引用本文： AbrairaL, SantamarinaE, CazorlaS, 郭雅靜 孟永玲 譯, 薛國芳 審. 探尋預測急性卒中事件后發生癲癇的生物標記物. 癲癇雜志, 2021, 7(6): 547-554. doi: 10.7507/2096-0247.20210091 復制
要點
? 血液生物標志物可以為急性腦卒中患者的癲癇發生提供新的數據
? S100B 和 Hsc70 水平下調和內皮抑素水平升高可能預示長期卒中后癲癇
? 臨床變量和血液生物標志物同時使用比單獨使用臨床變量可能會更好地預測卒中后癲癇
有 20%～60% 的癲癇是由急性腦損傷導致的，如創傷性腦損傷、卒中或者中樞神經系統感染。卒中后癲癇的發病率為 2%～20%，其中 60 歲以上的新發癲癇患者約 50% 由卒中引起。
卒中后 7 天內發生的卒中相關性癇性發作被歸為早發性癇性發作，超過這個時間點的則歸為遲發性癇性發作。一項基于人群的研究顯示遲發性癇性發作在 10 年復發風險達 71.5%。因此，根據國際抗癲癇聯盟（ILAE）的標準，存在一次遲發性癇性發作的卒中患者被認為是結構性癲癇。
發生卒中后癲癇的主要危險因素是年齡小、出血性卒中、皮層受累和卒中的嚴重程度。然而，在這一領域為數不多的可用研究是異質的，并且長時間的隨訪使臨床試驗設計變得困難。盡管已經提出了一些預測模型，比如 SeLECT 評分，但我們仍不能準確預測哪些患者會發生卒中后癲癇。
卒中后的潛伏期會持續數天、數周、數月或數年，在此期間，大腦在潛伏期經歷了一段致癇過程，這使自發性反復性癲癇發作更易發生。最近的研究表明，影響大腦的各種急性事件（如頭外傷、卒中、感染）的機制與上述情況的機制可能相似。針對這些損傷，多種炎癥介質均被釋放，如損傷相關模式分子（DAMPs）、細胞因子、趨化因子、補體、前列腺素和轉化生長因子 β（TGF-β），以修復腦損傷。當神經炎癥持續一段時間后，會導致神經元和星形膠質細胞功能障礙，并進一步導致突觸傳遞的改變、過度興奮、神經元丟失、膠質細胞增生和異常神經發生。因此，這些機制可能參與了癲癇發生的過程。
一些炎癥分子已經被認為是為這些病理進程的生物標記物。我們發現卒中后早發的癇性發作與高水平的神經細胞黏附分子（NCAM）和低水平的腫瘤壞死因子（TNF）-R1 有關。最近，Zelano 研究了機械取栓術后患者中早發性癇性發作和癲癇中血液標記物的動態變化。盡管如此，我們目前對大腦炎癥和這些分子是否參與卒中相關性癲癇的認識仍然有限。神經炎癥相關的非侵入性生物標記物的發現將有助于識別分子靶點，從而促進預防或修正卒中后癲癇發生的新型治療方法產生。本研究旨在研究急性卒中的臨床因素和生物標記物，并從較長時間的觀察分析它們與癲癇發展的關系。
1 材料和方法
1.1 研究設計
我們進行了一項前瞻性縱向研究，從 Stroke-Chip 研究的 1 115 例缺血性和出血性卒中的患者中評估癲癇的發展，該研究旨在尋求一種基于血液的工具來區分假性卒中和卒中類型。當神經癥狀持續超過 24 小時或在神經影像學中觀察到病變時，診斷為卒中。當未觀察到病變時，考慮短暫性腦缺血發作（TIA）。排除標準除了最初研究中應用的標準外，還有癲癇、短暫性腦缺血發作、蛛網膜下腔出血、動靜脈畸形、硬膜下血腫的病史，以及病歷中數據缺失。本研究對 Stroke-Chip 急性期獲得的生物標志物結果和其他數據進行分析，并對本研究中位隨訪近 5 年的數據進行分析，以探討癲癇的預測因子。
該研究得到了西班牙 Vall d’Hebron 大學醫院（PR（AG）397/2016）和 Germans Trias i Pujol 大學醫院（PI-17-113）倫理委員會的批準，并由 La Fundació La Marató 資助（Reg.84/240 項目.201702）。
1.2 生物標志物分析
在卒中發生 6 小時內和任何治療前，用 EDTA 管采集所有入組病例血標本。標本在 4℃ 以 1500×g 離心 15 分鐘，分裝血漿并保存在?80℃。14 種生物標記物-S100 鈣結合蛋白 B（S100B）（pg/ mL）、Hsc70（ng/mL）、TNF-R1（pg/mL）、Fas 配體（FasL）（pg/mL）、白細胞介素 6（IL-6）（pg/mL）、N 端前 B 型利鈉肽（NT-proBNP）（pg/mL）、內皮抑素（ng/mL）、胰島素樣生長因子結合蛋白-3（IGFBP-3）（pg/mL）、生長相關癌基因 α（GroA）（pg/ mL）、D-二聚體（ng/mL）、血管性血友病因子（vWF）（%），血管粘附蛋白-1（VAP-1）（pg/ mL）、載脂蛋白 CIII（ApoCIII）（μg/ml）和 NCAM（pg/ mL）-在最初的研究中被用來區分卒中和類卒中以及缺血性卒中和顱內出血，并在本研究中進行了分析。
我們使用免疫分析法進行生物標記物分析。所有技術均由不知曉臨床診斷的技術人員遵照說明完成。所有樣品均一式兩份進行測試，變異系數<20%。通過對每個板的商品內對照（來自男性 AB 凝結全血的人血清，Sigma-Aldrich，cat#H6914）的重復測試以及板間濃度的比較來確定分析批間差異。數據進行對數轉換，除以每個板的內部控制值。對于分析，板間變異系數<20% 是可以接受的。由于大多數生物標志物（CVs 高達 30%）的板間差異較大，因此也通過使用 Z scores 的板對值進行標準化［平均值 2，標準偏差（SD）1］（附加信息顯示了根據從卒中發作開始采樣的時間，每個生物標志物水平的點狀圖）。
1.3 臨床評估
所有入組患者通過電話聯系，并使用基于之前驗證過的問卷并進一步專為本研究設計的結構化問卷進行訪談；該問卷由所有研究者審核通過。當患者本人不能聯系到，會詢問一名家庭成員或護理人員，如果家庭成員或護理人員也不能聯系上，會通過病例回顧收集數據。問卷包括與癲癇相關的變量（癲癇發作時間、癲癇復發、癲癇家族史、抗癲癇藥物治療）、功能狀態使用改良 rankin 量表（mRS）、日常活動 Barthel 量表、蒙特利爾認知評估（MoCA）和再梗死事件。問卷檢測到的所有癲癇發作隨后通過病例回顧進行確認，如果有任何疑問，也進行面對面的訪問。
Stroke-Chip 研究之前已經收集了與卒中發作相關的臨床和放射學變量。卒中相關變量包括卒中類型（缺血性或出血性）、根據 NIHSS 評估卒中嚴重程度、根據牛津社區卒中項目（CSP）分類的受影響腦動脈區域、基于歐洲合作急性卒中研究 III 標準的癥狀性出血性轉化 NIHSS 評分增加≥4 的（任何出血性轉化）和病因［在急性卒中治療（TOAST）分類中對 ORG 101 172 的試驗］。根據 ILAE 定義，卒中后癲癇的診斷是在卒中 7 天后發生了癇性發作。
1.4 統計分析
所有數據使用 IBM SPSS 統計軟件（22.0 版）和 R 軟件（3.4.4 版）進行描述性和頻率統計分析（美國伊利諾伊州芝加哥市 SPSS Inc.）。采用 Kaplan-Meier 生存曲線分析法分析隨訪期間遲發性癲癇發作頻率，對數秩檢驗確定各組之間的顯著性差異，Cox 回歸模型評估連續變量的差異。若患者在死亡之前沒有癲癇發作，則被排除。R 語言“fmsb”包制作的雷達圖顯示遲發性癲癇發作和無癲癇發作時每個生物標志物的均值。SurvivalROC 繪制時間依賴的受試者工作特性（ROC）曲線，計算基線 NIHSS 評分的分界值并找出 Cox 回歸模型中 P<0.25 的生物標志物，以證明它們對癲癇發展的預測具有最佳敏感性和特異性；用 Youden 指數最大值（敏感性+特異性-1）確定最佳分界值。對單變量分析中 P<0.1 的生物標記物進行多重 Cox 回歸模型，采用正向逐步方法來確定隨訪期間癲癇發生的獨立相關因素。一個模型只使用臨床變量，另一個模型使用生物標志物和臨床變量。結果以 95% 置信區間（CI）的風險比（HR）顯示。ROC 曲線評估模型的性能并確定其預測癲癇發生的能力。用綜合判別改進指數（IDI）和凈重分類改進指數（NRI）評價臨床數據模型中有意義的生物標志物的增量效應。在刪失生存數據后的預測模型中，使用 survIDINRI R 軟件獲得的 IDI 和 RDI 指數。以 P 值 <0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 人口統計學
在 Stroke-Chip 研究的 1 115 例患者中，有 895 例符合本研究的納入標準。排除的原因是既往有癲癇病史（n=22）、短暫性腦缺血發作（或 TIAn=101）、蛛網膜下腔出血（n=11）、硬膜下血腫（n=4）、動靜脈畸形（n=1）和數據不完整（n=12）（圖 1）。基線特征如表 1 所示。年齡的平均值±SD 為 72.0±13.1 歲，57.8% 的患者為男性。高血壓是樣本中最常見的血管危險因素（n=668，74.6%）。基線 NIHSS 評分中位數為 8（IQR 4～17），84% 的患者（n=752）發生過缺血性卒中。中位隨訪時間為 4.8 年（IQR 1.6～5.2）。總共有 41%（n=367）的患者在隨訪期間死亡。1 年死亡率為 21.5%，39.5%（n=145）的患者死于卒中或相關并發癥。
圖1
納入研究患者流程圖
表1
人口學和臨床特征
2.2 臨床特征與癲癇
51 例患者（5.7%）發展為癲癇，平均發病時間為 232 天（IQR 86～491）；其中 45 例（88.2%）為缺血性卒中組。最常見的癲癇發作類型是局灶性知覺性運動性癲癇發作（11 例，32.4%），其次是局灶性意識受損性運動性癲癇發作（9 例，26.5%）。表 1 顯示了卒中后癲癇患者和非癲癇患者之間的差異。癲癇患者的基線 NIHSS 評分更高（P<0.001），早發性癲癇發作更頻繁（P<0.001）。皮層卒中病灶與卒中后癲癇風險高度相關（9.3% vs.4.9%；P=0.004）。在缺血性卒中組，接受再灌注治療的患者有發展為卒中后癲癇的趨勢（7.3% vs. 4.7%；P=0.101）。
在多變量分析中，癲癇高風險的唯一獨立預測因子是 NIHSS 評分>8［危險比（HR）=4.013，95%CI（2.123，7.586），P<0.001］和早發性癲癇發作史［HR=4.038，95%CI（1.802，9.045），P<0.001］。
2.3 血液生物標志物與癲癇
與未發展為癲癇的患者相比，癲癇患者的 D-二聚體、內皮抑素和 FasL 水平較高，Hsc70 和 S100B 水平較低（圖 2）。預測癲癇發展的最佳分界點是 D-dimer 高于 1.939，內皮抑素高于 1.203，FasL 高于 1.868，S100B 低于 1.364，Hsc70 低于 2.496（表 2）。
圖2
生物標志物值的雷達圖
雷達圖顯示了每個生物標志物的平均 Z 分數。晚期癲癇發作的患者具有更高水平的內皮抑素，D-二聚體和 Fasl，以及較低的 Hsc70 和 S100B
表2
血液生物標志物的值和P <0. 25 的生物標志物的最佳分界值
在調整了顯著臨床變量的多元回歸模型中，癲癇的唯一獨立預測因子是內皮抑素水平>1.203 ［P=0.046，HR=4.300，95%CI（1.028，17.996）］，Hsc70 水平<2.496 ［P=0.006，HR=3.795，95%CI（1.476，9.760）］，以及 S100B 水平<1.364 ［P=0.001，HR=2.955，95%CI（1.534，5.491）］。
當這些生物標志物聯合在一起時，癲癇的風險增加到 17% 左右（圖 3）。當臨床變量與血液生物標志物聯合使用時［74.3%，95%CI（65.2%，83.3%）］，預測模型的 ROC 曲線下面積比單獨使用臨床變量時［68.9%，95%CI（60.3%，77.6%）］略高（圖 4）。
圖3
預測癲癇的血液生物標記物的組合（內皮抑素>1.203；S100B<1.364；Hsc70<2.496）
當存在任何一種生物標記物時，癲癇風險增加至 2.6%；當存在三種生物標記物中的任意兩種時，風險增加至 5.0%；當三種生物標記物均存在時，風險增加至 16.8%
圖4
癲癇預測模型的接受者操作特性（ROC）曲線
臨床變量和血液生物標記物（內皮抑素、S100B 和 Hsc70）同時存在時的回歸模型預測能力要高于臨床變量單獨存在時的預測能力
IDI 和 NRI 值分別為 0.090 ［95%CI（0.038，0.162），P<0.001］和 0.289 ［95%CI（0.118，0.499），P=0.007］，因此，對于僅用臨床變量構建的模型，納入生物標志物的模型更具有統計學意義。
3 討論
本研究首次探討了血液生物標志物在預測缺血性和出血性腦卒中后癲癇中的作用。我們調查了隨訪時間中位數為 5 年腦卒中患者的情況，以確定某些卒中后生物標志物是否可以預測該人群的癲癇發生。與文獻報道一致，卒中相關癲癇的患病率約為 6%，且多發生于 NIHSS 評分較高且有早期癇性發作史的患者。接受再灌注治療的患者，約 7% 發生卒中后癲癇，與早期研究相似（其發生率在 4% ～ 16.7% 之間）。我們研究發現皮層受累與卒中嚴重程度（NIHSS）密切相關，所以在多元回歸分析后沒有發現明確結果。值得注意的是，與之前報道高達 72% 的長期死亡率研究一致，本研究死亡率高達 41%；因此，我們研究的死亡率也可能隨時間延長而增高。
我們發現，S100B、Hsc70 水平降低和內皮抑素水平升高與長期罹患癲癇風險增加有關。本研究結果為我們前期的研究提供了有利的補充，卒中后早期癲癇發作與卒中急性期兩個生物標志物 TNF-R1 水平降低和 NCAM 水平升高存在關聯。
S100B 和 Hsc70 在發展為癲癇的患者中均下調。這些生物標志物屬于 DAMPs 蛋白家族，在卒中后神經炎癥階段被釋放。在出血轉化高危患者進行溶栓治療前就可以觀察到血清 S100B 水平升高。鑒于卒中嚴重程度和出血成分是公認的卒中后癲癇的危險因素，這些患者血清 S100B 升高是合理的。星形膠質細胞分泌的細胞因子 S100B 是由活化的星形膠質細胞釋放的，在膠質激活機制中起重要作用。源于實驗動物模型和人類癲癇的研究證實，小膠質細胞過度激活和相關促炎因子過度產生被認為是癲癇發生和癲癇發作后損傷的關鍵機制。
然而，我們發現 S100B 水平較低的腦卒中患者，具有較高的長期癲癇的風險。一些研究顯示，S100B 對于維持血腦屏障（BBB）功能完整性至關重要，該分子水平降低可能導致血腦屏障功能缺陷。另有作者報道腦損傷后 S100B 下降，血腦屏障受損，大腦暴露于白蛋白等血清蛋白中。白蛋白誘導炎癥反應和膠質細胞激活，包括上調白細胞介素 IL-1β，其可抑制 S100B 釋放。因此，S100B 早期的下調可能意味著早期血腦屏障破壞和腦損傷神經修復所需的小膠質細胞激活的潛在下調。
值得注意的是，血清 S100B 在卒中后不會立即升高，卒中后 8 h 開始上升，3 天后達到高峰。由于血樣是在卒中后前 6 h 內抽取的，因此我們無法研究 S100B 在前 72 h 內隨時間的變化情況。
Hsc70 蛋白屬于熱休克蛋白家族（Hsc ［組成型］和 Hsp ［誘導型］），在發展為癲癇的患者中也有所下降。Hsc70 在非應激條件下存在，參與蛋白質合成，在應激時被輕度誘導。相比之下，Hsp70 在應激時被高度誘導以促進細胞恢復。在正常和應激情況下，Hsc70 都對維持蛋白質穩態很重要；當 Hsp70 過表達時可以下調。鑒于 Hsc70 參與蛋白質穩態，較低水平將影響血腦屏障成份的合成，從而影響其功能。此外，我們研究發現的 Hsc70 下調也可以通過 Hsp70 過表達來解釋。
內皮抑素在長期罹患癲癇風險較高的患者中其水平較高。內皮抑素是血管生成的抑制劑，有助于誘導神經發生和細胞增殖。在腦損傷后觀察到短暫的血管生成反應；因此，內皮抑素的上調可能影響細胞修復。在嚴重腦外傷患者腦脊液中發現內皮抑素水平升高，但目前尚無急性腦卒中患者內皮抑素水平的確切數據。
有趣的是，當這些生物標志物聯合分析時，癲癇的風險上升到 17%，提高了三倍以上。S100B、Hsc70 和內皮抑素水平異常會使大腦的損傷難以修復。所有這些生物標志物可能與臨床預測因素發生相同的作用增加卒中后癲癇風險。在曲線下面積（AUC）結果中，血液生物標志物和臨床變量的組合具有比臨床變量更高的預測能力，NRI 和 IDI 的陽性結果支持上述結論。這些數據表明，生物標志物有助于識別卒中患者中發生卒中相關癲癇的人群。
關于該研究主題的文獻有限，每種生物標志物在癲癇發生發展中的作用尚不明確。在本研究中，所有血液樣本都是在腦卒中發病后 6 小時內采集的，我們不知道結果是否會因采集時間的不同而有差異。一方面，我們推測如果推遲抽取血樣的時間，生物標志物水平可能上調。另一方面，癲癇風險較高的患者可能存在基線水平下調和對腦損害反應受損。因此，與我們早發癲癇發作的研究結果相比，本研究結果可能反映了大腦對修復腦損傷的反應較差，而非急性神經炎癥反應。
此外，我們對缺血組進行分層分析獲得相似結果后，決定合并兩種類型的卒中。對于出血組，由于樣本太少，沒有發現有統計學意義的結果。然而，出血性卒中組觀察到的生物標志物與缺血組一致。由于此原因，我們認為將整個樣本用于本研究是合理的。
我們的研究存在幾個局限性，首先，隨訪期間死亡人數的增加可能會對遲發性癲癇患者的數量產生負面影響。此外，少數患者用腦電圖（EEG）來診斷，因此部分癲癇發作可能被誤診，尤其是無運動癥狀的癲癇。其次，我們的研究集中于影響患者生活質量的癲癇發作以及與更嚴重的癲癇發作相關的生物標志物。最后，采用探索性方法與多重測試未糾正相結合，不確定結論風險較高。因此，在得出任何明確的結論之前，必須重復我們的結果。
綜上，本研究發現，S100B、HsC70 的下調和內皮抑素的上調與卒中后癲癇的發生有關，檢測他們的變化可以為評估卒中后癲癇風險提供除臨床危險因素之外的信息。這些生物標志物的確切含義尚不確定，需要進一步的研究來驗證這些生物標志物，也需要獲取不同時間段的血液樣本，以更好地了解血液生物標志物的動態變化。這方面有必要進一步研究以闡明它們對致癇過程的影響，并有助于探索針對這些患者有價值的治療方法。
要點
? 血液生物標志物可以為急性腦卒中患者的癲癇發生提供新的數據
? S100B 和 Hsc70 水平下調和內皮抑素水平升高可能預示長期卒中后癲癇
? 臨床變量和血液生物標志物同時使用比單獨使用臨床變量可能會更好地預測卒中后癲癇
有 20%～60% 的癲癇是由急性腦損傷導致的，如創傷性腦損傷、卒中或者中樞神經系統感染。卒中后癲癇的發病率為 2%～20%，其中 60 歲以上的新發癲癇患者約 50% 由卒中引起。
卒中后 7 天內發生的卒中相關性癇性發作被歸為早發性癇性發作，超過這個時間點的則歸為遲發性癇性發作。一項基于人群的研究顯示遲發性癇性發作在 10 年復發風險達 71.5%。因此，根據國際抗癲癇聯盟（ILAE）的標準，存在一次遲發性癇性發作的卒中患者被認為是結構性癲癇。
發生卒中后癲癇的主要危險因素是年齡小、出血性卒中、皮層受累和卒中的嚴重程度。然而，在這一領域為數不多的可用研究是異質的，并且長時間的隨訪使臨床試驗設計變得困難。盡管已經提出了一些預測模型，比如 SeLECT 評分，但我們仍不能準確預測哪些患者會發生卒中后癲癇。
卒中后的潛伏期會持續數天、數周、數月或數年，在此期間，大腦在潛伏期經歷了一段致癇過程，這使自發性反復性癲癇發作更易發生。最近的研究表明，影響大腦的各種急性事件（如頭外傷、卒中、感染）的機制與上述情況的機制可能相似。針對這些損傷，多種炎癥介質均被釋放，如損傷相關模式分子（DAMPs）、細胞因子、趨化因子、補體、前列腺素和轉化生長因子 β（TGF-β），以修復腦損傷。當神經炎癥持續一段時間后，會導致神經元和星形膠質細胞功能障礙，并進一步導致突觸傳遞的改變、過度興奮、神經元丟失、膠質細胞增生和異常神經發生。因此，這些機制可能參與了癲癇發生的過程。
一些炎癥分子已經被認為是為這些病理進程的生物標記物。我們發現卒中后早發的癇性發作與高水平的神經細胞黏附分子（NCAM）和低水平的腫瘤壞死因子（TNF）-R1 有關。最近，Zelano 研究了機械取栓術后患者中早發性癇性發作和癲癇中血液標記物的動態變化。盡管如此，我們目前對大腦炎癥和這些分子是否參與卒中相關性癲癇的認識仍然有限。神經炎癥相關的非侵入性生物標記物的發現將有助于識別分子靶點，從而促進預防或修正卒中后癲癇發生的新型治療方法產生。本研究旨在研究急性卒中的臨床因素和生物標記物，并從較長時間的觀察分析它們與癲癇發展的關系。
1 材料和方法
1.1 研究設計
我們進行了一項前瞻性縱向研究，從 Stroke-Chip 研究的 1 115 例缺血性和出血性卒中的患者中評估癲癇的發展，該研究旨在尋求一種基于血液的工具來區分假性卒中和卒中類型。當神經癥狀持續超過 24 小時或在神經影像學中觀察到病變時，診斷為卒中。當未觀察到病變時，考慮短暫性腦缺血發作（TIA）。排除標準除了最初研究中應用的標準外，還有癲癇、短暫性腦缺血發作、蛛網膜下腔出血、動靜脈畸形、硬膜下血腫的病史，以及病歷中數據缺失。本研究對 Stroke-Chip 急性期獲得的生物標志物結果和其他數據進行分析，并對本研究中位隨訪近 5 年的數據進行分析，以探討癲癇的預測因子。
該研究得到了西班牙 Vall d’Hebron 大學醫院（PR（AG）397/2016）和 Germans Trias i Pujol 大學醫院（PI-17-113）倫理委員會的批準，并由 La Fundació La Marató 資助（Reg.84/240 項目.201702）。
1.2 生物標志物分析
在卒中發生 6 小時內和任何治療前，用 EDTA 管采集所有入組病例血標本。標本在 4℃ 以 1500×g 離心 15 分鐘，分裝血漿并保存在?80℃。14 種生物標記物-S100 鈣結合蛋白 B（S100B）（pg/ mL）、Hsc70（ng/mL）、TNF-R1（pg/mL）、Fas 配體（FasL）（pg/mL）、白細胞介素 6（IL-6）（pg/mL）、N 端前 B 型利鈉肽（NT-proBNP）（pg/mL）、內皮抑素（ng/mL）、胰島素樣生長因子結合蛋白-3（IGFBP-3）（pg/mL）、生長相關癌基因 α（GroA）（pg/ mL）、D-二聚體（ng/mL）、血管性血友病因子（vWF）（%），血管粘附蛋白-1（VAP-1）（pg/ mL）、載脂蛋白 CIII（ApoCIII）（μg/ml）和 NCAM（pg/ mL）-在最初的研究中被用來區分卒中和類卒中以及缺血性卒中和顱內出血，并在本研究中進行了分析。
我們使用免疫分析法進行生物標記物分析。所有技術均由不知曉臨床診斷的技術人員遵照說明完成。所有樣品均一式兩份進行測試，變異系數<20%。通過對每個板的商品內對照（來自男性 AB 凝結全血的人血清，Sigma-Aldrich，cat#H6914）的重復測試以及板間濃度的比較來確定分析批間差異。數據進行對數轉換，除以每個板的內部控制值。對于分析，板間變異系數<20% 是可以接受的。由于大多數生物標志物（CVs 高達 30%）的板間差異較大，因此也通過使用 Z scores 的板對值進行標準化［平均值 2，標準偏差（SD）1］（附加信息顯示了根據從卒中發作開始采樣的時間，每個生物標志物水平的點狀圖）。
1.3 臨床評估
所有入組患者通過電話聯系，并使用基于之前驗證過的問卷并進一步專為本研究設計的結構化問卷進行訪談；該問卷由所有研究者審核通過。當患者本人不能聯系到，會詢問一名家庭成員或護理人員，如果家庭成員或護理人員也不能聯系上，會通過病例回顧收集數據。問卷包括與癲癇相關的變量（癲癇發作時間、癲癇復發、癲癇家族史、抗癲癇藥物治療）、功能狀態使用改良 rankin 量表（mRS）、日常活動 Barthel 量表、蒙特利爾認知評估（MoCA）和再梗死事件。問卷檢測到的所有癲癇發作隨后通過病例回顧進行確認，如果有任何疑問，也進行面對面的訪問。
Stroke-Chip 研究之前已經收集了與卒中發作相關的臨床和放射學變量。卒中相關變量包括卒中類型（缺血性或出血性）、根據 NIHSS 評估卒中嚴重程度、根據牛津社區卒中項目（CSP）分類的受影響腦動脈區域、基于歐洲合作急性卒中研究 III 標準的癥狀性出血性轉化 NIHSS 評分增加≥4 的（任何出血性轉化）和病因［在急性卒中治療（TOAST）分類中對 ORG 101 172 的試驗］。根據 ILAE 定義，卒中后癲癇的診斷是在卒中 7 天后發生了癇性發作。
1.4 統計分析
所有數據使用 IBM SPSS 統計軟件（22.0 版）和 R 軟件（3.4.4 版）進行描述性和頻率統計分析（美國伊利諾伊州芝加哥市 SPSS Inc.）。采用 Kaplan-Meier 生存曲線分析法分析隨訪期間遲發性癲癇發作頻率，對數秩檢驗確定各組之間的顯著性差異，Cox 回歸模型評估連續變量的差異。若患者在死亡之前沒有癲癇發作，則被排除。R 語言“fmsb”包制作的雷達圖顯示遲發性癲癇發作和無癲癇發作時每個生物標志物的均值。SurvivalROC 繪制時間依賴的受試者工作特性（ROC）曲線，計算基線 NIHSS 評分的分界值并找出 Cox 回歸模型中 P<0.25 的生物標志物，以證明它們對癲癇發展的預測具有最佳敏感性和特異性；用 Youden 指數最大值（敏感性+特異性-1）確定最佳分界值。對單變量分析中 P<0.1 的生物標記物進行多重 Cox 回歸模型，采用正向逐步方法來確定隨訪期間癲癇發生的獨立相關因素。一個模型只使用臨床變量，另一個模型使用生物標志物和臨床變量。結果以 95% 置信區間（CI）的風險比（HR）顯示。ROC 曲線評估模型的性能并確定其預測癲癇發生的能力。用綜合判別改進指數（IDI）和凈重分類改進指數（NRI）評價臨床數據模型中有意義的生物標志物的增量效應。在刪失生存數據后的預測模型中，使用 survIDINRI R 軟件獲得的 IDI 和 RDI 指數。以 P 值 <0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 人口統計學
在 Stroke-Chip 研究的 1 115 例患者中，有 895 例符合本研究的納入標準。排除的原因是既往有癲癇病史（n=22）、短暫性腦缺血發作（或 TIAn=101）、蛛網膜下腔出血（n=11）、硬膜下血腫（n=4）、動靜脈畸形（n=1）和數據不完整（n=12）（圖 1）。基線特征如表 1 所示。年齡的平均值±SD 為 72.0±13.1 歲，57.8% 的患者為男性。高血壓是樣本中最常見的血管危險因素（n=668，74.6%）。基線 NIHSS 評分中位數為 8（IQR 4～17），84% 的患者（n=752）發生過缺血性卒中。中位隨訪時間為 4.8 年（IQR 1.6～5.2）。總共有 41%（n=367）的患者在隨訪期間死亡。1 年死亡率為 21.5%，39.5%（n=145）的患者死于卒中或相關并發癥。
圖1
納入研究患者流程圖
表1
人口學和臨床特征
2.2 臨床特征與癲癇
51 例患者（5.7%）發展為癲癇，平均發病時間為 232 天（IQR 86～491）；其中 45 例（88.2%）為缺血性卒中組。最常見的癲癇發作類型是局灶性知覺性運動性癲癇發作（11 例，32.4%），其次是局灶性意識受損性運動性癲癇發作（9 例，26.5%）。表 1 顯示了卒中后癲癇患者和非癲癇患者之間的差異。癲癇患者的基線 NIHSS 評分更高（P<0.001），早發性癲癇發作更頻繁（P<0.001）。皮層卒中病灶與卒中后癲癇風險高度相關（9.3% vs.4.9%；P=0.004）。在缺血性卒中組，接受再灌注治療的患者有發展為卒中后癲癇的趨勢（7.3% vs. 4.7%；P=0.101）。
在多變量分析中，癲癇高風險的唯一獨立預測因子是 NIHSS 評分>8［危險比（HR）=4.013，95%CI（2.123，7.586），P<0.001］和早發性癲癇發作史［HR=4.038，95%CI（1.802，9.045），P<0.001］。
2.3 血液生物標志物與癲癇
與未發展為癲癇的患者相比，癲癇患者的 D-二聚體、內皮抑素和 FasL 水平較高，Hsc70 和 S100B 水平較低（圖 2）。預測癲癇發展的最佳分界點是 D-dimer 高于 1.939，內皮抑素高于 1.203，FasL 高于 1.868，S100B 低于 1.364，Hsc70 低于 2.496（表 2）。
圖2
生物標志物值的雷達圖
雷達圖顯示了每個生物標志物的平均 Z 分數。晚期癲癇發作的患者具有更高水平的內皮抑素，D-二聚體和 Fasl，以及較低的 Hsc70 和 S100B
表2
血液生物標志物的值和P <0. 25 的生物標志物的最佳分界值
在調整了顯著臨床變量的多元回歸模型中，癲癇的唯一獨立預測因子是內皮抑素水平>1.203 ［P=0.046，HR=4.300，95%CI（1.028，17.996）］，Hsc70 水平<2.496 ［P=0.006，HR=3.795，95%CI（1.476，9.760）］，以及 S100B 水平<1.364 ［P=0.001，HR=2.955，95%CI（1.534，5.491）］。
當這些生物標志物聯合在一起時，癲癇的風險增加到 17% 左右（圖 3）。當臨床變量與血液生物標志物聯合使用時［74.3%，95%CI（65.2%，83.3%）］，預測模型的 ROC 曲線下面積比單獨使用臨床變量時［68.9%，95%CI（60.3%，77.6%）］略高（圖 4）。
圖3
預測癲癇的血液生物標記物的組合（內皮抑素>1.203；S100B<1.364；Hsc70<2.496）
當存在任何一種生物標記物時，癲癇風險增加至 2.6%；當存在三種生物標記物中的任意兩種時，風險增加至 5.0%；當三種生物標記物均存在時，風險增加至 16.8%
圖4
癲癇預測模型的接受者操作特性（ROC）曲線
臨床變量和血液生物標記物（內皮抑素、S100B 和 Hsc70）同時存在時的回歸模型預測能力要高于臨床變量單獨存在時的預測能力
IDI 和 NRI 值分別為 0.090 ［95%CI（0.038，0.162），P<0.001］和 0.289 ［95%CI（0.118，0.499），P=0.007］，因此，對于僅用臨床變量構建的模型，納入生物標志物的模型更具有統計學意義。
3 討論
本研究首次探討了血液生物標志物在預測缺血性和出血性腦卒中后癲癇中的作用。我們調查了隨訪時間中位數為 5 年腦卒中患者的情況，以確定某些卒中后生物標志物是否可以預測該人群的癲癇發生。與文獻報道一致，卒中相關癲癇的患病率約為 6%，且多發生于 NIHSS 評分較高且有早期癇性發作史的患者。接受再灌注治療的患者，約 7% 發生卒中后癲癇，與早期研究相似（其發生率在 4% ～ 16.7% 之間）。我們研究發現皮層受累與卒中嚴重程度（NIHSS）密切相關，所以在多元回歸分析后沒有發現明確結果。值得注意的是，與之前報道高達 72% 的長期死亡率研究一致，本研究死亡率高達 41%；因此，我們研究的死亡率也可能隨時間延長而增高。
我們發現，S100B、Hsc70 水平降低和內皮抑素水平升高與長期罹患癲癇風險增加有關。本研究結果為我們前期的研究提供了有利的補充，卒中后早期癲癇發作與卒中急性期兩個生物標志物 TNF-R1 水平降低和 NCAM 水平升高存在關聯。
S100B 和 Hsc70 在發展為癲癇的患者中均下調。這些生物標志物屬于 DAMPs 蛋白家族，在卒中后神經炎癥階段被釋放。在出血轉化高危患者進行溶栓治療前就可以觀察到血清 S100B 水平升高。鑒于卒中嚴重程度和出血成分是公認的卒中后癲癇的危險因素，這些患者血清 S100B 升高是合理的。星形膠質細胞分泌的細胞因子 S100B 是由活化的星形膠質細胞釋放的，在膠質激活機制中起重要作用。源于實驗動物模型和人類癲癇的研究證實，小膠質細胞過度激活和相關促炎因子過度產生被認為是癲癇發生和癲癇發作后損傷的關鍵機制。
然而，我們發現 S100B 水平較低的腦卒中患者，具有較高的長期癲癇的風險。一些研究顯示，S100B 對于維持血腦屏障（BBB）功能完整性至關重要，該分子水平降低可能導致血腦屏障功能缺陷。另有作者報道腦損傷后 S100B 下降，血腦屏障受損，大腦暴露于白蛋白等血清蛋白中。白蛋白誘導炎癥反應和膠質細胞激活，包括上調白細胞介素 IL-1β，其可抑制 S100B 釋放。因此，S100B 早期的下調可能意味著早期血腦屏障破壞和腦損傷神經修復所需的小膠質細胞激活的潛在下調。
值得注意的是，血清 S100B 在卒中后不會立即升高，卒中后 8 h 開始上升，3 天后達到高峰。由于血樣是在卒中后前 6 h 內抽取的，因此我們無法研究 S100B 在前 72 h 內隨時間的變化情況。
Hsc70 蛋白屬于熱休克蛋白家族（Hsc ［組成型］和 Hsp ［誘導型］），在發展為癲癇的患者中也有所下降。Hsc70 在非應激條件下存在，參與蛋白質合成，在應激時被輕度誘導。相比之下，Hsp70 在應激時被高度誘導以促進細胞恢復。在正常和應激情況下，Hsc70 都對維持蛋白質穩態很重要；當 Hsp70 過表達時可以下調。鑒于 Hsc70 參與蛋白質穩態，較低水平將影響血腦屏障成份的合成，從而影響其功能。此外，我們研究發現的 Hsc70 下調也可以通過 Hsp70 過表達來解釋。
內皮抑素在長期罹患癲癇風險較高的患者中其水平較高。內皮抑素是血管生成的抑制劑，有助于誘導神經發生和細胞增殖。在腦損傷后觀察到短暫的血管生成反應；因此，內皮抑素的上調可能影響細胞修復。在嚴重腦外傷患者腦脊液中發現內皮抑素水平升高，但目前尚無急性腦卒中患者內皮抑素水平的確切數據。
有趣的是，當這些生物標志物聯合分析時，癲癇的風險上升到 17%，提高了三倍以上。S100B、Hsc70 和內皮抑素水平異常會使大腦的損傷難以修復。所有這些生物標志物可能與臨床預測因素發生相同的作用增加卒中后癲癇風險。在曲線下面積（AUC）結果中，血液生物標志物和臨床變量的組合具有比臨床變量更高的預測能力，NRI 和 IDI 的陽性結果支持上述結論。這些數據表明，生物標志物有助于識別卒中患者中發生卒中相關癲癇的人群。
關于該研究主題的文獻有限，每種生物標志物在癲癇發生發展中的作用尚不明確。在本研究中，所有血液樣本都是在腦卒中發病后 6 小時內采集的，我們不知道結果是否會因采集時間的不同而有差異。一方面，我們推測如果推遲抽取血樣的時間，生物標志物水平可能上調。另一方面，癲癇風險較高的患者可能存在基線水平下調和對腦損害反應受損。因此，與我們早發癲癇發作的研究結果相比，本研究結果可能反映了大腦對修復腦損傷的反應較差，而非急性神經炎癥反應。
此外，我們對缺血組進行分層分析獲得相似結果后，決定合并兩種類型的卒中。對于出血組，由于樣本太少，沒有發現有統計學意義的結果。然而，出血性卒中組觀察到的生物標志物與缺血組一致。由于此原因，我們認為將整個樣本用于本研究是合理的。
我們的研究存在幾個局限性，首先，隨訪期間死亡人數的增加可能會對遲發性癲癇患者的數量產生負面影響。此外，少數患者用腦電圖（EEG）來診斷，因此部分癲癇發作可能被誤診，尤其是無運動癥狀的癲癇。其次，我們的研究集中于影響患者生活質量的癲癇發作以及與更嚴重的癲癇發作相關的生物標志物。最后，采用探索性方法與多重測試未糾正相結合，不確定結論風險較高。因此，在得出任何明確的結論之前，必須重復我們的結果。
綜上，本研究發現，S100B、HsC70 的下調和內皮抑素的上調與卒中后癲癇的發生有關，檢測他們的變化可以為評估卒中后癲癇風險提供除臨床危險因素之外的信息。這些生物標志物的確切含義尚不確定，需要進一步的研究來驗證這些生物標志物，也需要獲取不同時間段的血液樣本，以更好地了解血液生物標志物的動態變化。這方面有必要進一步研究以闡明它們對致癇過程的影響，并有助于探索針對這些患者有價值的治療方法。
