引用本文： 張楠, 劉娜, 孫楚, 朱劍峰, 王東旭, 戴云峰, 吳云峰, 王亞明, 李軍雷, 趙德偉, 閆景龍. 新型微弧氧化涂層鎂-鋅-鈣合金支架/自體顆粒骨修復兔臨界性骨缺損的研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(3): 298-305. doi: 10.7507/1002-1892.201710003 復制
臨界性骨缺損（critical size bone defect，CSD）是指由嚴重的創傷、感染、骨腫瘤切除、人工關節置換術后翻修、先天畸形等原因引起的，達到一定長度或范圍后不能自然愈合，又不能通過單純固定解決的骨缺損[1]，一直是臨床骨科治療的難點。目前常用帶血管蒂骨移植修復大段骨缺損，但存在骨瓣營養血管位置不確定、手術創傷大、受局部血運影響大、學習曲線高、一旦失敗后果嚴重等問題[2-3]。自體顆粒骨移植雖然一直被認為是治療骨缺損的“金標準”[4]，但也存在供骨量有限、供區并發癥、結構松散、易被機體吸收等缺陷，在修復長骨缺損時常需同時植入金屬鈦網給予支撐穩定。但金屬鈦網無誘導成骨能力，植入后易引起局部塌陷、慢性炎癥、異物反應等并發癥；同時，因其不可降解會在體內永久存留，進而對機體造成不良影響[5]。近年來，由于鎂（Mg）及其合金機械性能與人骨接近[6-7]，Mg2+ 在維持細胞結構和功能方面具有重要作用[8-9]，人體內約一半含量的 Mg 存在于骨組織中[10-11]，而且 Mg 及其合金能夠促進局部鈣沉積，具有良好的骨傳導性和骨誘導性[12-14]。因此，Mg 合金作為一種潛在骨科內植物材料受到廣泛關注。
Mg 合金作為唯一具有可降解性的金屬生物材料，近年來雖然有研究將其作為骨替代物來嘗試修復骨缺損，并獲得良好效果[15-16]，但是將 Mg 合金制備成支架修復大段長骨缺損依然鮮有報道。本研究采用 Mg-鋅（Zn）-鈣（Ca）合金為材料，首次設計制造了一種新型中空圓柱形支架，這種結構在降低支架質量（約 50%）同時，還能維持足夠機械強度，內部類似皮質骨的空間允許填充自體顆粒骨，表面均勻分布的網孔有助于骨痂長入。我們假設結合自體顆粒骨誘導成骨的特性，發揮 Mg 合金良好的骨誘導性、可降解性和力學性能，嘗試利用這種新型支架修復 CSD。同時為了增加這種支架在體內的抗腐蝕性和生物相容性，我們采用微弧氧化（micro-arc oxidation，MAO）技術在其表面添加一層 10 μm 厚生物陶瓷涂層，并通過動物實驗來評估這種支架修復 CSD 的效果，同時進一步評估 MAO 涂層對支架體內抗腐蝕性和生物相容性的影響。
1 材料與方法
1.1 Mg-Zn-Ca 合金支架材料
本研究采用的 Mg-Zn-Ca 合金支架由哈爾濱工業大學材料學院提供，以 Mg-Zn-Ca 合金為主要基質材料［2.5 wt%～3.0 wt% Ca，0.7 wt%～1.3 wt% Zn，0.2 wt%錳（Mn）和純 Mg］，采用壓鑄工藝制備成圓柱形管狀支架（長 15 mm、內徑 3 mm、外徑 5 mm），表面均勻分布 12 個直徑 1 mm 的圓孔；并通過 MAO 技術對其表面改型，制備一層約 10 μm 厚的生物陶瓷涂層[17]，主要成分為 MgO，此外還含有 Mg 和 Ca 的磷酸鹽。見圖 1a。所有支架在植入前均采用環氧乙烷氣體消毒。
1.2 實驗動物及主要試劑、儀器
成年新西蘭白兔 72 只，雌雄各半，體質量（2.71±0.32）kg，由齊齊哈爾醫學院動物實驗中心提供。
戊巴比妥鈉（北京普博斯生物科技有限公司）；鈣黃綠素（Sigma-Aldrich 公司，美國）；Van Gieson 染色液（上海博谷生物科技有限公司）。CR-IR 357 Capsula X 線機（富士公司，日本）；Siemens Inveon Micro-CT、Inveon 軟件（Siemens 公司，德國）；EXAKT00CP 型切片機、EXAKT00CS 磨片機、DM4000B 熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；Hitachi 7600 自動生化分析儀（Hitachi 公司，日本）；X71 光學顯微鏡及成像系統（Olympus 公司，日本）。
1.3 實驗分組及造模方法
將新西蘭白兔隨機分為 3 組，每組 24 只。A 組：無涂層 Mg-Zn-Ca 合金支架組；B 組：MAO 涂層 Mg-Zn-Ca 合金支架組；C 組：單純自體顆粒骨植骨對照組。所有動物以 3% 戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉，四肢固定于手術臺上，雙側前肢剃毛備皮常規消毒。于前肢中段背側作 4 cm 弧形切口，切開皮膚分離組織顯露尺骨中段，用擺鋸截骨制備 15 mm 長 CSD 模型（圖 1b）。A、B 組將截取的尺骨咬碎制成顆粒骨（1～3 mm）填充于支架內，壓實后植入尺骨缺損處（圖 1c），生理鹽水反復沖洗后通過縫合肌肉及筋膜固定支架；C 組將自體顆粒骨原位植入至骨缺損部位。關閉切口后無菌包扎。造模后動物分籠飼養，可在無外固定情況下立即自由活動并充分飲食、水；預防性肌肉注射青霉素 80 萬 U 3 d，每天 2 次。術后 2、4、8、12 周每組各取 6 只動物進行研究。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
觀察動物一般狀態、活動、攝入食水、體質量、切口愈合及炎性并發癥發生情況等；同時監測 A、B 組動物局部皮下積氣情況，利用無菌注射器局部穿刺收集局部皮下積氣，記錄積氣量。
1.4.2 X 線片觀察
利用 CR-IR 357 Capsula X 線機行側位 X 線掃描，投射條件：70 V，0.69 mA，1.5 s。掃描后由 3 位放射科醫師采用雙盲法對骨缺損愈合情況進行評分，采用 Lane-Sandhu 評分標準[18]，范圍從 0 分（未治療）到 12 分（恢復正常骨結構），7 分以上認為骨缺損初步愈合。
1.4.3 Micro-CT 掃描
利用 Siemens Inveon Micro-CT 在電壓 80 kV、電流 500 μA 下掃描，利用 Inveon 軟件對數據進行處理。鑒于 C 組無支架，因此僅觀察 A、B 組術后支架降解情況及術后 12 周缺損部位新骨形態。按以下公式計算術后 4、8、12 周支架降解丟失體積百分比（ΔV）和降解速度（corrosion rate，CR），ΔV=（V0–Vx）/V0×100%，其中 V0 為支架初始體積，Vx 為不同時間點支架剩余體積；CR=（V0–Vx）/（A×t），其中 A 是支架初始面積，t 是術后時間（單位為年）。
1.4.4 血清學指標檢測
術后各時間點處死實驗動物前，清晨空腹耳緣靜脈采血，抗凝，將血樣置于室溫下靜止 1 h，以離心半徑 20 cm、3 500 r/min 離心 10 min，分離上清液，采用 Hitachi 7600 自動生化分析儀測量血清中 Mg2+ 和 Ca2+ 濃度。
1.4.5 Van Gieson 染色觀察
術后各時間點采用驅血法處死動物后收集前肢，去除皮膚軟組織剝離尺骨，70% 乙醇固定；梯度乙醇真空脫水、透明、脫脂、包埋，然后固定于 EXAKT00CP 型切片機切成 200 μm 厚硬組織切片，EXAKT00CS 磨片機依次以 800、1 200、2 500 目水砂紙打磨拋光獲得 50 μm 厚骨磨片；常規 Van Gieson 染色后，4 倍光鏡下觀察缺損部位新生骨組織形態。
1.4.6 組織病理學觀察
術后 12 周處死各組動物后收集腦、肝、腎和脾組織，常規行 HE 染色，20 倍光鏡下觀察組織結構。
1.5 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均值±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
所有實驗動物均耐受手術，術后麻醉蘇醒后即可自由活動；術后 2 d 食欲較差，考慮麻醉或術后疼痛所致；2 d 后一般狀態可，患肢活動良好、體質量無明顯減輕，切口無炎性反應；術后 1 周左右切口愈合，10 d 后拆線。
局部穿刺收集皮下積氣顯示，A、B 組皮下積氣量均隨植入時間延長而增加，于 8 周達高峰后迅速減少。術后 2、4、8 周 B 組皮下積氣量少于 A 組，2、4 周時兩組間比較差異有統計學意義（t=2.651，P=0.023；t=2.544，P=0.013），8周時差異無統計學意義（t=1.687，P=0.120）；但術后 12 周時 B 組積氣量多于 A 組，差異亦有統計學意義（t=2.343，P=0.039）。見圖 2。
2.2 X 線片觀察
X 線片觀察示，術后 2 周時各組均未見明顯骨痂生成。2 周后 C 組骨缺損修復效果良好，僅 12 周時在局部存在一定程度的骨吸收。與 C 組比較，A、B 組術后 4 周植入物周圍僅可見少量骨痂生成，但隨后顯著增多，8 周時骨缺損部分修復，支架外可觀察到新生骨橋形成，12 周時缺損完全修復，同時可觀察到 B 組新生骨組織塑形明顯優于 A 組。見圖 3。
術后 4、8 周 C 組 X 線片評分顯著高于 A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 8 周時 B 組顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。術后 12 周 B、C 組顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）；但 B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
2.3 Micro-CT 掃描
Micro-CT 掃描觀察示，術后 12 周，可見 A、B 組骨缺損部位由大量新生骨填充，但 A 組骨痂不規則，可見大量積氣，支架消失；而 B 組仍可觀察到少量殘余支架結構，骨缺損部位新生骨痂較 A 組致密，周圍積氣明顯較 A 組減少。見圖 5。
術后 4、8 周，B 組 CR 及ΔV 均顯著低于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 12 周，A 組支架已完全降解消失。見表 1。
表1
術后各時間點 A、B 組ΔV 及 CR 比較（n=6，
）
Table1.
Comparison of ΔV and CR between groups A and B at different time points (n=6,
)
2.4 血清學指標檢測
術后各時間點 3 組血清 Mg2+、Ca2+ 濃度比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 6。
2.5 Van Gieson 染色觀察
由于術后 2 周無明顯骨痂生成，因此收集術后 4、8、12 周骨缺損周圍新骨進行組織學檢測。術后 4 周，各組缺損部位周圍均可觀察到排列不規則、形態不成熟的骨細胞及大量軟骨細胞；A 組支架與新骨之間形成厚纖維結締組織膜，而 B 組支架周圍纖維結締組織膜明顯較薄。術后 8 周，各組缺損部位周圍均可觀察更多成熟骨細胞，且排列明顯較 4 周時規則，C 組軟骨細胞明顯少與其他兩組；A 組支架周圍纖維膜仍明顯厚于 B 組。術后 12 周，A、B 組支架周圍新生骨內成熟骨細胞進一步增多且排列更規整，周圍的纖維膜消失；B 組支架周圍觀察到少量軟骨細胞分布。見圖 7。
2.6 組織病理學觀察
術后 12 周，3 組實驗動物的肝、腦、腎及脾組織 HE 染色均未見明顯病理改變。見圖 8。
圖1
MAO 涂層 Mg-Zn-Ca 合金支架及動物模型制備過程示意圖
a. 支架外觀；b. 兔尺骨 CSD 模型；c. 支架植入骨缺損后
Figure1. Appearance of MAO coated Mg-Zn-Ca alloy scaffold and the schematic diagram of the operation processa. Appearance of the scaffold; b. Ulna CSD model of rabbit; c. After implanting the scaffold into defect
圖2
術后各時間點 A、B 組動物局部皮下積氣量比較
Figure2.
Comparison of local subcutaneous pneumatosis between groups A and B at different time points
圖3
術后各時間點各組 X 線片觀察
從左至右依次為術后 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure3. X-ray films of 3 groups at different time pointsFrom left to right for postoperative at 2, 4, 8, and 12 weeks, respectivelya. Group A; b. Group B; c. Group C
圖4
術后各時間點各組 X 線片評分比較
Figure4.
Comparison of X-ray scores between groups at different time points
圖5
術后 12 周 A、B 組 Micro-CT 掃描觀察（×20）
1：不規則的新生骨組織 2：剩余支架及降解產物 3：組織間積氣 a. A 組；b. B 組
Figure5. Micro-CT images of groups A and B at 12 weeks after surgery (×20)1: Irregular renew bone 2: Scaffold or degradable products 3: Pneumatosis a. Group A; b. Group B
圖6
術后各時間點各組血清 Mg2+、Ca2+ 濃度比較
a. Mg2+；b. Ca2+
Figure6. Comparison of Mg2+ and Ca2+ concentrations between groups at different time pointsa. Mg2+; b. Ca2+
圖7
術后各時間點各組 Van Gieson 染色觀察（×4）
白箭頭示支架，黑箭頭示纖維結締組織膜 從左至右依次為 A 組、B 組、C 組a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure7. Van Gieson staining observation of 3 groups at different time points (×4)White arrow indicated the scaffold, black arrow indicated fibrous connective tissue membrane From left to right for groups A, B, and C, respectively a. Postoperative at 4 weeks; b. Postoperative at 8 weeks; c. Postoperative at 12 weeks
圖8
術后 12 周各組各器官組織病理學觀察（HE×20）
從左至右依次為肝、腦、腎及脾組織 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure8. Histopathological observation of organs in each group at 12 weeks after surgery (HE×20)From left to right for liver, brain, kidney, and spleen, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
3 討論
目前已有大量報道顯示，Mg-Zn-Ca 合金具有良好生物相容性、骨誘導性及抗腐蝕性。Fazel 等[19]通過體外細胞毒性實驗證實，采用 Mg-Zn-Ca 合金提取液培養的脂肪干細胞具有良好活性；Zhao 等[20]研究顯示，Mg-Zn-Ca 合金能夠誘導內植物周圍形成大量新骨組織，具有促進新骨形成的作用；Jang 等[21]的研究表明，經過等離子電解氧化處理的 Mg-Zn-Ca 合金在體內具有良好抗腐蝕性；Smith 等[15]將 AZ31 Mg 合金板卷成圓筒狀結構，并將其植入至兔尺骨 CSD 中，結果顯示植入 12 周后尺骨缺損能夠得到有效修復，力學檢測結果顯示經修復后的尺骨力學特征能夠達到正常尺骨標準；葛野等[16]利用 Mg-鍶（Sr）合金制備成多孔骨移植替代品修復 1.0 cm 橈骨缺損，結果也顯示 Mg-Sr 合金能夠有效修復骨缺損。本研究將 Mg-Zn-Ca 合金制備成金屬支架并填充自體顆粒骨來修復兔尺骨 CSD，該支架在早期能提供足夠支撐，降解釋放 Mg2+、Ca2+ 促進成骨細胞分化，抑制破骨細胞活性；同時，對移植的自體顆粒骨可起到穩定保護作用，避免其被機體二次吸收，有利于成骨因子的釋放及微血管長入，共同促進局部新骨生成。
本研究結果顯示，隨著植入時間延長，支架周圍均形成新骨并逐漸包裹支架，術后 12 周 X 線片示骨缺損部位由大量新生骨填充，尺骨連續性和完整性得到良好恢復，而同期 C 組則出現一定程度骨吸收。術后 12 周 Micro-CT 掃描也顯示，A、B 組在骨缺損部位均存在大量骨小梁不規則排列的新生骨組織，并完全填充缺損部位，未觀察到類似骨吸收現象。與 A 組術后 X 線片評分比較，B 組在實驗過程中均表現出更好的愈合效果，且術后 12 周 X 線片評分顯示 B 組骨愈合效果與 C 組并無顯著差異。我們認為這可能是 MAO 涂層所致，這種涂層含有 1 個致密內層和 1 個多孔外層，致密內層在植入初期能阻止體液對 Mg 基質的腐蝕及金屬離子向機體的游離，在某種程度上減少氫氣釋放，從而減小了對新骨再生的影響；多孔外層具有疏松孔徑，有利于成骨細胞附著及骨組織生長，也有利于植入材料與骨的機械嵌合。而 A 組支架沒有 MAO 涂層保護，導致體內降解速度過快，局部氫氣大量堆積以及力學性能快速丟失，都會影響到局部新骨再生。
為了驗證 MAO 涂層對支架耐腐蝕性的影響，我們利用 Micro-CT 對各組術后各時間點樣本進行掃描并計算ΔV 和 CR。結果顯示，A 組支架在術后 4 周即丟失了近一半體積，8 周時已幾乎降解消失；而 B 組支架術后 4、8 周時體積損失及降解速度均明顯小于 A 組，至術后 12 周時才基本降解消失；說明 10 μm MAO 涂層能有效提高 Mg-Zn-Ca 合金支架的耐腐蝕性，使其在體內較長時間保持一定的結構完整。皮下積氣量測量結果也間接證明了這個結果。Mg 合金在體內降解并釋放氫氣，當 Mg 金屬腐蝕速度過快和/或氣體吸收不充分，會導致局部氣體殘留形成皮下積氣。兩支架組皮下積氣量結果顯示，術后 2、4、8 周 B 組積氣量均明顯少于 A 組，但 12 周時 B 組積氣量卻多于 A 組，這可能是由于 A 組支架此時已基本降解消失，而 B 組支架依然持續產氣所致。值得注意的是，術后 8 周 A、B 組積氣量比較差異無統計學意義，提示 MAO 涂層可能在 8 周左右已基本被腐蝕吸收失去其保護功能。因此，B 組支架 CR 逐漸增加，說明 MAO 涂層在植入 8 周前能夠有效增加 Mg-Zn-Ca 合金在體內的抗腐蝕性。
Mg 合金的生物相容性已被大量體內及體外實驗所證實[19-21]。而 MAO 涂層被認為是一種仿生涂層，能夠有效增加 Mg 合金基質的生物相容性，減少機體排斥反應，使成骨細胞更容易增殖并黏附于支架表面[22-23]。也有研究報道 Mg 合金與新生物之間會形成一層纖維結締組織膜，這種纖維結締組織膜本質上是機體的一種異物排斥反應，它能夠誘導淋巴細胞和炎性因子滲出，從而限制骨細胞的形成[24]。本研究組織學結果顯示，實驗過程中在 A、B 組支架與新生骨之間存在一層纖維結締組織膜，而在 C 組并未發現類似纖維結締組織膜，但 B 組支架周圍的纖維結締組織膜明顯變薄且不連續，該結果說明 MAO 涂層能夠有效增加 Mg-Zn-Ca 合金的生物相容性。同時由于我們植入的 Mg-Zn-Ca 合金支架體積相對較大，單位時間降解后會釋放更多 Mg2+ 進入循環系統，可能會提高血清 Mg2+、Ca2+ 濃度，對肝、腦、腎及脾等器官造成不良影響。為了驗證這種 Mg-Zn-Ca 合金支架的生物安全性，我們進一步監測了實驗動物的各種生化指標及主要臟器的病理改變。結果顯示，與 C 組比較，A、B 組血清 Mg2+和 Ca2+ 均未出現明顯變化；病理學結果也顯示 A、B 組支架在降解過程中未對機體重要器官產生不良影響。進一步證明了這種新型 Mg-Zn-Ca 合金支架具有良好的生物相容性。
綜上述，本研究結果表明該新型 MAO 涂層 Mg-Zn-Ca 合金支架聯合自體顆粒骨能有效修復 CSD，降解產物對機體無不良影響；同時 10 μm MAO 涂層能夠有效改善 Mg-Zn-Ca 合金支架的生物相容性、抗腐蝕性能以及促成骨性。但本研究還存在一些不足，首先，這種 Mg-Zn-Ca 合金支架在降解過程中形成局部皮下積氣，這種皮下積氣量可能會對新骨形成產生不良影響，還需進一步研究來控制其在體內降解速度，使其與自然骨愈合過程匹配。其次，本研究未進行相關生物力學檢測，不能有效反映支架在體內機械性能的變化情況，也需要進一步研究完善。
臨界性骨缺損（critical size bone defect，CSD）是指由嚴重的創傷、感染、骨腫瘤切除、人工關節置換術后翻修、先天畸形等原因引起的，達到一定長度或范圍后不能自然愈合，又不能通過單純固定解決的骨缺損[1]，一直是臨床骨科治療的難點。目前常用帶血管蒂骨移植修復大段骨缺損，但存在骨瓣營養血管位置不確定、手術創傷大、受局部血運影響大、學習曲線高、一旦失敗后果嚴重等問題[2-3]。自體顆粒骨移植雖然一直被認為是治療骨缺損的“金標準”[4]，但也存在供骨量有限、供區并發癥、結構松散、易被機體吸收等缺陷，在修復長骨缺損時常需同時植入金屬鈦網給予支撐穩定。但金屬鈦網無誘導成骨能力，植入后易引起局部塌陷、慢性炎癥、異物反應等并發癥；同時，因其不可降解會在體內永久存留，進而對機體造成不良影響[5]。近年來，由于鎂（Mg）及其合金機械性能與人骨接近[6-7]，Mg2+ 在維持細胞結構和功能方面具有重要作用[8-9]，人體內約一半含量的 Mg 存在于骨組織中[10-11]，而且 Mg 及其合金能夠促進局部鈣沉積，具有良好的骨傳導性和骨誘導性[12-14]。因此，Mg 合金作為一種潛在骨科內植物材料受到廣泛關注。
Mg 合金作為唯一具有可降解性的金屬生物材料，近年來雖然有研究將其作為骨替代物來嘗試修復骨缺損，并獲得良好效果[15-16]，但是將 Mg 合金制備成支架修復大段長骨缺損依然鮮有報道。本研究采用 Mg-鋅（Zn）-鈣（Ca）合金為材料，首次設計制造了一種新型中空圓柱形支架，這種結構在降低支架質量（約 50%）同時，還能維持足夠機械強度，內部類似皮質骨的空間允許填充自體顆粒骨，表面均勻分布的網孔有助于骨痂長入。我們假設結合自體顆粒骨誘導成骨的特性，發揮 Mg 合金良好的骨誘導性、可降解性和力學性能，嘗試利用這種新型支架修復 CSD。同時為了增加這種支架在體內的抗腐蝕性和生物相容性，我們采用微弧氧化（micro-arc oxidation，MAO）技術在其表面添加一層 10 μm 厚生物陶瓷涂層，并通過動物實驗來評估這種支架修復 CSD 的效果，同時進一步評估 MAO 涂層對支架體內抗腐蝕性和生物相容性的影響。
1 材料與方法
1.1 Mg-Zn-Ca 合金支架材料
本研究采用的 Mg-Zn-Ca 合金支架由哈爾濱工業大學材料學院提供，以 Mg-Zn-Ca 合金為主要基質材料［2.5 wt%～3.0 wt% Ca，0.7 wt%～1.3 wt% Zn，0.2 wt%錳（Mn）和純 Mg］，采用壓鑄工藝制備成圓柱形管狀支架（長 15 mm、內徑 3 mm、外徑 5 mm），表面均勻分布 12 個直徑 1 mm 的圓孔；并通過 MAO 技術對其表面改型，制備一層約 10 μm 厚的生物陶瓷涂層[17]，主要成分為 MgO，此外還含有 Mg 和 Ca 的磷酸鹽。見圖 1a。所有支架在植入前均采用環氧乙烷氣體消毒。
1.2 實驗動物及主要試劑、儀器
成年新西蘭白兔 72 只，雌雄各半，體質量（2.71±0.32）kg，由齊齊哈爾醫學院動物實驗中心提供。
戊巴比妥鈉（北京普博斯生物科技有限公司）；鈣黃綠素（Sigma-Aldrich 公司，美國）；Van Gieson 染色液（上海博谷生物科技有限公司）。CR-IR 357 Capsula X 線機（富士公司，日本）；Siemens Inveon Micro-CT、Inveon 軟件（Siemens 公司，德國）；EXAKT00CP 型切片機、EXAKT00CS 磨片機、DM4000B 熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；Hitachi 7600 自動生化分析儀（Hitachi 公司，日本）；X71 光學顯微鏡及成像系統（Olympus 公司，日本）。
1.3 實驗分組及造模方法
將新西蘭白兔隨機分為 3 組，每組 24 只。A 組：無涂層 Mg-Zn-Ca 合金支架組；B 組：MAO 涂層 Mg-Zn-Ca 合金支架組；C 組：單純自體顆粒骨植骨對照組。所有動物以 3% 戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉，四肢固定于手術臺上，雙側前肢剃毛備皮常規消毒。于前肢中段背側作 4 cm 弧形切口，切開皮膚分離組織顯露尺骨中段，用擺鋸截骨制備 15 mm 長 CSD 模型（圖 1b）。A、B 組將截取的尺骨咬碎制成顆粒骨（1～3 mm）填充于支架內，壓實后植入尺骨缺損處（圖 1c），生理鹽水反復沖洗后通過縫合肌肉及筋膜固定支架；C 組將自體顆粒骨原位植入至骨缺損部位。關閉切口后無菌包扎。造模后動物分籠飼養，可在無外固定情況下立即自由活動并充分飲食、水；預防性肌肉注射青霉素 80 萬 U 3 d，每天 2 次。術后 2、4、8、12 周每組各取 6 只動物進行研究。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
觀察動物一般狀態、活動、攝入食水、體質量、切口愈合及炎性并發癥發生情況等；同時監測 A、B 組動物局部皮下積氣情況，利用無菌注射器局部穿刺收集局部皮下積氣，記錄積氣量。
1.4.2 X 線片觀察
利用 CR-IR 357 Capsula X 線機行側位 X 線掃描，投射條件：70 V，0.69 mA，1.5 s。掃描后由 3 位放射科醫師采用雙盲法對骨缺損愈合情況進行評分，采用 Lane-Sandhu 評分標準[18]，范圍從 0 分（未治療）到 12 分（恢復正常骨結構），7 分以上認為骨缺損初步愈合。
1.4.3 Micro-CT 掃描
利用 Siemens Inveon Micro-CT 在電壓 80 kV、電流 500 μA 下掃描，利用 Inveon 軟件對數據進行處理。鑒于 C 組無支架，因此僅觀察 A、B 組術后支架降解情況及術后 12 周缺損部位新骨形態。按以下公式計算術后 4、8、12 周支架降解丟失體積百分比（ΔV）和降解速度（corrosion rate，CR），ΔV=（V0–Vx）/V0×100%，其中 V0 為支架初始體積，Vx 為不同時間點支架剩余體積；CR=（V0–Vx）/（A×t），其中 A 是支架初始面積，t 是術后時間（單位為年）。
1.4.4 血清學指標檢測
術后各時間點處死實驗動物前，清晨空腹耳緣靜脈采血，抗凝，將血樣置于室溫下靜止 1 h，以離心半徑 20 cm、3 500 r/min 離心 10 min，分離上清液，采用 Hitachi 7600 自動生化分析儀測量血清中 Mg2+ 和 Ca2+ 濃度。
1.4.5 Van Gieson 染色觀察
術后各時間點采用驅血法處死動物后收集前肢，去除皮膚軟組織剝離尺骨，70% 乙醇固定；梯度乙醇真空脫水、透明、脫脂、包埋，然后固定于 EXAKT00CP 型切片機切成 200 μm 厚硬組織切片，EXAKT00CS 磨片機依次以 800、1 200、2 500 目水砂紙打磨拋光獲得 50 μm 厚骨磨片；常規 Van Gieson 染色后，4 倍光鏡下觀察缺損部位新生骨組織形態。
1.4.6 組織病理學觀察
術后 12 周處死各組動物后收集腦、肝、腎和脾組織，常規行 HE 染色，20 倍光鏡下觀察組織結構。
1.5 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均值±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
所有實驗動物均耐受手術，術后麻醉蘇醒后即可自由活動；術后 2 d 食欲較差，考慮麻醉或術后疼痛所致；2 d 后一般狀態可，患肢活動良好、體質量無明顯減輕，切口無炎性反應；術后 1 周左右切口愈合，10 d 后拆線。
局部穿刺收集皮下積氣顯示，A、B 組皮下積氣量均隨植入時間延長而增加，于 8 周達高峰后迅速減少。術后 2、4、8 周 B 組皮下積氣量少于 A 組，2、4 周時兩組間比較差異有統計學意義（t=2.651，P=0.023；t=2.544，P=0.013），8周時差異無統計學意義（t=1.687，P=0.120）；但術后 12 周時 B 組積氣量多于 A 組，差異亦有統計學意義（t=2.343，P=0.039）。見圖 2。
2.2 X 線片觀察
X 線片觀察示，術后 2 周時各組均未見明顯骨痂生成。2 周后 C 組骨缺損修復效果良好，僅 12 周時在局部存在一定程度的骨吸收。與 C 組比較，A、B 組術后 4 周植入物周圍僅可見少量骨痂生成，但隨后顯著增多，8 周時骨缺損部分修復，支架外可觀察到新生骨橋形成，12 周時缺損完全修復，同時可觀察到 B 組新生骨組織塑形明顯優于 A 組。見圖 3。
術后 4、8 周 C 組 X 線片評分顯著高于 A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 8 周時 B 組顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。術后 12 周 B、C 組顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）；但 B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
2.3 Micro-CT 掃描
Micro-CT 掃描觀察示，術后 12 周，可見 A、B 組骨缺損部位由大量新生骨填充，但 A 組骨痂不規則，可見大量積氣，支架消失；而 B 組仍可觀察到少量殘余支架結構，骨缺損部位新生骨痂較 A 組致密，周圍積氣明顯較 A 組減少。見圖 5。
術后 4、8 周，B 組 CR 及ΔV 均顯著低于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 12 周，A 組支架已完全降解消失。見表 1。
表1
術后各時間點 A、B 組ΔV 及 CR 比較（n=6，
）
Table1.
Comparison of ΔV and CR between groups A and B at different time points (n=6,
)
2.4 血清學指標檢測
術后各時間點 3 組血清 Mg2+、Ca2+ 濃度比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 6。
2.5 Van Gieson 染色觀察
由于術后 2 周無明顯骨痂生成，因此收集術后 4、8、12 周骨缺損周圍新骨進行組織學檢測。術后 4 周，各組缺損部位周圍均可觀察到排列不規則、形態不成熟的骨細胞及大量軟骨細胞；A 組支架與新骨之間形成厚纖維結締組織膜，而 B 組支架周圍纖維結締組織膜明顯較薄。術后 8 周，各組缺損部位周圍均可觀察更多成熟骨細胞，且排列明顯較 4 周時規則，C 組軟骨細胞明顯少與其他兩組；A 組支架周圍纖維膜仍明顯厚于 B 組。術后 12 周，A、B 組支架周圍新生骨內成熟骨細胞進一步增多且排列更規整，周圍的纖維膜消失；B 組支架周圍觀察到少量軟骨細胞分布。見圖 7。
2.6 組織病理學觀察
術后 12 周，3 組實驗動物的肝、腦、腎及脾組織 HE 染色均未見明顯病理改變。見圖 8。
圖1
MAO 涂層 Mg-Zn-Ca 合金支架及動物模型制備過程示意圖
a. 支架外觀；b. 兔尺骨 CSD 模型；c. 支架植入骨缺損后
Figure1. Appearance of MAO coated Mg-Zn-Ca alloy scaffold and the schematic diagram of the operation processa. Appearance of the scaffold; b. Ulna CSD model of rabbit; c. After implanting the scaffold into defect
圖2
術后各時間點 A、B 組動物局部皮下積氣量比較
Figure2.
Comparison of local subcutaneous pneumatosis between groups A and B at different time points
圖3
術后各時間點各組 X 線片觀察
從左至右依次為術后 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure3. X-ray films of 3 groups at different time pointsFrom left to right for postoperative at 2, 4, 8, and 12 weeks, respectivelya. Group A; b. Group B; c. Group C
圖4
術后各時間點各組 X 線片評分比較
Figure4.
Comparison of X-ray scores between groups at different time points
圖5
術后 12 周 A、B 組 Micro-CT 掃描觀察（×20）
1：不規則的新生骨組織 2：剩余支架及降解產物 3：組織間積氣 a. A 組；b. B 組
Figure5. Micro-CT images of groups A and B at 12 weeks after surgery (×20)1: Irregular renew bone 2: Scaffold or degradable products 3: Pneumatosis a. Group A; b. Group B
圖6
術后各時間點各組血清 Mg2+、Ca2+ 濃度比較
a. Mg2+；b. Ca2+
Figure6. Comparison of Mg2+ and Ca2+ concentrations between groups at different time pointsa. Mg2+; b. Ca2+
圖7
術后各時間點各組 Van Gieson 染色觀察（×4）
白箭頭示支架，黑箭頭示纖維結締組織膜 從左至右依次為 A 組、B 組、C 組a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure7. Van Gieson staining observation of 3 groups at different time points (×4)White arrow indicated the scaffold, black arrow indicated fibrous connective tissue membrane From left to right for groups A, B, and C, respectively a. Postoperative at 4 weeks; b. Postoperative at 8 weeks; c. Postoperative at 12 weeks
圖8
術后 12 周各組各器官組織病理學觀察（HE×20）
從左至右依次為肝、腦、腎及脾組織 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure8. Histopathological observation of organs in each group at 12 weeks after surgery (HE×20)From left to right for liver, brain, kidney, and spleen, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
3 討論
目前已有大量報道顯示，Mg-Zn-Ca 合金具有良好生物相容性、骨誘導性及抗腐蝕性。Fazel 等[19]通過體外細胞毒性實驗證實，采用 Mg-Zn-Ca 合金提取液培養的脂肪干細胞具有良好活性；Zhao 等[20]研究顯示，Mg-Zn-Ca 合金能夠誘導內植物周圍形成大量新骨組織，具有促進新骨形成的作用；Jang 等[21]的研究表明，經過等離子電解氧化處理的 Mg-Zn-Ca 合金在體內具有良好抗腐蝕性；Smith 等[15]將 AZ31 Mg 合金板卷成圓筒狀結構，并將其植入至兔尺骨 CSD 中，結果顯示植入 12 周后尺骨缺損能夠得到有效修復，力學檢測結果顯示經修復后的尺骨力學特征能夠達到正常尺骨標準；葛野等[16]利用 Mg-鍶（Sr）合金制備成多孔骨移植替代品修復 1.0 cm 橈骨缺損，結果也顯示 Mg-Sr 合金能夠有效修復骨缺損。本研究將 Mg-Zn-Ca 合金制備成金屬支架并填充自體顆粒骨來修復兔尺骨 CSD，該支架在早期能提供足夠支撐，降解釋放 Mg2+、Ca2+ 促進成骨細胞分化，抑制破骨細胞活性；同時，對移植的自體顆粒骨可起到穩定保護作用，避免其被機體二次吸收，有利于成骨因子的釋放及微血管長入，共同促進局部新骨生成。
本研究結果顯示，隨著植入時間延長，支架周圍均形成新骨并逐漸包裹支架，術后 12 周 X 線片示骨缺損部位由大量新生骨填充，尺骨連續性和完整性得到良好恢復，而同期 C 組則出現一定程度骨吸收。術后 12 周 Micro-CT 掃描也顯示，A、B 組在骨缺損部位均存在大量骨小梁不規則排列的新生骨組織，并完全填充缺損部位，未觀察到類似骨吸收現象。與 A 組術后 X 線片評分比較，B 組在實驗過程中均表現出更好的愈合效果，且術后 12 周 X 線片評分顯示 B 組骨愈合效果與 C 組并無顯著差異。我們認為這可能是 MAO 涂層所致，這種涂層含有 1 個致密內層和 1 個多孔外層，致密內層在植入初期能阻止體液對 Mg 基質的腐蝕及金屬離子向機體的游離，在某種程度上減少氫氣釋放，從而減小了對新骨再生的影響；多孔外層具有疏松孔徑，有利于成骨細胞附著及骨組織生長，也有利于植入材料與骨的機械嵌合。而 A 組支架沒有 MAO 涂層保護，導致體內降解速度過快，局部氫氣大量堆積以及力學性能快速丟失，都會影響到局部新骨再生。
為了驗證 MAO 涂層對支架耐腐蝕性的影響，我們利用 Micro-CT 對各組術后各時間點樣本進行掃描并計算ΔV 和 CR。結果顯示，A 組支架在術后 4 周即丟失了近一半體積，8 周時已幾乎降解消失；而 B 組支架術后 4、8 周時體積損失及降解速度均明顯小于 A 組，至術后 12 周時才基本降解消失；說明 10 μm MAO 涂層能有效提高 Mg-Zn-Ca 合金支架的耐腐蝕性，使其在體內較長時間保持一定的結構完整。皮下積氣量測量結果也間接證明了這個結果。Mg 合金在體內降解并釋放氫氣，當 Mg 金屬腐蝕速度過快和/或氣體吸收不充分，會導致局部氣體殘留形成皮下積氣。兩支架組皮下積氣量結果顯示，術后 2、4、8 周 B 組積氣量均明顯少于 A 組，但 12 周時 B 組積氣量卻多于 A 組，這可能是由于 A 組支架此時已基本降解消失，而 B 組支架依然持續產氣所致。值得注意的是，術后 8 周 A、B 組積氣量比較差異無統計學意義，提示 MAO 涂層可能在 8 周左右已基本被腐蝕吸收失去其保護功能。因此，B 組支架 CR 逐漸增加，說明 MAO 涂層在植入 8 周前能夠有效增加 Mg-Zn-Ca 合金在體內的抗腐蝕性。
Mg 合金的生物相容性已被大量體內及體外實驗所證實[19-21]。而 MAO 涂層被認為是一種仿生涂層，能夠有效增加 Mg 合金基質的生物相容性，減少機體排斥反應，使成骨細胞更容易增殖并黏附于支架表面[22-23]。也有研究報道 Mg 合金與新生物之間會形成一層纖維結締組織膜，這種纖維結締組織膜本質上是機體的一種異物排斥反應，它能夠誘導淋巴細胞和炎性因子滲出，從而限制骨細胞的形成[24]。本研究組織學結果顯示，實驗過程中在 A、B 組支架與新生骨之間存在一層纖維結締組織膜，而在 C 組并未發現類似纖維結締組織膜，但 B 組支架周圍的纖維結締組織膜明顯變薄且不連續，該結果說明 MAO 涂層能夠有效增加 Mg-Zn-Ca 合金的生物相容性。同時由于我們植入的 Mg-Zn-Ca 合金支架體積相對較大，單位時間降解后會釋放更多 Mg2+ 進入循環系統，可能會提高血清 Mg2+、Ca2+ 濃度，對肝、腦、腎及脾等器官造成不良影響。為了驗證這種 Mg-Zn-Ca 合金支架的生物安全性，我們進一步監測了實驗動物的各種生化指標及主要臟器的病理改變。結果顯示，與 C 組比較，A、B 組血清 Mg2+和 Ca2+ 均未出現明顯變化；病理學結果也顯示 A、B 組支架在降解過程中未對機體重要器官產生不良影響。進一步證明了這種新型 Mg-Zn-Ca 合金支架具有良好的生物相容性。
綜上述，本研究結果表明該新型 MAO 涂層 Mg-Zn-Ca 合金支架聯合自體顆粒骨能有效修復 CSD，降解產物對機體無不良影響；同時 10 μm MAO 涂層能夠有效改善 Mg-Zn-Ca 合金支架的生物相容性、抗腐蝕性能以及促成骨性。但本研究還存在一些不足，首先，這種 Mg-Zn-Ca 合金支架在降解過程中形成局部皮下積氣，這種皮下積氣量可能會對新骨形成產生不良影響，還需進一步研究來控制其在體內降解速度，使其與自然骨愈合過程匹配。其次，本研究未進行相關生物力學檢測，不能有效反映支架在體內機械性能的變化情況，也需要進一步研究完善。
