等[8]發現 H2O2 處理心肌細胞、血管平滑肌細胞 6 h 后，miR-21 表達上調并促進細胞成活。Lv 等[6]則發現 H2O2 處理 BMSCs 6 h 后，miR-21 表達下調，通過上調 miR-21 可抑制細胞凋亡。本研究通過不同濃度 H2O2 處理 MC3T3-E1 細胞 6 h，發現經濃度超過 160 μmol/L 的H2O2 處理后細胞 miR-21 表達下調，表明 H2O2 有下調 miR-21 表達的趨勢，與 Lv 等[6]結果相似，而與 Cheng 等[7]及 Lin 等[8]結果不同，分析可能與細胞來源不同有關。同時，多項研究表明，miR-21 可促進 MSCs 成骨分化[9, 14]。因此，在骨修復材料植入早期，局部產生的 ROS 可能通過調控 miR-21，進而影響 MSCs 成骨分化進程。
正常情況下，機體可通過抗氧化系統及時清除產生的 ROS，若 ROS 的產生與抗氧化系統失衡則引發機體發生氧化應激[15]，而氧化應激反應與骨質疏松、骨關節炎等疾病密切相關[16]。研究發現，在氧化應激狀態下，細胞成骨分化活動被抑制[17-18]。本研究通過 H2O2 模擬 MSCs 植入早期的氧化應激反應，按照 Lee 等[18]采用 MC3T3-E1 細胞建立氧化應激模型方法，通過不同濃度 H2O2 處理 MC3T3-E1 細胞 1 周，發現 160 μmol/L H2O2 濃度時細胞活力在 80% 以上，低于此濃度對細胞活力無明顯影響；而濃度 320 μmol/L的 H2O2 培養后，細胞活力受到明顯影響。為保證細胞活性，本研究選擇 160 μmol/L H2O2 處理 MC3T3-E1 細胞，進一步探討其對細胞成骨分化及分化過程中對 miR-21 表達的影響。
在細胞成骨誘導分化過程中，miR-21 隨著細胞成骨分化過程表達逐漸上調，在第 2 周達到高峰，這表明 miR-21 參與細胞的成骨分化進程。在第 1、2 周 D 組 miR-21 表達較 C 組下調，表明 H2O2 可抑制 miR-21 在成骨分化中的表達，并且 B 組第 1、2 周時 miR-21 表達較 A 組下調，這與我們不同濃度 H2O2 處理 6 h 后觀察結果相符。而在第 3 周時，A、B 組 miR-21 表達無顯著差異，這可能是由于 H2O2 處理后，miR-21 在第 3 周恢復到了生理水平。與大部分研究結果相似[17-18]，我們發現 H2O2 抑制了 MC3T3-E1 細胞成骨標志基因表達，并且抑制其礦化，結合 H2O2 處理下 miR-21 表達的變化，提示 H2O2 抑制 MC3T3-E1 細胞成骨分化可能與 miR-21 表達下調有關。由于 miR-21 在成骨分化進程中表達逐漸上調，提示 miR-21 參與了細胞成骨分化過程。因此，我們選擇在 H2O2 處理的同時下調 miR-21 表達，發現 miR-21 的下調抑制了 MC3T3-E1 細胞成骨分化。進一步說明 H2O2 抑制 MC3T3-E1 細胞成骨分化可能與 H2O2 抑制了 miR-21 表達有關。
PTEN 在細胞的生長、凋亡、黏附、遷移、分化進程中發揮重要作用，其主要通過抑制 PI3K 信號通路發揮作用[19]。在成骨分化過程中，抑制 PTEN 表達可激活 PI3K 信號通路，進而促進細胞成骨分化[10]。Burgers 等[20]發現通過敲除小鼠成骨細胞中 的 PTEN，可提高膜內成骨及軟骨內成骨，促進骨折愈合；Guntur 等[21]發現敲除 PTEN 可激活 FGF 及 Hedgehog 信號，促進細胞成骨分化；以上研究表明敲除 PTEN 能促進細胞成骨分化。此外，H2O2 可激活 PTEN 抑制 PI3K/AKT 通路參與 BMSCs 的凋亡過程[6]；在視網膜色素上皮細胞中，氧化應激狀態下可激活 PI3K/AKT 通路抑制細胞凋亡[22]。這些研究都表明 PTEN 及 PI3K 信號通路在氧化應激反應中都扮演了重要角色。在多個細胞系中 PTEN 為 miR-21 靶基因，miR-21 在翻譯水平可靶向 PTEN 調控 PI3K 信號通路[23-24]。然而，在氧化應激狀態下，miR-21 與 PTEN 是否參與了 MC3T3-E1 細胞成骨分化過程尚不清楚。本研究通過 H2O2 模擬的氧化應激反應，發現在成骨誘導第 2 周，C 組 PTEN 蛋白表達較 A 組及 D 組下調，與 miR-21 表達相反，提示 PTEN 表達與 miR-21、成骨分化進程及 H2O2 處理有關。下調 miR-21 可促進 PTEN 表達上調，因此在 MC3T3-E1 細胞中，我們分析 PTEN 可能為 miR-21 靶基因。當沉默 PTEN 表達時，Runx2 表達無明顯差異，但在第 1 周 OPN 及 Col1a1 表達上調，并且在第 3 周促進細胞礦化。OPN 是細胞外基質蛋白，在成骨分化早期就表達升高，Col1a1 是細胞外基質蛋白黏附的支架，誘導鈣、磷在細胞外基質中沉積，提示 H2O2 處理的同時沉默 PTEN 能促進 MC3T3-E1 細胞成骨分化。
FoxO（forkhead box O）轉錄因子是叉頭框蛋白的一個亞類，可將外界刺激（激素變化、炎癥、氧化應激等）轉化為特定基因轉錄，參與機體病理生理活動的調控。氧化應激狀態下，大量 ROS 可激活 FoxOs，從而誘導 DNA 修復相關基因及抗氧化酶基因轉錄，有助于損傷 DNA 的修復及細胞的應激反應[25]。研究表明，FoxOs 是氧化應激狀態下成骨分化及骨穩態的重要調控者[26-27]。FoxO3a 可抑制 miR-21 轉錄[28]，可見氧化應激狀態激活的 FoxO3a 可抑制 miR-21 表達，這與本研究 B 組及 D 組 miR-21 表達下調結果一致。但本次研究未探討氧化應激下 FoxOs 表達及其與 miR-21、成骨分化的具體關系；同時，PI3K 信號通路是否參與氧化應激狀態下成骨分化的調控，也是進一步研究的方向。
綜上述，本研究結果提示 H2O2 抑制 MC3T3-E1 成骨分化可能與下調 miR-21 有關，并且 PTEN 參與其中的調控。FoxOs 及 PI3K 信號通路可能參與了氧化應激狀態下的成骨分化調控，其與 miR-21 及 PTEN 之間的具體關系尚待深入研究，并且需進行動物實驗進一步驗證。
