癲癇是一種常見的神經系統疾病，病因復雜，發作形式多樣，不同年齡均可患病。目前雖然有多種抗癲癇發作藥物可用，但仍有1/3的患者藥物治療效果差。因此，對癲癇更好的診斷和治療顯得尤為重要。外泌體是直徑在30～150 nm的細胞外囊泡，具有強大細胞間信息傳遞功能，在中樞神經系統中也具有重要的作用。神經細胞釋放的外泌體在局部的微環境中能夠參與神經的發育和可塑性，調節神經炎癥，減少神經元的丟失。而且，研究發現外泌體中的某些蛋白或微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）與癲癇高度相關，在癲癇的發生發展中出現改變，使其在癲癇的預防和早期診斷中發揮重要的臨床意義。此外，外泌體具有更好的生物相容性和更低的免疫原性，其體積小，可以有效地避免單核巨噬細胞的吞噬作用，并且表面攜帶的蛋白質具有很強的靶向組織或細胞的歸巢能力，其還可以穿過血腦屏障到達顱內，因此外泌體具有天然藥物輸送的優勢。本文就外泌體在癲癇領域的應用進行綜述，提高科研及臨床工作者對外泌體的認識。
引用本文： 盧倩, 張淇, 王秋紅, 敦碩, 王嘉, 鄒麗萍. 外泌體在癲癇的診斷與治療中的應用. 癲癇雜志, 2023, 9(4): 306-309. doi: 10.7507/2096-0247.202304010 復制
癲癇是一種常見且嚴重的神經系統疾病，由于神經元超同步化放電導致的，以反復癲癇發作為特征[1]。全球的癲癇患者超過7 000萬人，癲癇發作形式多樣，不同年齡均可患病，但多在1歲前起病[1-2]。癲癇病因復雜，主要分為六類，分別為結構性、遺傳性、感染性、代謝性、免疫性和病因不明[3]。目前臨床上有20多種不同的抗癲癇發作藥物，經過適當的治療，多數患者的癲癇發作可以得到控制，但仍有1/3的患者會發展成為藥物難治性癲癇[1]。因此對癲癇的診斷和治療是研究的熱點和難點。
外泌體是具有雙層脂質膜，直徑為30～150 nm的細胞外囊泡[4]。外泌體在綿羊網織紅細胞的體外培養過程中首先發現，最初外泌體被認為是細胞損傷而產生的細胞廢物，或者是用于維持細胞穩定的產物，往往被研究者忽視[5]。近年來，由于外泌體強大細胞間信息傳遞功能而受到越來越多的關注。在中樞神經系統中，神經細胞釋放的外泌體在局部微環境中發揮作用，參與神經發育和可塑性，調節神經炎癥，減少神經元丟失等[6-7]。外泌體在癲癇的診斷和治療中發揮重要作用，本文就外泌體在癲癇中的應用進行綜述，提高科研及臨床工作者的認識。
1 外泌體概述
外泌體是由多泡體分泌。細胞首先內吞形成早期內體，早期內體膜向內以出芽方式形成內囊泡，后多泡體與細胞膜融合，內囊泡被釋放到細胞外空間，稱為外泌體[8]。外泌體屬于細胞外囊泡的一種，不同于微囊泡和凋亡小體。微囊泡是細胞以出芽方式產生，直徑為150～1 000 nm；凋亡小體直徑1～5 μm，包含多種細胞內片段、細胞器和胞漿內容物等[4]。
外泌體中包含多種成分，如脂質、蛋白質、DNA、mRNA、微小核糖核酸（micro Ribonucleic acid，miRNA）等，可以反映親代細胞的病理生理特點[9]。外泌體中富含具有各種功能蛋白質，比如參與細胞侵襲、融合的跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81和CD82）；參與膜轉運相關蛋白Rab蛋白等[4]。外泌體中還含有多種類型RNA，2007年首次報道了來源肥大細胞的外泌體中含有mRNA和miRNA[10]。在人血漿的外泌體RNA種類中miRNAs含量最多。miRNA是一類非編碼RNA，長度約為22個核苷酸，通過與靶mRNA的3’-UTR結合，降低其穩定性，下調翻譯，參與轉錄后水平基因表達調控[11]。單獨miRNA即可影響數百個靶基因表達[11]。大約70%的miRNAs在中樞神經系統中表達，對中樞神經發育中發揮重要作用[12]。
幾乎所有的細胞都可以產生外泌體，外泌體也廣泛存在于血液、腦脊液等各種體液中[13]。目前，不同的外泌體分離技術各有其優缺點[14]，其中應用最廣泛、最靠譜的方法是差速離心法，經過一系列離心步驟純化得到外泌體。
外泌體被鄰近的靶細胞攝取或通過循環系統運輸到其他部位而發揮功能。靶細胞攝取外泌體有三種方式：與質膜融合、受體-配體結合、內吞的方式[12]。神經細胞間的外泌體攝取具有高度特異性。例如來自神經母細胞瘤的外泌體可以與神經元和神經膠質細胞結合，但優先被神經膠質細胞攝取；來自皮層神經元的外泌體則完全被神經元攝取[15]。這種特異性的攝取外泌體的具體機制尚不清楚，可能是外泌體和靶細胞表面分子相互作用的結果[9]。
2 中樞神經系統中不同細胞來源外泌體的研究
不同神經細胞來源的外泌體對中樞神經系統的影響不同。神經元來源的外泌體在神經發育過程中調節軸突、樹突的生長而影響神經傳遞[14，16]。神經元可分泌含有miRNA Let-7c和miRNA-21的外泌體，其與Toll樣受體7（Toll-like receptor-7，TLR-7）結合，而TLR-7的激活將抑制樹突和軸突的生長，而在TLR-7敲除小鼠中這種抑制作用消失[16]。有研究發現用γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）受體拮抗劑處理可使皮層神經元的外泌體分泌增加，而使用α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid，AMPA）受體拮抗劑或N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid， NMDA）受體拮抗劑則外泌體分泌減少，表明外泌體分泌受谷氨酸能突觸活性的調節[14]。神經元可以分泌含有脯氨酸的的跨膜蛋白（Proline-rich 7，PRR7）的外泌體，相鄰神經元通過攝取含有PRR7的外泌體能減少谷氨酸能突觸的數量[14]。
星形膠質細胞來源外泌體包含成纖維細胞生長因子2和血管內皮生長因子，具有神經保護作用[17]。在缺氧和缺少葡萄糖情況下，星形膠質細胞分泌外泌體可以抑制神經元凋亡，增強神經元活力，改善神經元損傷[18]。
小膠質細胞占總膠質細胞的10%，相當于大腦和脊髓的巨噬細胞，具有促炎表型的小膠質細胞分泌的外泌體，利于神經炎癥的發展。小膠質細胞暴露于脂多糖中可使包含促炎性細胞因子、miRNA-155、miRNA-357的外泌體分泌增加[14]。少突膠質細胞形成髓鞘，使得動作電位沿軸突快速的傳播。少突膠質細胞分泌外泌體具有神經保護功能[19]。
已證明來自神經祖細胞的外泌體可通過miRNA-21a促進神經元分化及神經發生[20]。將嚙齒動物外泌體注射到生后4天的小鼠的側腦室中，發現外泌體使得齒狀回顆粒細胞層細胞增殖[21]。將人類誘導多能干細胞分化神經元分泌的外泌體加入到人類原代神經培養物中，結果發現外泌體可以促進細胞增殖和神經元分化、神經發生[21]。
3 外泌體在癲癇診斷中的研究
外泌體是可以用于癲癇診斷和預后的潛在的高敏感生物標志物，在人和動物模型的研究表明外泌體的某些miRNA與癲癇高度相關，為癲癇的早期診斷和預防具有重要的臨床意義。在小鼠海人酸癲癇模型中發現小鼠腦內外泌體分泌增加，在癲癇持續狀態后2周仍可檢測到增多的外泌體[22]。外泌體可以反映親代細胞的狀態，大量數據表明外泌體所含有的蛋白或miRNA在癲癇中發生發展中發生改變，因此外泌體是理想的非侵入性生物標志物。
在癲癇患者和健康對照人群血清外泌體進行蛋白質檢測，發現76種蛋白質差異表達，其中6種蛋白質表達增加，通過大量臨床樣本和慢性癲癇小鼠模型中分析，發現凝血因子IX（coagulation factor IX，F9）和血小板反應蛋白-1（Thrombospondin-1，TSP-1）具有顯著差異，可用于癲癇診斷的生物標志物[23]。
在顳葉癲癇大鼠模型中發現包含miRNA-346和miRNA-331-3p的外泌體在前腦部位減少[24]。通過比較顳葉癲癇、海馬硬化患者與健康人血漿外泌體RNA含量，發現miRNA-3613-5p、miRNA-4668-5p、miRNA-8071、miRNA-197-5p的表達存在差異[25]。還有研究發現顳葉癲癇患者癲癇發作后血漿中miRNA-328-3p比例增加[26]。在9例局灶性皮層發育不良患者和4名健康對照者的外周血分離血清外泌體，通過測序分析，發現miRNA194-2-5p、miRNA-15a-5p、miRNA-132-3p和miRNA-145-5p在局灶性皮層發育不良患者中均表達上調，其可能是局灶性皮層發育不良和難治性癲癇患者潛在的生物標志物[27]。79例遺傳性癲癇患者和67名健康對照者血清miRNA表達情況分析，癲癇患者的miRNA-146a和miRNA-155表達水平明顯上調，有可能參與癲癇發生[28]。在一項針對兒童癲癇患者的研究中，選取同性別、同年齡的健康兒童作為健康對照組，兩組人群空腹狀態下采集血清樣本并提取外泌體，結果發現癲癇組兒童血清外泌體miRNA-155表達水平明顯更高，并且與癲癇病程、腦電圖異常程度呈正相關，即隨著癲癇病程的延長，腦電圖異常越嚴重，miRNA-155表達水平逐漸升高[29]。
4 外泌體在癲癇治療中的研究
外泌體來源于人體，理論上具有更好的生物相容性和更低的免疫原性，其體積小，可有效避免單核巨噬細胞的吞噬作用。外泌體表面攜帶的蛋白質具有很強的靶向組織或細胞的歸巢能力，還可以穿過生物屏障（如血腦屏障），因此具有天然藥物輸送的優勢，是具有前景的靶向藥物載體[30]。因此，外泌體應用于多種疾病的治療中，如心血管疾病、腫瘤疾病、免疫性疾病，神經系統疾病如癲癇等[31-34]，多數仍處于進行中，一些初步的研究結果顯示出外泌體治療的安全性和有效性。
海人酸癲癇模型中，在癲癇持續狀態后通過鼻內給藥的方式，給予人骨髓間充質干細胞來源的外泌體，結果發現外泌體可以有效的分布到雙側前腦多個區域的神經元和小膠質細胞內，并且腦損傷區域神經元對外泌體攝取更高[35]。從人骨髓間充質干細胞中純化A1外泌體，其具有強大的抗炎特性。在小鼠匹魯卡品癲癇模型中，將A1外泌體通過鼻內給藥的方式，結果顯示谷氨酸能和GABA能神經元損傷減少，并大大減輕了海馬的炎癥反應，有效預防癲癇持續狀態誘導的認知和記憶障礙[36]。間充質干細胞來源外泌體通過Nrf2-NF-κB信號通路參與調節星形膠質細胞活化，在癲癇模型小鼠中可以減弱反應性星形膠質細胞增生和炎癥反應[37]，發揮抗癲癇作用。
5 小結與展望
外泌體是納米醫學領域的一種有前途的工具，在癲癇的診斷和治療方面發揮重要作用。但外泌體的臨床應用仍處于起步階段，在臨床充分發揮其潛力之前，外泌體的分離、純化、生產等仍存在一些困難，當使用外泌體治療時，必須實現大規模穩定的制備方法。充分了解外泌體生物學的基本方面（外泌體產生、靶細胞等）和下游的信號轉導，是外泌體在癲癇的診斷和治療中應用的關鍵。如何更好地將外泌體應用于癲癇疾病領域，將來仍然需要進一步全方位、多方面的研究。
利益沖突 所有作者無利益沖突。
癲癇是一種常見且嚴重的神經系統疾病，由于神經元超同步化放電導致的，以反復癲癇發作為特征[1]。全球的癲癇患者超過7 000萬人，癲癇發作形式多樣，不同年齡均可患病，但多在1歲前起病[1-2]。癲癇病因復雜，主要分為六類，分別為結構性、遺傳性、感染性、代謝性、免疫性和病因不明[3]。目前臨床上有20多種不同的抗癲癇發作藥物，經過適當的治療，多數患者的癲癇發作可以得到控制，但仍有1/3的患者會發展成為藥物難治性癲癇[1]。因此對癲癇的診斷和治療是研究的熱點和難點。
外泌體是具有雙層脂質膜，直徑為30～150 nm的細胞外囊泡[4]。外泌體在綿羊網織紅細胞的體外培養過程中首先發現，最初外泌體被認為是細胞損傷而產生的細胞廢物，或者是用于維持細胞穩定的產物，往往被研究者忽視[5]。近年來，由于外泌體強大細胞間信息傳遞功能而受到越來越多的關注。在中樞神經系統中，神經細胞釋放的外泌體在局部微環境中發揮作用，參與神經發育和可塑性，調節神經炎癥，減少神經元丟失等[6-7]。外泌體在癲癇的診斷和治療中發揮重要作用，本文就外泌體在癲癇中的應用進行綜述，提高科研及臨床工作者的認識。
1 外泌體概述
外泌體是由多泡體分泌。細胞首先內吞形成早期內體，早期內體膜向內以出芽方式形成內囊泡，后多泡體與細胞膜融合，內囊泡被釋放到細胞外空間，稱為外泌體[8]。外泌體屬于細胞外囊泡的一種，不同于微囊泡和凋亡小體。微囊泡是細胞以出芽方式產生，直徑為150～1 000 nm；凋亡小體直徑1～5 μm，包含多種細胞內片段、細胞器和胞漿內容物等[4]。
外泌體中包含多種成分，如脂質、蛋白質、DNA、mRNA、微小核糖核酸（micro Ribonucleic acid，miRNA）等，可以反映親代細胞的病理生理特點[9]。外泌體中富含具有各種功能蛋白質，比如參與細胞侵襲、融合的跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81和CD82）；參與膜轉運相關蛋白Rab蛋白等[4]。外泌體中還含有多種類型RNA，2007年首次報道了來源肥大細胞的外泌體中含有mRNA和miRNA[10]。在人血漿的外泌體RNA種類中miRNAs含量最多。miRNA是一類非編碼RNA，長度約為22個核苷酸，通過與靶mRNA的3’-UTR結合，降低其穩定性，下調翻譯，參與轉錄后水平基因表達調控[11]。單獨miRNA即可影響數百個靶基因表達[11]。大約70%的miRNAs在中樞神經系統中表達，對中樞神經發育中發揮重要作用[12]。
幾乎所有的細胞都可以產生外泌體，外泌體也廣泛存在于血液、腦脊液等各種體液中[13]。目前，不同的外泌體分離技術各有其優缺點[14]，其中應用最廣泛、最靠譜的方法是差速離心法，經過一系列離心步驟純化得到外泌體。
外泌體被鄰近的靶細胞攝取或通過循環系統運輸到其他部位而發揮功能。靶細胞攝取外泌體有三種方式：與質膜融合、受體-配體結合、內吞的方式[12]。神經細胞間的外泌體攝取具有高度特異性。例如來自神經母細胞瘤的外泌體可以與神經元和神經膠質細胞結合，但優先被神經膠質細胞攝取；來自皮層神經元的外泌體則完全被神經元攝取[15]。這種特異性的攝取外泌體的具體機制尚不清楚，可能是外泌體和靶細胞表面分子相互作用的結果[9]。
2 中樞神經系統中不同細胞來源外泌體的研究
不同神經細胞來源的外泌體對中樞神經系統的影響不同。神經元來源的外泌體在神經發育過程中調節軸突、樹突的生長而影響神經傳遞[14，16]。神經元可分泌含有miRNA Let-7c和miRNA-21的外泌體，其與Toll樣受體7（Toll-like receptor-7，TLR-7）結合，而TLR-7的激活將抑制樹突和軸突的生長，而在TLR-7敲除小鼠中這種抑制作用消失[16]。有研究發現用γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）受體拮抗劑處理可使皮層神經元的外泌體分泌增加，而使用α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid，AMPA）受體拮抗劑或N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid， NMDA）受體拮抗劑則外泌體分泌減少，表明外泌體分泌受谷氨酸能突觸活性的調節[14]。神經元可以分泌含有脯氨酸的的跨膜蛋白（Proline-rich 7，PRR7）的外泌體，相鄰神經元通過攝取含有PRR7的外泌體能減少谷氨酸能突觸的數量[14]。
星形膠質細胞來源外泌體包含成纖維細胞生長因子2和血管內皮生長因子，具有神經保護作用[17]。在缺氧和缺少葡萄糖情況下，星形膠質細胞分泌外泌體可以抑制神經元凋亡，增強神經元活力，改善神經元損傷[18]。
小膠質細胞占總膠質細胞的10%，相當于大腦和脊髓的巨噬細胞，具有促炎表型的小膠質細胞分泌的外泌體，利于神經炎癥的發展。小膠質細胞暴露于脂多糖中可使包含促炎性細胞因子、miRNA-155、miRNA-357的外泌體分泌增加[14]。少突膠質細胞形成髓鞘，使得動作電位沿軸突快速的傳播。少突膠質細胞分泌外泌體具有神經保護功能[19]。
已證明來自神經祖細胞的外泌體可通過miRNA-21a促進神經元分化及神經發生[20]。將嚙齒動物外泌體注射到生后4天的小鼠的側腦室中，發現外泌體使得齒狀回顆粒細胞層細胞增殖[21]。將人類誘導多能干細胞分化神經元分泌的外泌體加入到人類原代神經培養物中，結果發現外泌體可以促進細胞增殖和神經元分化、神經發生[21]。
3 外泌體在癲癇診斷中的研究
外泌體是可以用于癲癇診斷和預后的潛在的高敏感生物標志物，在人和動物模型的研究表明外泌體的某些miRNA與癲癇高度相關，為癲癇的早期診斷和預防具有重要的臨床意義。在小鼠海人酸癲癇模型中發現小鼠腦內外泌體分泌增加，在癲癇持續狀態后2周仍可檢測到增多的外泌體[22]。外泌體可以反映親代細胞的狀態，大量數據表明外泌體所含有的蛋白或miRNA在癲癇中發生發展中發生改變，因此外泌體是理想的非侵入性生物標志物。
在癲癇患者和健康對照人群血清外泌體進行蛋白質檢測，發現76種蛋白質差異表達，其中6種蛋白質表達增加，通過大量臨床樣本和慢性癲癇小鼠模型中分析，發現凝血因子IX（coagulation factor IX，F9）和血小板反應蛋白-1（Thrombospondin-1，TSP-1）具有顯著差異，可用于癲癇診斷的生物標志物[23]。
在顳葉癲癇大鼠模型中發現包含miRNA-346和miRNA-331-3p的外泌體在前腦部位減少[24]。通過比較顳葉癲癇、海馬硬化患者與健康人血漿外泌體RNA含量，發現miRNA-3613-5p、miRNA-4668-5p、miRNA-8071、miRNA-197-5p的表達存在差異[25]。還有研究發現顳葉癲癇患者癲癇發作后血漿中miRNA-328-3p比例增加[26]。在9例局灶性皮層發育不良患者和4名健康對照者的外周血分離血清外泌體，通過測序分析，發現miRNA194-2-5p、miRNA-15a-5p、miRNA-132-3p和miRNA-145-5p在局灶性皮層發育不良患者中均表達上調，其可能是局灶性皮層發育不良和難治性癲癇患者潛在的生物標志物[27]。79例遺傳性癲癇患者和67名健康對照者血清miRNA表達情況分析，癲癇患者的miRNA-146a和miRNA-155表達水平明顯上調，有可能參與癲癇發生[28]。在一項針對兒童癲癇患者的研究中，選取同性別、同年齡的健康兒童作為健康對照組，兩組人群空腹狀態下采集血清樣本并提取外泌體，結果發現癲癇組兒童血清外泌體miRNA-155表達水平明顯更高，并且與癲癇病程、腦電圖異常程度呈正相關，即隨著癲癇病程的延長，腦電圖異常越嚴重，miRNA-155表達水平逐漸升高[29]。
4 外泌體在癲癇治療中的研究
外泌體來源于人體，理論上具有更好的生物相容性和更低的免疫原性，其體積小，可有效避免單核巨噬細胞的吞噬作用。外泌體表面攜帶的蛋白質具有很強的靶向組織或細胞的歸巢能力，還可以穿過生物屏障（如血腦屏障），因此具有天然藥物輸送的優勢，是具有前景的靶向藥物載體[30]。因此，外泌體應用于多種疾病的治療中，如心血管疾病、腫瘤疾病、免疫性疾病，神經系統疾病如癲癇等[31-34]，多數仍處于進行中，一些初步的研究結果顯示出外泌體治療的安全性和有效性。
海人酸癲癇模型中，在癲癇持續狀態后通過鼻內給藥的方式，給予人骨髓間充質干細胞來源的外泌體，結果發現外泌體可以有效的分布到雙側前腦多個區域的神經元和小膠質細胞內，并且腦損傷區域神經元對外泌體攝取更高[35]。從人骨髓間充質干細胞中純化A1外泌體，其具有強大的抗炎特性。在小鼠匹魯卡品癲癇模型中，將A1外泌體通過鼻內給藥的方式，結果顯示谷氨酸能和GABA能神經元損傷減少，并大大減輕了海馬的炎癥反應，有效預防癲癇持續狀態誘導的認知和記憶障礙[36]。間充質干細胞來源外泌體通過Nrf2-NF-κB信號通路參與調節星形膠質細胞活化，在癲癇模型小鼠中可以減弱反應性星形膠質細胞增生和炎癥反應[37]，發揮抗癲癇作用。
5 小結與展望
外泌體是納米醫學領域的一種有前途的工具，在癲癇的診斷和治療方面發揮重要作用。但外泌體的臨床應用仍處于起步階段，在臨床充分發揮其潛力之前，外泌體的分離、純化、生產等仍存在一些困難，當使用外泌體治療時，必須實現大規模穩定的制備方法。充分了解外泌體生物學的基本方面（外泌體產生、靶細胞等）和下游的信號轉導，是外泌體在癲癇的診斷和治療中應用的關鍵。如何更好地將外泌體應用于癲癇疾病領域，將來仍然需要進一步全方位、多方面的研究。
利益沖突 所有作者無利益沖突。