引用本文： 鹿亮, 劉彬, 尚希福, 張雨, 陳偉健, 劉舒云, 黃靖香, 汪愛媛, 郭全義, 盧世璧. 脫細胞軟骨細胞外基質取向支架復合軟骨細胞構建組織工程軟骨的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(3): 291-297. doi: 10.7507/1002-1892.201710095 復制
關節軟骨損傷是臨床常見損傷，可由創傷、退變、炎癥、腫瘤等導致。由于軟骨組織缺乏血管與淋巴管，一旦損傷難以自行修復，最終導致關節功能喪失，降低患者生活質量。組織工程是目前最有可能解決此難題的技術手段之一[1-2]。支架材料作為組織工程的重要因素之一，除了為種子細胞提供具有力學支撐和引導細胞生長的空間結構外，還應為細胞提供理想的生長微環境，支持細胞黏附、增殖、分化，最終形成新的軟骨組織[3-5]。近年來，研究人員已經成功開發出不同類型的軟骨組織工程產品，而且部分已經應用于臨床，并獲得了一定效果[6-7]。中國人民解放軍總醫院骨科研究所的前期研究發現，脫細胞軟骨細胞外基質（acellular cartilage extracellular matrix，ACECM）取向支架具有極低的免疫原性和良好的生物安全性，可作為軟骨組織工程的理想支架材料[8-11]。本次研究擬將豬軟骨細胞接種至 ACECM 取向支架，體外構建組織工程軟骨，觀察該支架對軟骨細胞生物學行為的影響，然后將構建的復合物植入裸鼠體內，通過 PKH26 熒光標記和分子熒光活體成像系統，無創傷性評估復合物在體內的生長情況，為以 ACECM 取向支架為載體構建組織工程軟骨并修復關節軟骨缺損奠定實驗基礎。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
關節軟骨組織來自市售健康豬膝關節。雌性 BALB/c 裸鼠 3 只，體質量 18～20 g，由中國人民解放軍總醫院動物實驗中心提供。ACECM 取向支架由中國人民解放軍總醫院骨科研究所前期研究制備，直徑 8 mm、高 4 mm。PKH26 熒光染料（北京化學試劑有限公司）；Ⅱ型膠原酶、DMEM、FBS（Sigma 公司，美國）；BH-2 倒置顯微鏡、IX70 熒光顯微鏡、分子熒光活體成像系統（Olympus 公司，日本）。
1.2 軟骨細胞分離及培養
無菌條件下，取豬膝關節軟骨組織，D-Hank’s 平衡液清洗后剪成 1 mm×1 mm×1 mm 大小；37℃ 下采用 0.15%Ⅱ型膠原酶消化 1 h；取上懸液，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 5 min；棄上清液，沉淀用 30 倍體積 D-Hank’s 平衡液清洗、同上法離心 3 次，DMEM 清洗 1 次；加入含 20%FBS 的軟骨細胞培養液，置于 37℃、5%CO2 培養箱內進行培養，每隔 3～4 d 更換培養基，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞融合達 80% 后進行傳代。取第 3 代細胞進行實驗。
取部分第 3 代軟骨細胞，采用 PKH26 熒光染料進行標記后，制成密度為 1×107個/mL 的細胞懸液。熒光顯微鏡下觀察，以呈紅色熒光表示標記成功；采用 MTT 法測定標記與未標記細胞連續 9 d 生長曲線，觀察 PKH26 標記是否影響軟骨細胞增殖。
1.3 細胞-支架復合物構建及觀測
1.3.1 細胞-支架復合物構建
取 ACECM 取向支架置于完全培養基中浸泡 2 h，取出后用吸水紙盡量吸干水分，備用。取 PKH26 標記以及未標記的第 3 代軟骨細胞，以離心半徑 5 cm、1 500 r/min 離心 5 min 后，棄上清液，滴加培養基制備濃度為 1×107個/mL 的細胞懸液。用 100 μL 移液槍頭將細胞懸液注射至 ACECM 取向支架內部，每個支架注射 100 μL 細胞懸液（1×106個細胞）。然后，將細胞-支架復合體移入 37℃、5%CO2 培養箱內孵育 2 h。期間每隔 30 min 滴加 10 μL 軟骨細胞培養液，并翻轉支架。之后，各孔緩慢加入 5 mL 軟骨細胞培養液，隔日換液。
1.3.2 細胞-支架復合物觀測
① 大體觀察：培養 7 d，取未標記細胞-支架復合物觀察大體形態、色澤和體積變化。② 細胞形態觀察：培養 1 d，取未標記細胞-支架復合物行 Hoechst33258 染色觀察；培養 7 d 時行 AO-PI 染色觀察細胞活性，倒置顯微鏡觀察軟骨細胞在支架上的形態、黏附、增殖及分布排列方式。培養 1、7 d，取標記細胞-支架復合物于熒光顯微鏡下觀察軟骨細胞生長情況。③ 掃描電鏡觀察：培養 3 d，取未標記細胞-支架復合物，掃描電鏡下觀察軟骨細胞在支架上的形態、黏附、增殖及分布排列方式。④ Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察：培養 7 d，取未標記細胞-支架復合物，OCT 包埋，冰凍切片機切片，片厚 10 μm，95% 乙醇固定，血清封閉。4℃、鼠抗人Ⅱ型膠原一抗孵育過夜，羊抗鼠 FITC 標記的熒光抗體常溫下孵育 40 min，90% 甘油封片，熒光顯微鏡觀察軟骨細胞復合支架培養后Ⅱ型膠原蛋白分泌情況。
1.4 動物體內實驗
1.4.1 體內植入細胞-支架復合物
取 PKH26 標記的軟骨細胞，參照 1.3.1 方法接種于 ACECM 取向支架，構建細胞-支架復合物；置于 37℃、5%CO2 培養箱內孵育 3 d 后，進行裸鼠皮下植入實驗。取 3 只裸鼠，肌肉注射 20% 烏拉坦（0.1 mL/10 g）麻醉后，術區聚維酮碘消毒、鋪巾。裸鼠背部頸段和腰段正中各作一長 1 cm 的切口，向左、右側皮下鈍性分離約 1.5 cm 淺筋膜層，各形成一皮下腔隙。左、右側腔隙內分別植入 1 枚細胞-支架復合物和 1 枚單純支架，縫合切口。術后按 SPF 標準飼養，于植入后 4 周取材進行觀測。
1.4.2 觀測項目
① 一般情況：觀察術后裸鼠活動、飲食及存活情況。② 分子熒光活體成像系統觀察：術后 4 周，同上法麻醉裸鼠后，采用分子熒光活體成像系統無創傷性評估細胞-支架復合物生長情況。裸鼠固定于仰臥位，置入 Kodak In Vivo Imaging Systems FX 系統，激發光 450～570 nm /發射光 570～700 nm，曝光時間 2 min，光圈范圍 4 cm，分辨率 650 dpi，外直徑>4.8 cm。③ 組織學觀察：將細胞-支架復合物標本置于 2.5% 戊二醛固定，石蠟包埋，切片，片厚 0.8 μm。取切片分別行番紅 O 染色以及甲苯胺藍染色，光鏡觀察軟骨細胞在支架中分泌細胞外基質的情況。單純支架作相應處理。④ Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察：取細胞-支架復合物標本切片并常規染色，倒置顯微鏡觀察軟骨細胞在支架中分泌的Ⅱ型膠原蛋白情況。單純支架作相應處理。
1.5 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨細胞培養觀察
倒置顯微鏡下觀察示，經Ⅱ型膠原酶消化分離、培養后，細胞主要呈多角形或鵝卵石樣形態，折光性好，立體感強，呈不規則立體“鋪路石”樣，細胞之間有松散的絲狀膠原纖維連接（圖 1a）；傳代培養后，第 3 代細胞呈多邊形或類圓形，細胞形態更均一，處于分裂期的細胞較多，細胞增殖活性較好（圖 1b）。
軟骨細胞經 PKH26 標記后，熒光顯微鏡下呈紅色熒光，表示標記成功。MTT 檢測示，培養 9 d 內各時間點標記與未標記細胞吸光度（A）值比較，差異均無統計學意義（P>0.05），表明 PKH26 標記對軟骨細胞增殖無影響（圖 1c）。
圖1
軟骨細胞觀察
a. 倒置顯微鏡下觀察原代軟骨細胞形態（×100）；b. 倒置顯微鏡下觀察第 3 代細胞形態（×40）；c. 標記與未標記細胞生長曲線
Figure1. Characteristic observation of chondrocytesa. Morphological observation of the primary passage chondrocytes by inverted microscope (×100); b. Morphological observation of the 3rd passage chondrocytes by inverted microscope (×40); c. The growth curves of unlabeled and labeled chondrocytes
2.2 細胞-支架復合物體外構建觀察
2.2.1 大體觀察
體外培養 7 d 后，未標記細胞-支架復合物結構完整，無碎屑脫落及碎裂，支架與培養前比較無明顯皺縮和降解，外觀變為半透明、粉白色，鉗夾彈性明顯，用鑷子不能輕易夾起，但是硬度與正常軟骨相比較弱（圖 2a）。
2.2.2 細胞形態觀察
未標記細胞-支架復合物培養 1 d，Hoechst33258 染色顯示細胞沿支架管道柱狀排列且均勻（圖 2b）；培養 7 d，AO-PI 染色提示細胞活性達 95% 以上（圖 2c、d），細胞沿支架管道黏附生長良好，分泌的基質填充支架空隙。
標記細胞-支架復合物培養 1 d 熒光顯微鏡下觀察示，呈紅色的軟骨細胞橫向沿支架空隙周圍排列，縱向沿管道為柱狀排列結構，均勻分布在支架內部（圖 2e、f）；培養 7 d 可見熒光強度增強，提示細胞增長快并分泌了大量基質（圖 2g、h）。
圖2
細胞-支架復合物體外培養觀察
a. 培養 7 d 未標記細胞-支架復合物大體觀察； b. 培養 1 d 未標記細胞-支架復合物 Hoechst 33258 染色觀察（熒光顯微鏡×100）；c、d. 培養 7 d 未標記細胞-支架復合物橫切面及縱切面 AO-PI 染色觀察（熒光顯微鏡×100）； e、f. 培養 1 d 標記細胞-支架復合物橫切面及縱切面觀察（熒光顯微鏡×100）；g、h. 培養 7 d 標記細胞-支架復合物橫切面及縱切面觀察（熒光顯微鏡×100）
Figure2. Observation of cell-scaffold complex after cultivation in vitroa. Gross observation of unlabeled cell-scaffold complex after cultivation for 7 days; b. Hoechst 33258 staining of unlabeled cell-scaffold complex after cultivation for 1 day (Fluorescence microscope×100); c, d. AO-PI staining of the cross section and longitudinal section of unlabeled cell-scaffold complex after cultivation for 7 days (Fluorescence microscope×100); e, f. The cross section and longitudinal section of labeled cell-scaffold complex after cultivation for 1 day (Fluorescence microscope×100); g, h. The cross section and longitudinal section of labeled cell-scaffold complex after cultivation for 7 days (Fluorescence microscope×100)
2.2.3 掃描電鏡觀察
培養 3 d，未標記細胞-支架復合物的支架表面及空隙內細胞為圓球形，沿支架管道柱狀排列（圖 3a），可見細胞外基質分泌，軟骨細胞與支架表面黏附良好，分泌的細胞外基質廣泛分布至支架內部（圖 3b）。
圖3
培養 3 d 未標記細胞-支架復合物掃描電鏡觀察
a. ×200；b. ×500
Figure3. Scanning electric microscope observation of unlabeled cell-scaffold complex after cultivation for 3 daysa. ×200; b. ×500
2.2.4 Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察
培養 7 d，未標記細胞-支架復合物的支架內部有大量細胞存在（圖 4a），Ⅱ 型膠原免疫熒光染色呈陽性，顯示紅色熒光（圖 4b），兩視野重疊細胞呈粉色熒光（圖 4c）。
圖4
培養 7 d 未標記細胞-支架復合物Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100）
a. Hoechst33258 染色；b. Ⅱ 型膠原免疫熒光染色；c. 兩視野重疊
Figure4. Type Ⅱ collagen immunofluorescence staining of unlabeled cell-scaffold complex after cultivation for 7 days (Fluorescence microscope×100)a. Hoechst33258 staining; b. Type Ⅱ collagen immunofluorescence staining; c. Merge figures a and b
2.3 動物體內實驗
2.3.1 一般情況
術后裸鼠活動及飲食均未見異常，觀察期內無死亡，無感染發生。
2.3.2 分子熒光活體成像系統觀察
術后 4 周，在激發光下可見裸鼠皮下植入部位呈圓形強熒光，利用色彩加強獲得紅色熒光圖像，X 線攝裸鼠大體圖像，兩圖像疊加后可見支架所處位置有明顯熒光，邊界清晰，其他位置未見明顯熒光（圖 5）。
圖5
術后 4 周分子熒光活體成像系統觀察
a.裸鼠背部激發圓形強熒光；b. X 線掃描；c. 兩者疊加圖片
Figure5. Molecular fluorescent living imaging system observation of cells-scaffold complex after transplantation for 4 weeksa. Strong fluorescence on the back of nude mouse; b. X-ray scanning result; c. Merge figures a and b
2.3.3 組織學及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察
鏡下觀察細胞-支架復合物為類軟骨樣組織，番紅 O、甲苯胺藍染色呈陽性。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，樣本中細胞及其周圍細胞外基質均呈陽性，支架內部鑲嵌的細胞染色較周圍組織深，細胞呈圓形，分布均勻，可見“陷窩”樣結構。而單純支架植入裸鼠皮下后，支架孔隙中未見明顯細胞外基質填充，番紅 O、甲苯胺藍染色呈陰性，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色孔隙中未見到陽性表達（圖 6）。
圖6
術后 4 周組織學觀察（×100）
從左至右分別為番紅 O 染色、甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色 a. 細胞-支架復合物；b. 單純ACECM取向支架
Figure6. Histological staining observation after transplantation for 4 weeks (×100)From left to right for Safranin O staining, toluidine blue staining, and typeⅡcollagen immunohistochemical staining, respectively a. Cell-scaffold complex; b. ACECM oriented scaffold
3 討論
目前，國內外學者分別利用 BMSCs 與各種類型三維支架在體外成功構建出組織工程軟骨樣組織，其采用的支架材料來源廣泛，主要分為合成材料、天然材料以及天然材料與合成材料的復合材料[4, 12-15]。合成材料具有來源廣泛、力學強度好等優勢，但是存在生物相容性不理想、體內降解產物具有毒性的缺點，影響了該類材料的廣泛應用[16-17]。而天然材料具有良好的生物相容性，有利于種子細胞黏附、生長和分化，但是也存在力學性能差、體內降解快、不易控制的缺點[5, 18]。本實驗室經過前期探索和研究，采用豬關節軟骨組織，經過濕法粉碎、梯度離心和冷凍干燥，成功制備 ACECM 取向支架；該支架具有良好生物相容性、較滿意力學性能，并且能夠維持軟骨細胞表型，促進軟骨細胞分泌細胞外基質[19]。
在前期研究基礎上，本次研究旨在探索采用豬軟骨細胞復合 ACECM 取向支架構建組織工程軟骨的可行性。軟骨細胞種植至 ACECM 取向支架中，培養 1 d 后發現軟骨細胞黏附至支架空隙中，7 d 時細胞已填充了支架空隙的大部分空間，且順著支架的取向性空隙定向排列。提示具有成分仿生的 ACECM 取向支架生物相容性良好，接種后早期軟骨細胞即可黏附且增殖很快，支架的仿生性取向結構引導了細胞的定向生長，為后期構建組織工程組織的內部結構奠定了基礎。軟骨細胞復合支架培養 3 d 后，掃描電鏡下可見細胞黏附在支架表面成簇生長，高倍鏡下可見細胞周圍已初步形成一些膠原纖維絲包繞著細胞，拓樸結構較為明顯。培養 7 d，Ⅱ 型膠原免疫熒光染色呈陽性，說明接種至 ACECM 支架中的軟骨細胞能維持其表型，分泌了大量Ⅱ型膠原蛋白。
為了進一步探討軟骨細胞復合 ACECM 取向支架體內構建組織工程軟骨的可行性，我們應用標記性能穩定且對細胞活性無影響的 PKH26 熒光染料對軟骨細胞進行標記，對移植到裸鼠皮下的軟骨細胞進行示蹤[20]。本實驗結果也證實，PKH26 熒光染料標記軟骨細胞，染色均勻，并且不影響細胞增殖。軟骨細胞與 ACECM 取向支架體外復合培養 3 d 后，植入到裸鼠背部皮下，4 周后裸鼠皮下生成白色、質硬、光滑組織，組織學和免疫組織化學染色顯示細胞嵌在細胞外基質中，周圍番紅 O、甲苯胺藍、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性，表明組織中含有糖胺聚糖、硫酸軟骨素以及Ⅱ型膠原成分，生成的組織為類軟骨組織。表明在裸鼠皮下微環境，接種至 ACECM 取向支架的軟骨細胞生長、細胞增殖良好和能分泌細胞外基質，實現組織工程軟骨的構建。
ACECM 取向支架具有成分和結構上的雙重仿生，材料來源于關節軟骨細胞外基質成分，對軟骨細胞具有很好地生物相容性，有利于細胞的黏附，促進細胞增殖和細胞外基質成分的分泌。另外，支架材料的取向性結構是仿生天然關節軟骨組織中細胞的取向性分布所構建的，有利于引導細胞在支架中呈現取向性生長。在天然軟骨組織中表層軟骨細胞與膠原纖維呈平行排布，有利于降低關節軟骨表面發生相對運動的摩擦力；而在軟骨組織的深層，軟骨細胞和膠原纖維呈現明顯的縱向分布，這主要有利于關節軟骨承受更大的力學負荷和力學傳遞，更好地保護軟骨下骨。ACECM 取向支架在早期能引導支架中的軟骨細胞取向性地黏附和生長，從而也促使細胞分泌的細胞外基質成分（如膠原蛋白）縱向分布，最終使構建的工程化軟骨組織空間結構更加符合天然軟骨組織。這一結構對提高新生組織的力學性能具有重要意義，也更有利于關節軟骨功能的發揮。
綜上述，ACECM 取向支架從組織成分和空間結構上雙重仿生構建軟骨組織工程支架，能為軟骨細胞體外模擬重建天然微環境，促進軟骨細胞的增殖，加快天然軟骨組織的再次重建和形成，有望作為軟骨組織工程支架材料。
關節軟骨損傷是臨床常見損傷，可由創傷、退變、炎癥、腫瘤等導致。由于軟骨組織缺乏血管與淋巴管，一旦損傷難以自行修復，最終導致關節功能喪失，降低患者生活質量。組織工程是目前最有可能解決此難題的技術手段之一[1-2]。支架材料作為組織工程的重要因素之一，除了為種子細胞提供具有力學支撐和引導細胞生長的空間結構外，還應為細胞提供理想的生長微環境，支持細胞黏附、增殖、分化，最終形成新的軟骨組織[3-5]。近年來，研究人員已經成功開發出不同類型的軟骨組織工程產品，而且部分已經應用于臨床，并獲得了一定效果[6-7]。中國人民解放軍總醫院骨科研究所的前期研究發現，脫細胞軟骨細胞外基質（acellular cartilage extracellular matrix，ACECM）取向支架具有極低的免疫原性和良好的生物安全性，可作為軟骨組織工程的理想支架材料[8-11]。本次研究擬將豬軟骨細胞接種至 ACECM 取向支架，體外構建組織工程軟骨，觀察該支架對軟骨細胞生物學行為的影響，然后將構建的復合物植入裸鼠體內，通過 PKH26 熒光標記和分子熒光活體成像系統，無創傷性評估復合物在體內的生長情況，為以 ACECM 取向支架為載體構建組織工程軟骨并修復關節軟骨缺損奠定實驗基礎。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
關節軟骨組織來自市售健康豬膝關節。雌性 BALB/c 裸鼠 3 只，體質量 18～20 g，由中國人民解放軍總醫院動物實驗中心提供。ACECM 取向支架由中國人民解放軍總醫院骨科研究所前期研究制備，直徑 8 mm、高 4 mm。PKH26 熒光染料（北京化學試劑有限公司）；Ⅱ型膠原酶、DMEM、FBS（Sigma 公司，美國）；BH-2 倒置顯微鏡、IX70 熒光顯微鏡、分子熒光活體成像系統（Olympus 公司，日本）。
1.2 軟骨細胞分離及培養
無菌條件下，取豬膝關節軟骨組織，D-Hank’s 平衡液清洗后剪成 1 mm×1 mm×1 mm 大小；37℃ 下采用 0.15%Ⅱ型膠原酶消化 1 h；取上懸液，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 5 min；棄上清液，沉淀用 30 倍體積 D-Hank’s 平衡液清洗、同上法離心 3 次，DMEM 清洗 1 次；加入含 20%FBS 的軟骨細胞培養液，置于 37℃、5%CO2 培養箱內進行培養，每隔 3～4 d 更換培養基，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞融合達 80% 后進行傳代。取第 3 代細胞進行實驗。
取部分第 3 代軟骨細胞，采用 PKH26 熒光染料進行標記后，制成密度為 1×107個/mL 的細胞懸液。熒光顯微鏡下觀察，以呈紅色熒光表示標記成功；采用 MTT 法測定標記與未標記細胞連續 9 d 生長曲線，觀察 PKH26 標記是否影響軟骨細胞增殖。
1.3 細胞-支架復合物構建及觀測
1.3.1 細胞-支架復合物構建
取 ACECM 取向支架置于完全培養基中浸泡 2 h，取出后用吸水紙盡量吸干水分，備用。取 PKH26 標記以及未標記的第 3 代軟骨細胞，以離心半徑 5 cm、1 500 r/min 離心 5 min 后，棄上清液，滴加培養基制備濃度為 1×107個/mL 的細胞懸液。用 100 μL 移液槍頭將細胞懸液注射至 ACECM 取向支架內部，每個支架注射 100 μL 細胞懸液（1×106個細胞）。然后，將細胞-支架復合體移入 37℃、5%CO2 培養箱內孵育 2 h。期間每隔 30 min 滴加 10 μL 軟骨細胞培養液，并翻轉支架。之后，各孔緩慢加入 5 mL 軟骨細胞培養液，隔日換液。
1.3.2 細胞-支架復合物觀測
① 大體觀察：培養 7 d，取未標記細胞-支架復合物觀察大體形態、色澤和體積變化。② 細胞形態觀察：培養 1 d，取未標記細胞-支架復合物行 Hoechst33258 染色觀察；培養 7 d 時行 AO-PI 染色觀察細胞活性，倒置顯微鏡觀察軟骨細胞在支架上的形態、黏附、增殖及分布排列方式。培養 1、7 d，取標記細胞-支架復合物于熒光顯微鏡下觀察軟骨細胞生長情況。③ 掃描電鏡觀察：培養 3 d，取未標記細胞-支架復合物，掃描電鏡下觀察軟骨細胞在支架上的形態、黏附、增殖及分布排列方式。④ Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察：培養 7 d，取未標記細胞-支架復合物，OCT 包埋，冰凍切片機切片，片厚 10 μm，95% 乙醇固定，血清封閉。4℃、鼠抗人Ⅱ型膠原一抗孵育過夜，羊抗鼠 FITC 標記的熒光抗體常溫下孵育 40 min，90% 甘油封片，熒光顯微鏡觀察軟骨細胞復合支架培養后Ⅱ型膠原蛋白分泌情況。
1.4 動物體內實驗
1.4.1 體內植入細胞-支架復合物
取 PKH26 標記的軟骨細胞，參照 1.3.1 方法接種于 ACECM 取向支架，構建細胞-支架復合物；置于 37℃、5%CO2 培養箱內孵育 3 d 后，進行裸鼠皮下植入實驗。取 3 只裸鼠，肌肉注射 20% 烏拉坦（0.1 mL/10 g）麻醉后，術區聚維酮碘消毒、鋪巾。裸鼠背部頸段和腰段正中各作一長 1 cm 的切口，向左、右側皮下鈍性分離約 1.5 cm 淺筋膜層，各形成一皮下腔隙。左、右側腔隙內分別植入 1 枚細胞-支架復合物和 1 枚單純支架，縫合切口。術后按 SPF 標準飼養，于植入后 4 周取材進行觀測。
1.4.2 觀測項目
① 一般情況：觀察術后裸鼠活動、飲食及存活情況。② 分子熒光活體成像系統觀察：術后 4 周，同上法麻醉裸鼠后，采用分子熒光活體成像系統無創傷性評估細胞-支架復合物生長情況。裸鼠固定于仰臥位，置入 Kodak In Vivo Imaging Systems FX 系統，激發光 450～570 nm /發射光 570～700 nm，曝光時間 2 min，光圈范圍 4 cm，分辨率 650 dpi，外直徑>4.8 cm。③ 組織學觀察：將細胞-支架復合物標本置于 2.5% 戊二醛固定，石蠟包埋，切片，片厚 0.8 μm。取切片分別行番紅 O 染色以及甲苯胺藍染色，光鏡觀察軟骨細胞在支架中分泌細胞外基質的情況。單純支架作相應處理。④ Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察：取細胞-支架復合物標本切片并常規染色，倒置顯微鏡觀察軟骨細胞在支架中分泌的Ⅱ型膠原蛋白情況。單純支架作相應處理。
1.5 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨細胞培養觀察
倒置顯微鏡下觀察示，經Ⅱ型膠原酶消化分離、培養后，細胞主要呈多角形或鵝卵石樣形態，折光性好，立體感強，呈不規則立體“鋪路石”樣，細胞之間有松散的絲狀膠原纖維連接（圖 1a）；傳代培養后，第 3 代細胞呈多邊形或類圓形，細胞形態更均一，處于分裂期的細胞較多，細胞增殖活性較好（圖 1b）。
軟骨細胞經 PKH26 標記后，熒光顯微鏡下呈紅色熒光，表示標記成功。MTT 檢測示，培養 9 d 內各時間點標記與未標記細胞吸光度（A）值比較，差異均無統計學意義（P>0.05），表明 PKH26 標記對軟骨細胞增殖無影響（圖 1c）。
圖1
軟骨細胞觀察
a. 倒置顯微鏡下觀察原代軟骨細胞形態（×100）；b. 倒置顯微鏡下觀察第 3 代細胞形態（×40）；c. 標記與未標記細胞生長曲線
Figure1. Characteristic observation of chondrocytesa. Morphological observation of the primary passage chondrocytes by inverted microscope (×100); b. Morphological observation of the 3rd passage chondrocytes by inverted microscope (×40); c. The growth curves of unlabeled and labeled chondrocytes
2.2 細胞-支架復合物體外構建觀察
2.2.1 大體觀察
體外培養 7 d 后，未標記細胞-支架復合物結構完整，無碎屑脫落及碎裂，支架與培養前比較無明顯皺縮和降解，外觀變為半透明、粉白色，鉗夾彈性明顯，用鑷子不能輕易夾起，但是硬度與正常軟骨相比較弱（圖 2a）。
2.2.2 細胞形態觀察
未標記細胞-支架復合物培養 1 d，Hoechst33258 染色顯示細胞沿支架管道柱狀排列且均勻（圖 2b）；培養 7 d，AO-PI 染色提示細胞活性達 95% 以上（圖 2c、d），細胞沿支架管道黏附生長良好，分泌的基質填充支架空隙。
標記細胞-支架復合物培養 1 d 熒光顯微鏡下觀察示，呈紅色的軟骨細胞橫向沿支架空隙周圍排列，縱向沿管道為柱狀排列結構，均勻分布在支架內部（圖 2e、f）；培養 7 d 可見熒光強度增強，提示細胞增長快并分泌了大量基質（圖 2g、h）。
圖2
細胞-支架復合物體外培養觀察
a. 培養 7 d 未標記細胞-支架復合物大體觀察； b. 培養 1 d 未標記細胞-支架復合物 Hoechst 33258 染色觀察（熒光顯微鏡×100）；c、d. 培養 7 d 未標記細胞-支架復合物橫切面及縱切面 AO-PI 染色觀察（熒光顯微鏡×100）； e、f. 培養 1 d 標記細胞-支架復合物橫切面及縱切面觀察（熒光顯微鏡×100）；g、h. 培養 7 d 標記細胞-支架復合物橫切面及縱切面觀察（熒光顯微鏡×100）
Figure2. Observation of cell-scaffold complex after cultivation in vitroa. Gross observation of unlabeled cell-scaffold complex after cultivation for 7 days; b. Hoechst 33258 staining of unlabeled cell-scaffold complex after cultivation for 1 day (Fluorescence microscope×100); c, d. AO-PI staining of the cross section and longitudinal section of unlabeled cell-scaffold complex after cultivation for 7 days (Fluorescence microscope×100); e, f. The cross section and longitudinal section of labeled cell-scaffold complex after cultivation for 1 day (Fluorescence microscope×100); g, h. The cross section and longitudinal section of labeled cell-scaffold complex after cultivation for 7 days (Fluorescence microscope×100)
2.2.3 掃描電鏡觀察
培養 3 d，未標記細胞-支架復合物的支架表面及空隙內細胞為圓球形，沿支架管道柱狀排列（圖 3a），可見細胞外基質分泌，軟骨細胞與支架表面黏附良好，分泌的細胞外基質廣泛分布至支架內部（圖 3b）。
圖3
培養 3 d 未標記細胞-支架復合物掃描電鏡觀察
a. ×200；b. ×500
Figure3. Scanning electric microscope observation of unlabeled cell-scaffold complex after cultivation for 3 daysa. ×200; b. ×500
2.2.4 Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察
培養 7 d，未標記細胞-支架復合物的支架內部有大量細胞存在（圖 4a），Ⅱ 型膠原免疫熒光染色呈陽性，顯示紅色熒光（圖 4b），兩視野重疊細胞呈粉色熒光（圖 4c）。
圖4
培養 7 d 未標記細胞-支架復合物Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100）
a. Hoechst33258 染色；b. Ⅱ 型膠原免疫熒光染色；c. 兩視野重疊
Figure4. Type Ⅱ collagen immunofluorescence staining of unlabeled cell-scaffold complex after cultivation for 7 days (Fluorescence microscope×100)a. Hoechst33258 staining; b. Type Ⅱ collagen immunofluorescence staining; c. Merge figures a and b
2.3 動物體內實驗
2.3.1 一般情況
術后裸鼠活動及飲食均未見異常，觀察期內無死亡，無感染發生。
2.3.2 分子熒光活體成像系統觀察
術后 4 周，在激發光下可見裸鼠皮下植入部位呈圓形強熒光，利用色彩加強獲得紅色熒光圖像，X 線攝裸鼠大體圖像，兩圖像疊加后可見支架所處位置有明顯熒光，邊界清晰，其他位置未見明顯熒光（圖 5）。
圖5
術后 4 周分子熒光活體成像系統觀察
a.裸鼠背部激發圓形強熒光；b. X 線掃描；c. 兩者疊加圖片
Figure5. Molecular fluorescent living imaging system observation of cells-scaffold complex after transplantation for 4 weeksa. Strong fluorescence on the back of nude mouse; b. X-ray scanning result; c. Merge figures a and b
2.3.3 組織學及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察
鏡下觀察細胞-支架復合物為類軟骨樣組織，番紅 O、甲苯胺藍染色呈陽性。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，樣本中細胞及其周圍細胞外基質均呈陽性，支架內部鑲嵌的細胞染色較周圍組織深，細胞呈圓形，分布均勻，可見“陷窩”樣結構。而單純支架植入裸鼠皮下后，支架孔隙中未見明顯細胞外基質填充，番紅 O、甲苯胺藍染色呈陰性，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色孔隙中未見到陽性表達（圖 6）。
圖6
術后 4 周組織學觀察（×100）
從左至右分別為番紅 O 染色、甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色 a. 細胞-支架復合物；b. 單純ACECM取向支架
Figure6. Histological staining observation after transplantation for 4 weeks (×100)From left to right for Safranin O staining, toluidine blue staining, and typeⅡcollagen immunohistochemical staining, respectively a. Cell-scaffold complex; b. ACECM oriented scaffold
3 討論
目前，國內外學者分別利用 BMSCs 與各種類型三維支架在體外成功構建出組織工程軟骨樣組織，其采用的支架材料來源廣泛，主要分為合成材料、天然材料以及天然材料與合成材料的復合材料[4, 12-15]。合成材料具有來源廣泛、力學強度好等優勢，但是存在生物相容性不理想、體內降解產物具有毒性的缺點，影響了該類材料的廣泛應用[16-17]。而天然材料具有良好的生物相容性，有利于種子細胞黏附、生長和分化，但是也存在力學性能差、體內降解快、不易控制的缺點[5, 18]。本實驗室經過前期探索和研究，采用豬關節軟骨組織，經過濕法粉碎、梯度離心和冷凍干燥，成功制備 ACECM 取向支架；該支架具有良好生物相容性、較滿意力學性能，并且能夠維持軟骨細胞表型，促進軟骨細胞分泌細胞外基質[19]。
在前期研究基礎上，本次研究旨在探索采用豬軟骨細胞復合 ACECM 取向支架構建組織工程軟骨的可行性。軟骨細胞種植至 ACECM 取向支架中，培養 1 d 后發現軟骨細胞黏附至支架空隙中，7 d 時細胞已填充了支架空隙的大部分空間，且順著支架的取向性空隙定向排列。提示具有成分仿生的 ACECM 取向支架生物相容性良好，接種后早期軟骨細胞即可黏附且增殖很快，支架的仿生性取向結構引導了細胞的定向生長，為后期構建組織工程組織的內部結構奠定了基礎。軟骨細胞復合支架培養 3 d 后，掃描電鏡下可見細胞黏附在支架表面成簇生長，高倍鏡下可見細胞周圍已初步形成一些膠原纖維絲包繞著細胞，拓樸結構較為明顯。培養 7 d，Ⅱ 型膠原免疫熒光染色呈陽性，說明接種至 ACECM 支架中的軟骨細胞能維持其表型，分泌了大量Ⅱ型膠原蛋白。
為了進一步探討軟骨細胞復合 ACECM 取向支架體內構建組織工程軟骨的可行性，我們應用標記性能穩定且對細胞活性無影響的 PKH26 熒光染料對軟骨細胞進行標記，對移植到裸鼠皮下的軟骨細胞進行示蹤[20]。本實驗結果也證實，PKH26 熒光染料標記軟骨細胞，染色均勻，并且不影響細胞增殖。軟骨細胞與 ACECM 取向支架體外復合培養 3 d 后，植入到裸鼠背部皮下，4 周后裸鼠皮下生成白色、質硬、光滑組織，組織學和免疫組織化學染色顯示細胞嵌在細胞外基質中，周圍番紅 O、甲苯胺藍、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性，表明組織中含有糖胺聚糖、硫酸軟骨素以及Ⅱ型膠原成分，生成的組織為類軟骨組織。表明在裸鼠皮下微環境，接種至 ACECM 取向支架的軟骨細胞生長、細胞增殖良好和能分泌細胞外基質，實現組織工程軟骨的構建。
ACECM 取向支架具有成分和結構上的雙重仿生，材料來源于關節軟骨細胞外基質成分，對軟骨細胞具有很好地生物相容性，有利于細胞的黏附，促進細胞增殖和細胞外基質成分的分泌。另外，支架材料的取向性結構是仿生天然關節軟骨組織中細胞的取向性分布所構建的，有利于引導細胞在支架中呈現取向性生長。在天然軟骨組織中表層軟骨細胞與膠原纖維呈平行排布，有利于降低關節軟骨表面發生相對運動的摩擦力；而在軟骨組織的深層，軟骨細胞和膠原纖維呈現明顯的縱向分布，這主要有利于關節軟骨承受更大的力學負荷和力學傳遞，更好地保護軟骨下骨。ACECM 取向支架在早期能引導支架中的軟骨細胞取向性地黏附和生長，從而也促使細胞分泌的細胞外基質成分（如膠原蛋白）縱向分布，最終使構建的工程化軟骨組織空間結構更加符合天然軟骨組織。這一結構對提高新生組織的力學性能具有重要意義，也更有利于關節軟骨功能的發揮。
綜上述，ACECM 取向支架從組織成分和空間結構上雙重仿生構建軟骨組織工程支架，能為軟骨細胞體外模擬重建天然微環境，促進軟骨細胞的增殖，加快天然軟骨組織的再次重建和形成，有望作為軟骨組織工程支架材料。
