引用本文： 鄭力彬, 黃東. FTY720-P 對 MC3T3-E1 細胞分化成熟的作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(3): 285-290. doi: 10.7507/1002-1892.201710108 復制
FTY720 是由冬蟲夏草培養液多球殼菌素合成的鞘氨醇類似物[1-2]，作為 S1P 受體激動劑，是一種作用機制與常規免疫抑制劑環孢素、他克莫司等不同的免疫抑制劑，可用于自體免疫疾病、器官移植、腫瘤等多種疾病的治療。S1P 受體是體內一種特異性受體，并在細胞增殖、分化、成熟等方面起著重要作用[3-5]。在體內，FTY720 可被磷酸化為具有生物活性的 FTY720-P。本課題組前期研究證明 FTY720-P 能夠抑制破骨細胞增殖[6]，并具有促進原代成骨細胞細胞外基質成熟的作用[7]。然而在前期實驗中，我們利用小鼠顱蓋骨直接提取原代細胞，建立成骨細胞培養模型。實驗過程中發現，該方法由于培養周期過長，且培養過程易受各種不穩定因素的影響，不適合用于后續破骨細胞-成骨細胞聯合培養體系。而 MC3T3-E1 細胞是小鼠胚胎成骨細胞前體細胞[8-9]，具有培養周期短、容易獲取、受細菌污染等不穩定因素影響較小等優勢，有利于后期更好地建立破骨細胞-成骨細胞聯合培養體系。因此我們選取 400 ng/mL FTY720-P 作用于 MC3T3-E1 細胞，在體外建立成骨細胞模型，并從細胞形態學、功能和細胞成熟相關蛋白及細胞凋亡等相關指標進行研究，以探討 FTY720-P 對 MC3T3-E1 細胞生長的影響，為下一步建立聯合培養體系并探討 FTY720-P 對聯合培養體系的影響奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
MC3T3-E1 細胞（ATCC 細胞庫，美國）；α-MEM（HyClone 公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；FTY720-P（Cayman 公司，美國）；四唑氮藍（nitroblue tetrazolium，NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP）-ALP 顯色試劑盒、TUNEL 細胞凋亡試劑盒（Roch 公司，瑞士）；茜素紅染色試劑盒（廣州外顯子生物技術有限公司）；兔Ⅲ型膠原蛋白抗體、兔Ⅰ型膠原蛋白抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）；熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）。
1.2 MC3T3-E1 細胞培養及實驗分組
將 MC3T3-E1 細胞置于 25 mL 培養瓶中，采用含 20%FBS、100 U/mL 青霉素和鏈霉素的 α-MEM 培養基，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，第 2 天換液；待細胞長滿瓶底后，用 0.25% 胰蛋白酶消化，按 1∶3 比例傳代，置于 25 mL 培養瓶中，采用含 10%FBS、100 U/mL 青霉素和鏈霉素的 α-MEM 培養基，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。至細胞完全貼壁后，加 0.25% 胰蛋白酶消化；輕輕吸出細胞，按 1.0×105 個/孔密度接種至 12 孔培養板（接種前每孔加入一爬片）。細胞完全貼壁后，分為兩組：實驗組采用含 400 ng/mL FTY720-P（以氯仿為溶劑）的基礎培養基，建立體外誘導成骨分化細胞模型；對照組采用僅含氯仿的基礎培養基。培養 48 h 后倒置相差顯微鏡觀察比較兩組細胞形態。
1.3 觀測指標
1.3.1 免疫熒光染色檢測成骨細胞相關蛋白表達
培養 48 h 后兩組各取 2 孔，先制備細胞爬片，吸去細胞上清，PBS 洗 1 次；4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min；75% 乙醇浸泡，4℃ 下保存過夜，第 2 天 PBS 洗 1 次，3 min；加入 0.5% Triton X-100，20 min 后吸去液體，PBS 洗 2 次，每次 3 min；加入 3% 牛血清白蛋白，37℃ 下靜置 30 min，吸去液體。每組其中 1 孔加入 100 μL 稀釋后的兔Ⅰ型膠原蛋白抗體（1∶100），另 1 孔加入 100 μL 稀釋后的兔Ⅲ型膠原蛋白抗體（1∶100），37℃ 下避光保存 1 h；PBS 洗 3 次，每次 5 min；依次加入 75%、85%、100% 乙醇脫水各 1 min，干燥，然后將孔中的細胞爬片取出，每張片分別加入 10 μL DAPI，封片，10 min 后熒光顯微鏡下觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達情況。200 倍鏡下每張隨機取 5 個視野，每個視野選取 100 個細胞，用 Image-Pro Plus 圖像分析軟件分析每個視野中高亮紅色顆粒（Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白陽性表達）的積分吸光度（IA）值。
1.3.2 成骨細胞生物學功能檢測
培養 48 h 后兩組各取 2 孔細胞，PBS 洗 1 次；4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min；75% 乙醇浸泡，4℃ 下保存過夜；第 2 天 PBS 洗 1 次，3 min。每組其中 1 孔加 NBT/BCIP 液，37℃ 下染色 30 min；另 1 孔加茜素紅染色液，37℃ 下染色 20 min。dH2O 洗滌 1 次，水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察兩組成骨細胞形成情況及礦化結節形成情況。
1.3.3 TUNEL 熒光法檢測細胞凋亡
培養 48 h 后兩組各取 3 孔細胞，吸去細胞上清，PBS 洗 1 次；4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min；75% 乙醇浸泡，4℃ 下保存過夜；第 2 天 PBS 洗 1 次，3 min。參照 TUNEL 細胞凋亡試劑盒說明書操作，熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況。200 倍鏡下每張片隨機取 5 個視野，每個視野選取 100 個細胞，用 Image-Pro Plus 圖像分析軟件測算陽性染色細胞（高亮紅色顆粒）陽性率。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均值±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察
MC3T3-E1 細胞傳代接種至 12 孔板，4 h 后開始貼壁，24 h 后細胞基本完全貼壁，倒置相差顯微鏡下見細胞呈梭形。將細胞分組后繼續培養 48 h，可見兩組細胞均已長滿瓶底，變為細長的梭形，兩組細胞形態無明顯差異。見圖 1。
2.2 免疫熒光染色檢測成骨細胞相關蛋白表達
實驗組Ⅰ型膠原蛋白表達呈陽性，可見細胞質有大量散在、高亮的紅色顆粒；對照組Ⅰ型膠原蛋白表達呈弱陽性，細胞質中的紅色顆粒明顯少于實驗組。見圖 2。實驗組的 IA 值為 187 600±7 944，顯著高于對照組的 14 230±1 070，差異有統計學意義（t=43.680，P=0.001）。
實驗組和對照組Ⅲ型膠原蛋白表達均呈弱陽性，可見細胞質有少量散在、高亮的紅色顆粒。見圖 3。實驗組和對照組的 IA 值分別為 35 480±3 276 和 25 190±4 202，比較差異無統計學意義（t=1.976，P=0.119）。
2.3 成骨細胞生物學功能檢測
實驗組細胞 ALP 染色呈陽性，細胞膜和細胞質內均可見大量散在、深染的藍紫色顆粒；茜素紅染色也呈陽性，在細胞表面可見大量橘紅色鈣化結節形成；而對照組細胞 ALP 染色和茜素紅染色均呈陰性。見圖 4。
2.4 TUNEL 熒光法檢測細胞凋亡
實驗組 TUNEL 染色呈陽性，細胞核存在大量散在、高亮的紅色顆粒；而對照組 TUNEL 染色呈陰性。見圖 5。實驗組 TUNEL 染色細胞陽性率為 35.82%±2.99%，顯著高于對照組的 2.28%±0.51%，差異有統計學意義（t=23.420，P=0.002）。
圖1
兩組細胞培養 48 h 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×200）
a. 實驗組；b. 對照組
Figure1. Morphological observation of cells cultured for 48 hours in 2 groups (Inverted phase contrast microscope×200)a. Experimental group; b. Control group
圖2
免疫熒光染色觀察兩組細胞Ⅰ型膠原蛋白表達（熒光顯微鏡×1 000）
從左至右依次為 DAPI、Ⅰ 型膠原、二者疊加 a. 實驗組；b. 對照組
Figure2. Immunofluorescence staining observation of the expression of collagen type Ⅰ in 2 groups (Fluorescence microscope×1 000)From left to right for DAPI, collagen type Ⅰ, and merge, respectively a. Experimental group; b. Control group
圖3
免疫熒光染色觀察兩組細胞Ⅲ型膠原蛋白表達（熒光顯微鏡×1 000）
從左至右依次為 DAPI、Ⅲ型膠原、二者疊加 a. 實驗組；b. 對照組
Figure3. Immunofluorescence staining observation of the expression of collagen type Ⅲ in 2 groups (Fluorescence microscope×1 000)From left to right for DAPI, collagen type Ⅲ, and merge, respectively a. Experimental group; b. Control group
圖4
兩組細胞培養 48 h 生物學功能檢測（倒置相差顯微鏡×200）
a. 實驗組 ALP 染色；b. 對照組 ALP 染色；c. 實驗組茜素紅染色；d. 對照組茜素紅染色
Figure4. The biological function test of cells after cultured for 48 hours in 2 groups (Inverted phase contrast microscope×200)a. ALP staining of experimental group; b. ALP staining of control group; c. Alizarin red staining of experimental group; d. Alizarin red staining of control group
圖5
TUNEL 熒光法檢測兩組細胞凋亡情況（熒光顯微鏡×1 000）
從左至右依次為 DAPI、TUNEL、二者疊加 a. 實驗組；b. 對照組
Figure5. TUNEL fluorescence assay for the detection of cell apoptosis in 2 groups (Fluorescence microscope×1 000)From left to right for DAPI, TUNEL, and merge, respectively a. Experimental group; b. Control group
3 討論
既往研究表明，FTY720-P 可通過抑制破骨細胞的分化功能，減少骨損失，進而達到與自體骨移植類似的效果。此外，FTY720-P 還能夠促進成骨細胞的礦化成熟，主要是對細胞后期的礦化產生影響，但不影響細胞的生長和細胞周期[10]。本實驗中，我們選取小鼠胚胎成骨細胞前體細胞 MC3T3-E1 細胞進行研究，探討 FTY720-P 對其產生的作用，為后續進一步研究 FTY720-P 對破骨細胞-成骨細胞聯合培養體系的影響做好前期準備。
首先要了解骨重建及成骨細胞增殖分化的過程。骨重建的關鍵主要取決于成骨細胞與破骨細胞之間的競爭性相互作用[11-12]，而成骨細胞的生長過程主要經歷 4 個階段：細胞增殖、細胞外基質成熟、細胞外基質礦化和細胞凋亡，期間還有許多激素、體液等代謝產物影響骨重建，主要通過促進或抑制成骨細胞和破骨細胞的發育，增強或抑制成骨細胞和破骨細胞的活性促進骨再生[13]。在增殖期，成骨細胞的數量增多并伴隨著Ⅰ型膠原蛋白的合成與分泌，隨著Ⅰ型膠原蛋白進入細胞外基質，從而促進細胞外基質的成熟，使得細胞進入礦化期[14]。
另外，在細胞增殖、成熟、礦化和凋亡過程中涉及到 ALP、骨鈣素、膠原、IGF 和許多其他因素的調節[15]。ALP 是細胞外基質成熟的早期標志物，也是成骨細胞功能表達的一種表現形式，在成骨細胞礦化早期，ALP 分泌增加，作為骨細胞分化和骨組織形成的標志，ALP 活性升高提示成骨細胞高分化狀態[16]。當細胞外基質進入成熟階段，膠原繼續合成并進一步促進細胞外基質的交聯和成熟[17]，最后在成骨細胞分化后期，細胞進入礦化階段[18]。骨骼肌組織含有Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原和Ⅴ型膠原，其中Ⅰ型膠原蛋白的含量最豐富，Ⅰ型膠原蛋白形成緊密的長束，抗壓能力強，而Ⅲ型膠原形成疏松的網狀結構，其彈性較好[19-20]。骨組織由于缺乏Ⅲ型膠原，所以彈性較差，有足夠強度抵抗外界壓力。本實驗結果表明，FTY720-P 能促進 MC3T3-E1 細胞分泌大量作為細胞外基質早期成熟標記的 ALP，從而促進成骨細胞早期成熟。茜素紅染色呈陽性，表明培養 48 h 后，MC3T3-E1 細胞分化為成熟的成骨細胞，引起 ALP 的增加，并最終促進鈣化結節的形成。另一方面，在 FTY720-P 作用下，Ⅰ型膠原蛋白分泌明顯增加，在 FTY720-P 作用 48 h 后，免疫熒光染色結果顯示Ⅰ型膠原蛋白的表達呈陽性，且明顯高于對照組，提示細胞在藥物作用下能通過分泌大量Ⅰ型膠原蛋白，促進細胞外基質的成熟，從而使細胞進入礦化的早期階段。同時，本實驗結果還表明，雖然細胞可表達少量Ⅲ型膠原，但 FTY720-P 對其分泌無明顯影響，因此 FTY720-P 主要通過促進Ⅰ型膠原蛋白的分泌促進細胞外基質的成熟。
綜上述，本實驗通過形態學、ALP 染色、茜素紅染色以及成骨細胞相關蛋白表達的檢測，對成骨細胞分化的相關生物學指標進行了分析，結果表明 FTY720-P 能夠加速 MC3T3-E1 細胞成熟分化為成骨細胞。因此，在體外可利用 FTY720-P 將 MC3T3-E1 細胞誘導為成熟的成骨細胞，為下一步實驗奠定了良好基礎。但本研究仍存在一些不足，一方面，本實驗未能就其具體作用機制作進一步探討，還需后續深入研究。另一方面，實驗結果表明 FTY720-P 在促進 MC3T3-E1 細胞成熟的同時也會促進細胞凋亡，根據既有的研究結論，這與 FTY720-P 促進內質網大量釋放 Ca2+并最終導致細胞內鈣過量密切相關[21]，這會影響破骨細胞-成骨細胞聯合培養體系的建立。因此，如何在促進細胞分化成熟的同時減少細胞凋亡，也需進一步研究明確。
FTY720 是由冬蟲夏草培養液多球殼菌素合成的鞘氨醇類似物[1-2]，作為 S1P 受體激動劑，是一種作用機制與常規免疫抑制劑環孢素、他克莫司等不同的免疫抑制劑，可用于自體免疫疾病、器官移植、腫瘤等多種疾病的治療。S1P 受體是體內一種特異性受體，并在細胞增殖、分化、成熟等方面起著重要作用[3-5]。在體內，FTY720 可被磷酸化為具有生物活性的 FTY720-P。本課題組前期研究證明 FTY720-P 能夠抑制破骨細胞增殖[6]，并具有促進原代成骨細胞細胞外基質成熟的作用[7]。然而在前期實驗中，我們利用小鼠顱蓋骨直接提取原代細胞，建立成骨細胞培養模型。實驗過程中發現，該方法由于培養周期過長，且培養過程易受各種不穩定因素的影響，不適合用于后續破骨細胞-成骨細胞聯合培養體系。而 MC3T3-E1 細胞是小鼠胚胎成骨細胞前體細胞[8-9]，具有培養周期短、容易獲取、受細菌污染等不穩定因素影響較小等優勢，有利于后期更好地建立破骨細胞-成骨細胞聯合培養體系。因此我們選取 400 ng/mL FTY720-P 作用于 MC3T3-E1 細胞，在體外建立成骨細胞模型，并從細胞形態學、功能和細胞成熟相關蛋白及細胞凋亡等相關指標進行研究，以探討 FTY720-P 對 MC3T3-E1 細胞生長的影響，為下一步建立聯合培養體系并探討 FTY720-P 對聯合培養體系的影響奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
MC3T3-E1 細胞（ATCC 細胞庫，美國）；α-MEM（HyClone 公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；FTY720-P（Cayman 公司，美國）；四唑氮藍（nitroblue tetrazolium，NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP）-ALP 顯色試劑盒、TUNEL 細胞凋亡試劑盒（Roch 公司，瑞士）；茜素紅染色試劑盒（廣州外顯子生物技術有限公司）；兔Ⅲ型膠原蛋白抗體、兔Ⅰ型膠原蛋白抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）；熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）。
1.2 MC3T3-E1 細胞培養及實驗分組
將 MC3T3-E1 細胞置于 25 mL 培養瓶中，采用含 20%FBS、100 U/mL 青霉素和鏈霉素的 α-MEM 培養基，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，第 2 天換液；待細胞長滿瓶底后，用 0.25% 胰蛋白酶消化，按 1∶3 比例傳代，置于 25 mL 培養瓶中，采用含 10%FBS、100 U/mL 青霉素和鏈霉素的 α-MEM 培養基，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。至細胞完全貼壁后，加 0.25% 胰蛋白酶消化；輕輕吸出細胞，按 1.0×105 個/孔密度接種至 12 孔培養板（接種前每孔加入一爬片）。細胞完全貼壁后，分為兩組：實驗組采用含 400 ng/mL FTY720-P（以氯仿為溶劑）的基礎培養基，建立體外誘導成骨分化細胞模型；對照組采用僅含氯仿的基礎培養基。培養 48 h 后倒置相差顯微鏡觀察比較兩組細胞形態。
1.3 觀測指標
1.3.1 免疫熒光染色檢測成骨細胞相關蛋白表達
培養 48 h 后兩組各取 2 孔，先制備細胞爬片，吸去細胞上清，PBS 洗 1 次；4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min；75% 乙醇浸泡，4℃ 下保存過夜，第 2 天 PBS 洗 1 次，3 min；加入 0.5% Triton X-100，20 min 后吸去液體，PBS 洗 2 次，每次 3 min；加入 3% 牛血清白蛋白，37℃ 下靜置 30 min，吸去液體。每組其中 1 孔加入 100 μL 稀釋后的兔Ⅰ型膠原蛋白抗體（1∶100），另 1 孔加入 100 μL 稀釋后的兔Ⅲ型膠原蛋白抗體（1∶100），37℃ 下避光保存 1 h；PBS 洗 3 次，每次 5 min；依次加入 75%、85%、100% 乙醇脫水各 1 min，干燥，然后將孔中的細胞爬片取出，每張片分別加入 10 μL DAPI，封片，10 min 后熒光顯微鏡下觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達情況。200 倍鏡下每張隨機取 5 個視野，每個視野選取 100 個細胞，用 Image-Pro Plus 圖像分析軟件分析每個視野中高亮紅色顆粒（Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白陽性表達）的積分吸光度（IA）值。
1.3.2 成骨細胞生物學功能檢測
培養 48 h 后兩組各取 2 孔細胞，PBS 洗 1 次；4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min；75% 乙醇浸泡，4℃ 下保存過夜；第 2 天 PBS 洗 1 次，3 min。每組其中 1 孔加 NBT/BCIP 液，37℃ 下染色 30 min；另 1 孔加茜素紅染色液，37℃ 下染色 20 min。dH2O 洗滌 1 次，水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察兩組成骨細胞形成情況及礦化結節形成情況。
1.3.3 TUNEL 熒光法檢測細胞凋亡
培養 48 h 后兩組各取 3 孔細胞，吸去細胞上清，PBS 洗 1 次；4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min；75% 乙醇浸泡，4℃ 下保存過夜；第 2 天 PBS 洗 1 次，3 min。參照 TUNEL 細胞凋亡試劑盒說明書操作，熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況。200 倍鏡下每張片隨機取 5 個視野，每個視野選取 100 個細胞，用 Image-Pro Plus 圖像分析軟件測算陽性染色細胞（高亮紅色顆粒）陽性率。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均值±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察
MC3T3-E1 細胞傳代接種至 12 孔板，4 h 后開始貼壁，24 h 后細胞基本完全貼壁，倒置相差顯微鏡下見細胞呈梭形。將細胞分組后繼續培養 48 h，可見兩組細胞均已長滿瓶底，變為細長的梭形，兩組細胞形態無明顯差異。見圖 1。
2.2 免疫熒光染色檢測成骨細胞相關蛋白表達
實驗組Ⅰ型膠原蛋白表達呈陽性，可見細胞質有大量散在、高亮的紅色顆粒；對照組Ⅰ型膠原蛋白表達呈弱陽性，細胞質中的紅色顆粒明顯少于實驗組。見圖 2。實驗組的 IA 值為 187 600±7 944，顯著高于對照組的 14 230±1 070，差異有統計學意義（t=43.680，P=0.001）。
實驗組和對照組Ⅲ型膠原蛋白表達均呈弱陽性，可見細胞質有少量散在、高亮的紅色顆粒。見圖 3。實驗組和對照組的 IA 值分別為 35 480±3 276 和 25 190±4 202，比較差異無統計學意義（t=1.976，P=0.119）。
2.3 成骨細胞生物學功能檢測
實驗組細胞 ALP 染色呈陽性，細胞膜和細胞質內均可見大量散在、深染的藍紫色顆粒；茜素紅染色也呈陽性，在細胞表面可見大量橘紅色鈣化結節形成；而對照組細胞 ALP 染色和茜素紅染色均呈陰性。見圖 4。
2.4 TUNEL 熒光法檢測細胞凋亡
實驗組 TUNEL 染色呈陽性，細胞核存在大量散在、高亮的紅色顆粒；而對照組 TUNEL 染色呈陰性。見圖 5。實驗組 TUNEL 染色細胞陽性率為 35.82%±2.99%，顯著高于對照組的 2.28%±0.51%，差異有統計學意義（t=23.420，P=0.002）。
圖1
兩組細胞培養 48 h 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×200）
a. 實驗組；b. 對照組
Figure1. Morphological observation of cells cultured for 48 hours in 2 groups (Inverted phase contrast microscope×200)a. Experimental group; b. Control group
圖2
免疫熒光染色觀察兩組細胞Ⅰ型膠原蛋白表達（熒光顯微鏡×1 000）
從左至右依次為 DAPI、Ⅰ 型膠原、二者疊加 a. 實驗組；b. 對照組
Figure2. Immunofluorescence staining observation of the expression of collagen type Ⅰ in 2 groups (Fluorescence microscope×1 000)From left to right for DAPI, collagen type Ⅰ, and merge, respectively a. Experimental group; b. Control group
圖3
免疫熒光染色觀察兩組細胞Ⅲ型膠原蛋白表達（熒光顯微鏡×1 000）
從左至右依次為 DAPI、Ⅲ型膠原、二者疊加 a. 實驗組；b. 對照組
Figure3. Immunofluorescence staining observation of the expression of collagen type Ⅲ in 2 groups (Fluorescence microscope×1 000)From left to right for DAPI, collagen type Ⅲ, and merge, respectively a. Experimental group; b. Control group
圖4
兩組細胞培養 48 h 生物學功能檢測（倒置相差顯微鏡×200）
a. 實驗組 ALP 染色；b. 對照組 ALP 染色；c. 實驗組茜素紅染色；d. 對照組茜素紅染色
Figure4. The biological function test of cells after cultured for 48 hours in 2 groups (Inverted phase contrast microscope×200)a. ALP staining of experimental group; b. ALP staining of control group; c. Alizarin red staining of experimental group; d. Alizarin red staining of control group
圖5
TUNEL 熒光法檢測兩組細胞凋亡情況（熒光顯微鏡×1 000）
從左至右依次為 DAPI、TUNEL、二者疊加 a. 實驗組；b. 對照組
Figure5. TUNEL fluorescence assay for the detection of cell apoptosis in 2 groups (Fluorescence microscope×1 000)From left to right for DAPI, TUNEL, and merge, respectively a. Experimental group; b. Control group
3 討論
既往研究表明，FTY720-P 可通過抑制破骨細胞的分化功能，減少骨損失，進而達到與自體骨移植類似的效果。此外，FTY720-P 還能夠促進成骨細胞的礦化成熟，主要是對細胞后期的礦化產生影響，但不影響細胞的生長和細胞周期[10]。本實驗中，我們選取小鼠胚胎成骨細胞前體細胞 MC3T3-E1 細胞進行研究，探討 FTY720-P 對其產生的作用，為后續進一步研究 FTY720-P 對破骨細胞-成骨細胞聯合培養體系的影響做好前期準備。
首先要了解骨重建及成骨細胞增殖分化的過程。骨重建的關鍵主要取決于成骨細胞與破骨細胞之間的競爭性相互作用[11-12]，而成骨細胞的生長過程主要經歷 4 個階段：細胞增殖、細胞外基質成熟、細胞外基質礦化和細胞凋亡，期間還有許多激素、體液等代謝產物影響骨重建，主要通過促進或抑制成骨細胞和破骨細胞的發育，增強或抑制成骨細胞和破骨細胞的活性促進骨再生[13]。在增殖期，成骨細胞的數量增多并伴隨著Ⅰ型膠原蛋白的合成與分泌，隨著Ⅰ型膠原蛋白進入細胞外基質，從而促進細胞外基質的成熟，使得細胞進入礦化期[14]。
另外，在細胞增殖、成熟、礦化和凋亡過程中涉及到 ALP、骨鈣素、膠原、IGF 和許多其他因素的調節[15]。ALP 是細胞外基質成熟的早期標志物，也是成骨細胞功能表達的一種表現形式，在成骨細胞礦化早期，ALP 分泌增加，作為骨細胞分化和骨組織形成的標志，ALP 活性升高提示成骨細胞高分化狀態[16]。當細胞外基質進入成熟階段，膠原繼續合成并進一步促進細胞外基質的交聯和成熟[17]，最后在成骨細胞分化后期，細胞進入礦化階段[18]。骨骼肌組織含有Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原和Ⅴ型膠原，其中Ⅰ型膠原蛋白的含量最豐富，Ⅰ型膠原蛋白形成緊密的長束，抗壓能力強，而Ⅲ型膠原形成疏松的網狀結構，其彈性較好[19-20]。骨組織由于缺乏Ⅲ型膠原，所以彈性較差，有足夠強度抵抗外界壓力。本實驗結果表明，FTY720-P 能促進 MC3T3-E1 細胞分泌大量作為細胞外基質早期成熟標記的 ALP，從而促進成骨細胞早期成熟。茜素紅染色呈陽性，表明培養 48 h 后，MC3T3-E1 細胞分化為成熟的成骨細胞，引起 ALP 的增加，并最終促進鈣化結節的形成。另一方面，在 FTY720-P 作用下，Ⅰ型膠原蛋白分泌明顯增加，在 FTY720-P 作用 48 h 后，免疫熒光染色結果顯示Ⅰ型膠原蛋白的表達呈陽性，且明顯高于對照組，提示細胞在藥物作用下能通過分泌大量Ⅰ型膠原蛋白，促進細胞外基質的成熟，從而使細胞進入礦化的早期階段。同時，本實驗結果還表明，雖然細胞可表達少量Ⅲ型膠原，但 FTY720-P 對其分泌無明顯影響，因此 FTY720-P 主要通過促進Ⅰ型膠原蛋白的分泌促進細胞外基質的成熟。
綜上述，本實驗通過形態學、ALP 染色、茜素紅染色以及成骨細胞相關蛋白表達的檢測，對成骨細胞分化的相關生物學指標進行了分析，結果表明 FTY720-P 能夠加速 MC3T3-E1 細胞成熟分化為成骨細胞。因此，在體外可利用 FTY720-P 將 MC3T3-E1 細胞誘導為成熟的成骨細胞，為下一步實驗奠定了良好基礎。但本研究仍存在一些不足，一方面，本實驗未能就其具體作用機制作進一步探討，還需后續深入研究。另一方面，實驗結果表明 FTY720-P 在促進 MC3T3-E1 細胞成熟的同時也會促進細胞凋亡，根據既有的研究結論，這與 FTY720-P 促進內質網大量釋放 Ca2+并最終導致細胞內鈣過量密切相關[21]，這會影響破骨細胞-成骨細胞聯合培養體系的建立。因此，如何在促進細胞分化成熟的同時減少細胞凋亡，也需進一步研究明確。
