引用本文： 董獻成, 殷建, 惲波, 呂斌, 殷國勇. G 蛋白偶聯受體激酶相互作用蛋白 1 對 BMSCs 向內皮細胞分化的影響機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(3): 257-263. doi: 10.7507/1002-1892.201709090 復制
G 蛋白偶聯受體激酶相互作用蛋白 1（G protein coupled receptor kinase interacting protein 1，GIT1）是一種多結構域蛋白，表達于腦、肝、肺、胸腺、脾等多個器官中，參與調控細胞遷移、黏附及調控細胞轉導等多種細胞生物學過程[1-3]。已有研究表明，與 GIT1 野生型小鼠相比，GIT1 基因敲除型小鼠骨折愈合過程中，骨痂中新生血管明顯減少，骨折愈合速度較慢，且骨痂形成差[4]。目前對于 GIT1 蛋白影響血管生成的具體機制尚未完全清楚。本研究通過比較 GIT1 野生型小鼠和 GIT1 基因敲除型小鼠的 BMSCs 向內皮細胞分化過程，對 GIT1 影響 BMSCs 向內皮細胞分化以及血管形成的機制進行研究。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
以GIT1 雜合子小鼠（GIT1+/–）雌雄配對合籠方法獲得新生小鼠，對新生小鼠進行基因型鑒定，獲得實驗使用的 GIT1 基因敲除型（GIT1–/–）小鼠及 GIT1 野生型（GIT1+/+）小鼠，飼養至 6 周齡。
L-DMEM 培養基、PBS、胰蛋白酶、FBS（GIBCO 公司，美國）；CD14、CD44、CD45、CD90、CD105、血小板內皮細胞黏附因子 1（platelet-endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM-1）、血管內皮黏鈣蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-Cadherin）抗體及二抗（Ebioscience 公司，美國）；血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）抗體及二抗（GeneTex 公司，美國）；VEGF 受體 2（VEGF receptor 2，VEGFR-2）、磷酸化 VEGFR-2（phospho-VEGFR-2，pVEGFR-2）、VEGFR-3、pVEGFR-3 抗體（Abcam 公司，美國）；選擇性 VEGFR-3 阻斷劑[5]SAR131675（MCE 公司，美國）。梯度 PCR 儀、電泳儀、轉膜儀（Bio-Rad 公司，美國）；細胞培養箱（Thermo Forma 公司，美國）；FACSCalibur 型流式細胞儀（BD 公司，美國）。
1.2 新生小鼠基因型鑒定
將新生小鼠剪尾 2～3 mm 置于 1.5 mL EP 管中，加入鼠尾組織溶解液（1 000 mL 溶解液中含 100 mmol Tris- HCl、5 mmol EDTA、0.2%SDS、200 mmol NaCl）350 μL 和 10 mg/mL 蛋白酶 K 10 μL，置 50℃ 搖床中（170 r/min），直至鼠尾完全溶解；每管中加入 350 μL 異戊醇、氯仿、苯酚混合溶液，異戊醇、氯仿、苯酚體積比為1∶24∶25，振蕩 15 s 后室溫靜置 3 min；以離心半徑 4 cm、12 000 r/min 離心 15 min，液體分為 3 層；取上層無色液體約 200 μL 轉至新 1.5 mL EP 管中，避免吸取中層液體，加入 400 μL 無水乙醇，顛倒混勻直至絮狀沉淀產生；以離心半徑 4 cm、12 000 r/min 離心 5 min；棄液體并倒置 EP 管于吸水紙上，室溫干燥 10 min；每管中加 60 μL 無菌蒸餾水，置 55℃ 水浴 1 h。提取 EP 管中上清，獲得小鼠 DNA 液。將 DNA 液以 25 μL 的 PCR 體系加入梯度 PCR 中擴增，得到擴增 PCR 產物。在 100 mL TAE 電泳緩沖液中加入瓊脂糖 2 g，放入微波爐中加熱至瓊脂糖完全融解，冷卻至 65℃，加入 EB 液（GelRed 核酸染料）2 μL，倒入電泳槽中，插入梳子；待其冷卻后，拔出梳子，將凝膠置于 TAE 電泳緩沖液中；向 PCR 產物中加入 6×上樣緩沖液 5 μL，混勻后，加入已預制好的 2% 瓊脂糖凝膠 8 μL 于上樣孔中，120 V 電泳 10 min。將電泳后的凝膠拍照、記錄基因型。
1.3 BMSCs 分離培養及鑒定
取 6 周齡 GIT1 野生型小鼠與 GIT1 基因敲除型小鼠，分別采用頸椎脫臼法處死，無菌條件下取出雙側股骨及脛骨，去除兩側骨骺端，收集骨髓，制成單細胞懸液。離心收集沉淀細胞，加入含 10%FBS 的 L-DMEM 培養基調整細胞密度，以 1×108個/L 密度接種于 10 cm 培養皿中，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。3 d 后首次半量換液，以后每 2～3 天換液 1 次，每次換液去除懸浮細胞，當細胞融合達 80% 時進行細胞傳代。取第 2 代生長期細胞，采用流式細胞術鑒定其表面標志物 CD14、CD44、CD45、CD90、CD105 的表達。
1.4 GIT1 對 BMSCs 向內皮細胞分化的影響
1.4.1 實驗分組
實驗分為 4 組，分別為野生型對照組（A 組）、野生型實驗組（A1 組）、基因敲除型對照組（B 組）、基因敲除型實驗組（B1 組）。取 GIT1 野生型與 GIT1 基因敲除型小鼠第 2 代 BMSCs 隨機分為 4 組后，A1、B1 組采用內皮細胞誘導液（含 10%FBS、100 U/mL 青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素、50 ng/mL VEGF165 的 90%L-DMEM 培養基）向內皮細胞分化培養，A、B 組進行常規培養。各組每 2～3 天換液 1 次。
1.4.2 Western blot 檢測 VEGFR-2、VEGFR-3、pVEGFR-2、pVEGFR-3 蛋白表達
取培養 5 d 的上述 4 組細胞，于培養液中加入 50 ng/mL VEGF165 后提取細胞總蛋白，蛋白充分裂解后，BCA 法檢測蛋白濃度，將蛋白樣品調至等濃度，充分混合均勻后加 Loading Buffer 煮沸變性后備用。所有蛋白樣品調至等體積后上樣，電泳后轉膜至甲醇浸潤的聚偏氟乙烯膜。轉膜后脫脂奶粉封閉 2 h，依次加入小鼠 VEGFR-2、VEGFR-3、pVEGFR-2、pVEGFR-3 單克隆一抗、二抗，最后 ECL 法發光獲得目的條帶，觀察各組蛋白表達情況。
1.4.3 流式細胞術檢測內皮細胞分化差異
取培養 10 d 的上述 4 組細胞，制成細胞懸液，PBS 充分洗滌，分別加入 vWF、PECAM-1、VE-Cadherin 抗體和同型對照抗體，同型對照抗體分別選 IgG1-FITC、IgG1-PE, 避光孵育，離心漂洗后，加入固定液并混勻，上機檢測內皮細胞標志物 vWF、PECAM-1、VE-Cadherin 的表達。
1.5 阻斷 VEGFR-3 對 BMSCs 向內皮細胞分化的影響
取 GIT1 野生型小鼠第 2 代 BMSCs，根據加入培養液的不同分為 4 組：Ⅰ組，單純細胞培養液；Ⅱ組，細胞培養液中加入 10 ng/mL SAR131675；Ⅲ組，內皮細胞誘導液；Ⅳ組，內皮細胞誘導液中加入 10 ng/mL SAR131675。每隔 2～3 d 換液 1 次，培養 10 d 時同前法采用流式細胞儀檢測各組內皮細胞標志物 vWF、PECAM-1、VE-Cadherin 表達。
1.6 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 新生小鼠基因型鑒定
本組共 8 只新生小鼠行基因型鑒定，其中 GIT1 基因敲除型小鼠 2 只，GIT1 野生型小鼠 2 只，雜合子小鼠 4 只。見圖 1。
2.2 小鼠 BMSCs 鑒定
流式細胞儀檢測示，MSCs 表面標志物 CD44、CD90、CD105 表達均為陽性，單核細胞表面標志物 CD14 和造血細胞表面標志物 CD45 均為陰性。見圖 2。
2.3 GIT1 對 BMSCs 向內皮細胞分化的影響
2.3.1 Western blot 檢測
4 組細胞的 VEGFR-2、pVEGFR-2 蛋白表達無明顯差異，A1 組 VEGFR-3、pVEGFR-3 蛋白表達顯著高于其余 3 組。見圖 3。
2.3.2 流式細胞儀檢測內皮細胞分化差異
A1 組內皮細胞標志物 vWF、PECAM-1 及 VE-Cadherin 表達均顯著高于 A、B、B1 組，B1 組顯著高于 A、B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4、5。
2.4 阻斷 VEGFR-3 對 BMSCs 向內皮細胞分化的影響
Ⅲ組內皮細胞標志物 vWF、PECAM-1 及 VE-Cadherin 表達均顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組，Ⅳ組高于Ⅰ、Ⅱ組，差異均有統計學意義（P<0.05）；Ⅰ、Ⅱ組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 6、7。
圖1
PCR 法行新生小鼠基因型鑒定
M：Marker 1、6：GIT1 基因敲除型 2、3、4、7：GIT1 雜合子 5、8：GIT1 野生型
Figure1. Genotypic identification of newborn mice by PCRM: Marker 1, 6: GIT1 gene knockout type 2, 3, 4, 7: GIT1 gene heterozygote type 5, 8: GIT1 wild type
圖2
流式細胞儀檢測小鼠 BMSCs 表面標志物
a. CD14；b. CD44；c. CD45；d. CD90；e. CD105
Figure2. Characterization of BMSCs by flow cytometrya. CD14; b. CD44; c. CD45; d. CD90; e. CD105
圖3
Western blot 檢測 4 組細胞各蛋白表達
1：A 組 2：A1 組 3：B 組 4：B1 組 a. VEGFR-2 和 pVEGFR-2；b. VEGFR-3 和 pVEGFR-3
Figure3. The protein expressions of 4 groups by Western blot1: Group A 2: Group A1 3: Group B 4: Group B1 a. VEGFR-2 and pVEGFR-2；b. VEGFR-3 and pVEGFR-3
圖4
流式細胞儀檢測各組內皮細胞標志物表達
從左至右依次為 A 組、A1 組、B 組、B1 組 a. vWF；b. PECAM-1；c. VE-Cadherin
Figure4. The expressions of endothelial cell markers detected by flow cytometryFrom left to right for groups A, A1, B, and B1, respectively a. vWF; b. PECAM-1; c. VE-Cadherin
圖5
流式細胞儀檢測各組內皮細胞標志物表達量
Figure5.
The expressions of endothelial cell markers detected by flow cytometry
圖6
流式細胞儀檢測阻斷 VEGFR-3 實驗中各組內皮細胞標志物表達
從左至右依次為Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組 a. vWF；b. PECAM-1；c. VE-Cadherin
Figure6. The expressions of endothelial cell markers in each group of VEGFR-3 blocked experiment detected by flow cytometryFrom left to right for groupsⅠ, Ⅱ, Ⅲ, and Ⅳ, respectively a. vWF; b. PECAM-1; c. VE-Cadherin
圖7
流式細胞儀檢測阻斷 VEGFR-3 實驗中各組內皮細胞標志 物表達量
Figure7.
The expressions of endothelial cell markers in each group of VEGFR-3 blocked experiment detected by flow cytometry
3 討論
BMSCs 是骨髓內存在的一類非造血干細胞，其在體內外具有支持和調控造血的作用，在體內分布于多種組織和器官，并具有多向分化潛能。目前未發現 MSCs 特異性表面抗原。本研究采用流式細胞術檢查了培養細胞表面抗原的表達，其中 MSCs 表面標志物 CD44、CD90、CD105 表達均為陽性，單核細胞表面標志物 CD14 和造血細胞表面標志物 CD45 均為陰性。說明本實驗獲得的細胞具有祖細胞 MSCs 特征，是 BMSCs，而非骨髓組織中的造血干細胞系。本實驗采用 GIT1 雜合子小鼠雌雄配對飼養的方法獲得 GIT1 野生型或 GIT1 基因敲除型純合子小鼠，并通過 PCR 方法進行鑒定。本實驗對來源于兩種小鼠的 BMSCs 進行研究，通過比較血管內皮細胞形成的差異，可在一定程度上說明 GIT1 對血管形成的影響。
研究表明，GIT1 與血管形成及血管通透性等密切相關。Pang 等[6]比較了 GIT1 基因敲除型小鼠與 GIT1 野生型小鼠的肺部，發現基因敲除型小鼠肺部有散在出血，進一步對其肺部進行組織學分析和 CT 檢查，發現肺部毛細血管管徑及數量明顯少于野生型小鼠，認為 GIT1 通過影響內皮細胞來影響血管生成。Yin 等[4]對 GIT1 基因敲除型小鼠與 GIT1 野生型小鼠骨折愈合情況進行研究，發現基因敲除型小鼠骨折愈合速度較野生型小鼠慢，骨痂形成差，且骨痂中新生血管明顯少于野生型小鼠。本實驗中對于各組 BMSCs 向內皮細胞分化進行比較，在同樣條件下通過檢測內皮細胞標志物 vWF、PECAM-1、VE-Cadherin，發現 GIT1 野生型實驗組與 GIT1 基因敲除型實驗組內皮細胞數量有顯著差異，說明 GIT1 蛋白對于 BMSCs 向內皮細胞分化過程中內皮細胞的數量具有重要影響，這可能是 GIT1 影響血管生成的原因之一。
VEGFR 是受體酪氨酸激酶超家族中一員。VEGFR 家族包括 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神經纖毛蛋白 1 和神經纖毛蛋白 2。VEGFR-1 主要參與血管管狀結構的維持和促進內皮細胞的遷移[7]；VEGFR-2 是 VEGF 發揮促血管生成作用的主要受體，與血管生發、血管形成密切相關，促進血管內皮細胞的增殖，是促進血管生成的主要因子[8]；VEGFR-3 主要表達于成熟器官的淋巴管內皮細胞，VEGFR-3 通路通常被認為與淋巴管生成相關[9]。有研究表明，VEGFR-3 也調節血管生成，Saj 等[10]的實驗驗證， VEGFR-3 敲除小鼠在血管叢動靜脈重塑過程存在致命缺陷，在胚胎早期血管生成就會出現障礙。缺失 VEGFR-3，斑馬魚腎動脈形態的生成也出現嚴重缺陷[11]。在抗體阻斷 VEGFR-2 的情況下，VEGF-C 也可刺激 VEGFR-3 促進血管生成，在減少血管生成和腫瘤生長的過程中，阻斷 VEGFR-2 和 VEGFR-3 具有協同作用[12]。Notch 信號通路在血管形成過程誘導動脈內皮細胞及血管生發方面起到關鍵性作用[13]。Notch-1 信號和其配體 Dll-4 在內皮細胞中具有重要作用，缺失 Notch-1 或單拷貝 Dll-4 將導致嚴重血管形成障礙，小鼠在胚胎期就會死亡[14-15]。研究表明[16-17]，VEGFR-3 也和 Notch 相互作用來調節血管生成。在血管生成過程中，可以檢測到 VEGFR-3 表達水平較高，在不同大鼠血管模型中，當使用 VEGFR-3 抗體阻斷 VEGFR-3 時，血管生發、血管密度、血管側支及內皮細胞增殖均減少[12, 18]。選擇性去除內皮細胞中的 Notch，可發現內皮細胞中 VEGFR-3 蛋白表達水平顯著升高，表明 Notch 信號可有效抑制 VEGFR-3 表達[19]。本實驗發現，GIT1 基因敲除型小鼠 BMSCs 分化的內皮細胞其 VEGFR-3 表達水平較 GIT1 野生型小鼠低，對 VEGFR-3 進行阻斷后發現 BMSCs 向內皮細胞分化能力下降，說明 GIT1 是通過 VEGFR-3 影響 BMSCs 向內皮細胞分化。
綜上述，GIT1 會對小鼠 BMSCs 向內皮細胞的分化產生影響，缺少 GIT1 會使 BMSCs 表達 VEGFR-3 降低，進而抑制其向內皮細胞分化。GIT1 可能是通過 VEGFR-3 影響 Notch 信號通路，進而影響血管形成。但血管形成是一種復雜的動態過程，影響因素較多，本實驗僅在體外從細胞層面進行研究，體內機制可能不完全一致，還需要進一步研究證實。
G 蛋白偶聯受體激酶相互作用蛋白 1（G protein coupled receptor kinase interacting protein 1，GIT1）是一種多結構域蛋白，表達于腦、肝、肺、胸腺、脾等多個器官中，參與調控細胞遷移、黏附及調控細胞轉導等多種細胞生物學過程[1-3]。已有研究表明，與 GIT1 野生型小鼠相比，GIT1 基因敲除型小鼠骨折愈合過程中，骨痂中新生血管明顯減少，骨折愈合速度較慢，且骨痂形成差[4]。目前對于 GIT1 蛋白影響血管生成的具體機制尚未完全清楚。本研究通過比較 GIT1 野生型小鼠和 GIT1 基因敲除型小鼠的 BMSCs 向內皮細胞分化過程，對 GIT1 影響 BMSCs 向內皮細胞分化以及血管形成的機制進行研究。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
以GIT1 雜合子小鼠（GIT1+/–）雌雄配對合籠方法獲得新生小鼠，對新生小鼠進行基因型鑒定，獲得實驗使用的 GIT1 基因敲除型（GIT1–/–）小鼠及 GIT1 野生型（GIT1+/+）小鼠，飼養至 6 周齡。
L-DMEM 培養基、PBS、胰蛋白酶、FBS（GIBCO 公司，美國）；CD14、CD44、CD45、CD90、CD105、血小板內皮細胞黏附因子 1（platelet-endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM-1）、血管內皮黏鈣蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-Cadherin）抗體及二抗（Ebioscience 公司，美國）；血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）抗體及二抗（GeneTex 公司，美國）；VEGF 受體 2（VEGF receptor 2，VEGFR-2）、磷酸化 VEGFR-2（phospho-VEGFR-2，pVEGFR-2）、VEGFR-3、pVEGFR-3 抗體（Abcam 公司，美國）；選擇性 VEGFR-3 阻斷劑[5]SAR131675（MCE 公司，美國）。梯度 PCR 儀、電泳儀、轉膜儀（Bio-Rad 公司，美國）；細胞培養箱（Thermo Forma 公司，美國）；FACSCalibur 型流式細胞儀（BD 公司，美國）。
1.2 新生小鼠基因型鑒定
將新生小鼠剪尾 2～3 mm 置于 1.5 mL EP 管中，加入鼠尾組織溶解液（1 000 mL 溶解液中含 100 mmol Tris- HCl、5 mmol EDTA、0.2%SDS、200 mmol NaCl）350 μL 和 10 mg/mL 蛋白酶 K 10 μL，置 50℃ 搖床中（170 r/min），直至鼠尾完全溶解；每管中加入 350 μL 異戊醇、氯仿、苯酚混合溶液，異戊醇、氯仿、苯酚體積比為1∶24∶25，振蕩 15 s 后室溫靜置 3 min；以離心半徑 4 cm、12 000 r/min 離心 15 min，液體分為 3 層；取上層無色液體約 200 μL 轉至新 1.5 mL EP 管中，避免吸取中層液體，加入 400 μL 無水乙醇，顛倒混勻直至絮狀沉淀產生；以離心半徑 4 cm、12 000 r/min 離心 5 min；棄液體并倒置 EP 管于吸水紙上，室溫干燥 10 min；每管中加 60 μL 無菌蒸餾水，置 55℃ 水浴 1 h。提取 EP 管中上清，獲得小鼠 DNA 液。將 DNA 液以 25 μL 的 PCR 體系加入梯度 PCR 中擴增，得到擴增 PCR 產物。在 100 mL TAE 電泳緩沖液中加入瓊脂糖 2 g，放入微波爐中加熱至瓊脂糖完全融解，冷卻至 65℃，加入 EB 液（GelRed 核酸染料）2 μL，倒入電泳槽中，插入梳子；待其冷卻后，拔出梳子，將凝膠置于 TAE 電泳緩沖液中；向 PCR 產物中加入 6×上樣緩沖液 5 μL，混勻后，加入已預制好的 2% 瓊脂糖凝膠 8 μL 于上樣孔中，120 V 電泳 10 min。將電泳后的凝膠拍照、記錄基因型。
1.3 BMSCs 分離培養及鑒定
取 6 周齡 GIT1 野生型小鼠與 GIT1 基因敲除型小鼠，分別采用頸椎脫臼法處死，無菌條件下取出雙側股骨及脛骨，去除兩側骨骺端，收集骨髓，制成單細胞懸液。離心收集沉淀細胞，加入含 10%FBS 的 L-DMEM 培養基調整細胞密度，以 1×108個/L 密度接種于 10 cm 培養皿中，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。3 d 后首次半量換液，以后每 2～3 天換液 1 次，每次換液去除懸浮細胞，當細胞融合達 80% 時進行細胞傳代。取第 2 代生長期細胞，采用流式細胞術鑒定其表面標志物 CD14、CD44、CD45、CD90、CD105 的表達。
1.4 GIT1 對 BMSCs 向內皮細胞分化的影響
1.4.1 實驗分組
實驗分為 4 組，分別為野生型對照組（A 組）、野生型實驗組（A1 組）、基因敲除型對照組（B 組）、基因敲除型實驗組（B1 組）。取 GIT1 野生型與 GIT1 基因敲除型小鼠第 2 代 BMSCs 隨機分為 4 組后，A1、B1 組采用內皮細胞誘導液（含 10%FBS、100 U/mL 青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素、50 ng/mL VEGF165 的 90%L-DMEM 培養基）向內皮細胞分化培養，A、B 組進行常規培養。各組每 2～3 天換液 1 次。
1.4.2 Western blot 檢測 VEGFR-2、VEGFR-3、pVEGFR-2、pVEGFR-3 蛋白表達
取培養 5 d 的上述 4 組細胞，于培養液中加入 50 ng/mL VEGF165 后提取細胞總蛋白，蛋白充分裂解后，BCA 法檢測蛋白濃度，將蛋白樣品調至等濃度，充分混合均勻后加 Loading Buffer 煮沸變性后備用。所有蛋白樣品調至等體積后上樣，電泳后轉膜至甲醇浸潤的聚偏氟乙烯膜。轉膜后脫脂奶粉封閉 2 h，依次加入小鼠 VEGFR-2、VEGFR-3、pVEGFR-2、pVEGFR-3 單克隆一抗、二抗，最后 ECL 法發光獲得目的條帶，觀察各組蛋白表達情況。
1.4.3 流式細胞術檢測內皮細胞分化差異
取培養 10 d 的上述 4 組細胞，制成細胞懸液，PBS 充分洗滌，分別加入 vWF、PECAM-1、VE-Cadherin 抗體和同型對照抗體，同型對照抗體分別選 IgG1-FITC、IgG1-PE, 避光孵育，離心漂洗后，加入固定液并混勻，上機檢測內皮細胞標志物 vWF、PECAM-1、VE-Cadherin 的表達。
1.5 阻斷 VEGFR-3 對 BMSCs 向內皮細胞分化的影響
取 GIT1 野生型小鼠第 2 代 BMSCs，根據加入培養液的不同分為 4 組：Ⅰ組，單純細胞培養液；Ⅱ組，細胞培養液中加入 10 ng/mL SAR131675；Ⅲ組，內皮細胞誘導液；Ⅳ組，內皮細胞誘導液中加入 10 ng/mL SAR131675。每隔 2～3 d 換液 1 次，培養 10 d 時同前法采用流式細胞儀檢測各組內皮細胞標志物 vWF、PECAM-1、VE-Cadherin 表達。
1.6 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 新生小鼠基因型鑒定
本組共 8 只新生小鼠行基因型鑒定，其中 GIT1 基因敲除型小鼠 2 只，GIT1 野生型小鼠 2 只，雜合子小鼠 4 只。見圖 1。
2.2 小鼠 BMSCs 鑒定
流式細胞儀檢測示，MSCs 表面標志物 CD44、CD90、CD105 表達均為陽性，單核細胞表面標志物 CD14 和造血細胞表面標志物 CD45 均為陰性。見圖 2。
2.3 GIT1 對 BMSCs 向內皮細胞分化的影響
2.3.1 Western blot 檢測
4 組細胞的 VEGFR-2、pVEGFR-2 蛋白表達無明顯差異，A1 組 VEGFR-3、pVEGFR-3 蛋白表達顯著高于其余 3 組。見圖 3。
2.3.2 流式細胞儀檢測內皮細胞分化差異
A1 組內皮細胞標志物 vWF、PECAM-1 及 VE-Cadherin 表達均顯著高于 A、B、B1 組，B1 組顯著高于 A、B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4、5。
2.4 阻斷 VEGFR-3 對 BMSCs 向內皮細胞分化的影響
Ⅲ組內皮細胞標志物 vWF、PECAM-1 及 VE-Cadherin 表達均顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組，Ⅳ組高于Ⅰ、Ⅱ組，差異均有統計學意義（P<0.05）；Ⅰ、Ⅱ組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 6、7。
圖1
PCR 法行新生小鼠基因型鑒定
M：Marker 1、6：GIT1 基因敲除型 2、3、4、7：GIT1 雜合子 5、8：GIT1 野生型
Figure1. Genotypic identification of newborn mice by PCRM: Marker 1, 6: GIT1 gene knockout type 2, 3, 4, 7: GIT1 gene heterozygote type 5, 8: GIT1 wild type
圖2
流式細胞儀檢測小鼠 BMSCs 表面標志物
a. CD14；b. CD44；c. CD45；d. CD90；e. CD105
Figure2. Characterization of BMSCs by flow cytometrya. CD14; b. CD44; c. CD45; d. CD90; e. CD105
圖3
Western blot 檢測 4 組細胞各蛋白表達
1：A 組 2：A1 組 3：B 組 4：B1 組 a. VEGFR-2 和 pVEGFR-2；b. VEGFR-3 和 pVEGFR-3
Figure3. The protein expressions of 4 groups by Western blot1: Group A 2: Group A1 3: Group B 4: Group B1 a. VEGFR-2 and pVEGFR-2；b. VEGFR-3 and pVEGFR-3
圖4
流式細胞儀檢測各組內皮細胞標志物表達
從左至右依次為 A 組、A1 組、B 組、B1 組 a. vWF；b. PECAM-1；c. VE-Cadherin
Figure4. The expressions of endothelial cell markers detected by flow cytometryFrom left to right for groups A, A1, B, and B1, respectively a. vWF; b. PECAM-1; c. VE-Cadherin
圖5
流式細胞儀檢測各組內皮細胞標志物表達量
Figure5.
The expressions of endothelial cell markers detected by flow cytometry
圖6
流式細胞儀檢測阻斷 VEGFR-3 實驗中各組內皮細胞標志物表達
從左至右依次為Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組 a. vWF；b. PECAM-1；c. VE-Cadherin
Figure6. The expressions of endothelial cell markers in each group of VEGFR-3 blocked experiment detected by flow cytometryFrom left to right for groupsⅠ, Ⅱ, Ⅲ, and Ⅳ, respectively a. vWF; b. PECAM-1; c. VE-Cadherin
圖7
流式細胞儀檢測阻斷 VEGFR-3 實驗中各組內皮細胞標志 物表達量
Figure7.
The expressions of endothelial cell markers in each group of VEGFR-3 blocked experiment detected by flow cytometry
3 討論
BMSCs 是骨髓內存在的一類非造血干細胞，其在體內外具有支持和調控造血的作用，在體內分布于多種組織和器官，并具有多向分化潛能。目前未發現 MSCs 特異性表面抗原。本研究采用流式細胞術檢查了培養細胞表面抗原的表達，其中 MSCs 表面標志物 CD44、CD90、CD105 表達均為陽性，單核細胞表面標志物 CD14 和造血細胞表面標志物 CD45 均為陰性。說明本實驗獲得的細胞具有祖細胞 MSCs 特征，是 BMSCs，而非骨髓組織中的造血干細胞系。本實驗采用 GIT1 雜合子小鼠雌雄配對飼養的方法獲得 GIT1 野生型或 GIT1 基因敲除型純合子小鼠，并通過 PCR 方法進行鑒定。本實驗對來源于兩種小鼠的 BMSCs 進行研究，通過比較血管內皮細胞形成的差異，可在一定程度上說明 GIT1 對血管形成的影響。
研究表明，GIT1 與血管形成及血管通透性等密切相關。Pang 等[6]比較了 GIT1 基因敲除型小鼠與 GIT1 野生型小鼠的肺部，發現基因敲除型小鼠肺部有散在出血，進一步對其肺部進行組織學分析和 CT 檢查，發現肺部毛細血管管徑及數量明顯少于野生型小鼠，認為 GIT1 通過影響內皮細胞來影響血管生成。Yin 等[4]對 GIT1 基因敲除型小鼠與 GIT1 野生型小鼠骨折愈合情況進行研究，發現基因敲除型小鼠骨折愈合速度較野生型小鼠慢，骨痂形成差，且骨痂中新生血管明顯少于野生型小鼠。本實驗中對于各組 BMSCs 向內皮細胞分化進行比較，在同樣條件下通過檢測內皮細胞標志物 vWF、PECAM-1、VE-Cadherin，發現 GIT1 野生型實驗組與 GIT1 基因敲除型實驗組內皮細胞數量有顯著差異，說明 GIT1 蛋白對于 BMSCs 向內皮細胞分化過程中內皮細胞的數量具有重要影響，這可能是 GIT1 影響血管生成的原因之一。
VEGFR 是受體酪氨酸激酶超家族中一員。VEGFR 家族包括 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神經纖毛蛋白 1 和神經纖毛蛋白 2。VEGFR-1 主要參與血管管狀結構的維持和促進內皮細胞的遷移[7]；VEGFR-2 是 VEGF 發揮促血管生成作用的主要受體，與血管生發、血管形成密切相關，促進血管內皮細胞的增殖，是促進血管生成的主要因子[8]；VEGFR-3 主要表達于成熟器官的淋巴管內皮細胞，VEGFR-3 通路通常被認為與淋巴管生成相關[9]。有研究表明，VEGFR-3 也調節血管生成，Saj 等[10]的實驗驗證， VEGFR-3 敲除小鼠在血管叢動靜脈重塑過程存在致命缺陷，在胚胎早期血管生成就會出現障礙。缺失 VEGFR-3，斑馬魚腎動脈形態的生成也出現嚴重缺陷[11]。在抗體阻斷 VEGFR-2 的情況下，VEGF-C 也可刺激 VEGFR-3 促進血管生成，在減少血管生成和腫瘤生長的過程中，阻斷 VEGFR-2 和 VEGFR-3 具有協同作用[12]。Notch 信號通路在血管形成過程誘導動脈內皮細胞及血管生發方面起到關鍵性作用[13]。Notch-1 信號和其配體 Dll-4 在內皮細胞中具有重要作用，缺失 Notch-1 或單拷貝 Dll-4 將導致嚴重血管形成障礙，小鼠在胚胎期就會死亡[14-15]。研究表明[16-17]，VEGFR-3 也和 Notch 相互作用來調節血管生成。在血管生成過程中，可以檢測到 VEGFR-3 表達水平較高，在不同大鼠血管模型中，當使用 VEGFR-3 抗體阻斷 VEGFR-3 時，血管生發、血管密度、血管側支及內皮細胞增殖均減少[12, 18]。選擇性去除內皮細胞中的 Notch，可發現內皮細胞中 VEGFR-3 蛋白表達水平顯著升高，表明 Notch 信號可有效抑制 VEGFR-3 表達[19]。本實驗發現，GIT1 基因敲除型小鼠 BMSCs 分化的內皮細胞其 VEGFR-3 表達水平較 GIT1 野生型小鼠低，對 VEGFR-3 進行阻斷后發現 BMSCs 向內皮細胞分化能力下降，說明 GIT1 是通過 VEGFR-3 影響 BMSCs 向內皮細胞分化。
綜上述，GIT1 會對小鼠 BMSCs 向內皮細胞的分化產生影響，缺少 GIT1 會使 BMSCs 表達 VEGFR-3 降低，進而抑制其向內皮細胞分化。GIT1 可能是通過 VEGFR-3 影響 Notch 信號通路，進而影響血管形成。但血管形成是一種復雜的動態過程，影響因素較多，本實驗僅在體外從細胞層面進行研究，體內機制可能不完全一致，還需要進一步研究證實。
