紅藻氨酸（Kainic acid，KA）是一種有效的谷氨酸類似物，用于誘導嚙齒動物的神經退行性變和顳葉癲癇（TLE）。KA 可誘發嚴重的、持續的癲癇發作，即驚厥性癲癇持續狀態（convulsive Status epilepticus，cSE），沒有藥物干預的情況下通常是致命的。在過去 30 年里，使用 KA 來建立人類癲癇動物模型毫無疑問被證明是有價值的，但顯著的可變性和死亡率一直使結果變得不確定。這些問題很可能是 cSE 導致的，這是一種本質上可變且無法控制的全或無反應。然而，cSE 與人類疾病的相關性尚不確定，因為大多數癲癇患者從未經歷過這種情況。該研究試圖構建一種簡單的、基于 KA 的 TLE 動物模型，以避免 cSE 及其混淆因素。成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠分別接受皮下注射 KA（5 mg）和勞拉西泮（0.25 mg），劑量分別約為 15.0 mg/kg 和 0.75 mg/kg。持續的視頻腦電圖（VEEG）被用來監測急性癲癇的發作和檢測自發性癲癇發作。免疫細胞化學、Fluoro-Jade B 染色和 Timm 染色被用來描述急性和慢性神經病理學改變。急性局灶海馬癲癇發作在約 30 min 后開始并在幾小時后自行終止。廣泛的海馬神經變性在 4 d 之后發現。在所有動物中自發性的局灶海馬癲癇發作平均 12 d 之后開始。典型的海馬硬化和苔蘚纖維出芽的形成是長期神經病理學的特征。發病率和死亡率均為 0%。我們發現在聯合注射低劑量苯二氮卓類藥物時，KA 全身性給藥的作用可局限于海馬。這意味著勞拉西泮可以阻止痙攣性癲癇發作，而沒有真正阻止癲癇電活動。這個創新的、無 cSE 的動物模型，可靠地模擬了獲得性顳葉內側癲癇所定義的特征：海馬硬化和在長時間無癲癇發作后自發的海馬起源的癲癇發作，并不伴顯著的發病率、死亡率或無反應者。
引用本文： Kienzler-NorwoodF, CostardL, SadangiC, 李思思 譯, 熊維希 慕潔 審. 基于紅藻氨酸和勞拉西泮聯合給藥的新型人類獲得性顳葉癲癇動物模型. 癲癇雜志, 2019, 5(2): 140-147. doi: 10.7507/2096-0247.20190025 復制
要點
? 大鼠用紅藻氨酸和勞拉西泮聯合給藥可靠地構建了自發性海馬硬化的顳葉癲癇模型
? 在這個模型中，10～15 d 之后出現自發性海馬癲癇發作
? 勞拉西泮可以阻斷驚厥性癲癇持續狀態而不能阻斷癇樣放電
癲癇是一種慢性神經系統疾病，其特點是反復的、無誘因的癲癇發作，是最常見的神經系統疾病，約占世界人口的 1%（約 6 500 萬），每年新增 240 萬例。癲癇發作起源于顳葉的顳葉癲癇（TLE）是最常見的癲癇綜合征，通常被認為是由腦損傷引起的難治性癲癇。TLE 的特征是明顯的海馬萎縮和有限的海馬外損傷，以及源自海馬和/或臨近區域的癲癇發作。
紅藻氨酸（Kainic acid，KA）是一種用于誘發急性癲癇發作和神經退行性疾病的谷氨酸類似物，并在動物身上模擬人類的 TLE 發作的模型，最常用于嚙齒類動物。KA 首先是從熱帶和亞熱帶水域發現的紅藻（Digenea simplex）中分離出來的，它通過激活 KA 受體（一種親離子型谷氨酸受體），以及通過部分激活 AMPA 受體來誘發癲癇。最初的 KA 致癇模型是由 Ben-Ari 及其同事構建的。最初的研究中發現，杏仁核內注射 KA 會導致癲癇樣行為及背側海馬神經退行性病變，這主要發生在 CA3 區域。從那以后，一些基于 KA 的癲癇模型被構建出來（表 1），這些模型的關鍵是誘導一段嚴重的、長時間的癲癇發作，即驚厥性癲癇持續狀態（convulsive Status epilepticus，cSE），這在沒有藥物干預的情況下通常是致命的。已經制定了各種各樣的實驗方案，目的是在不預防 cSE 和隨后的癲癇發作的情況下降低變異性和死亡率，例如低劑量重復給藥，這在某種程度上是成功的（表 1）。
表1
常見的紅藻氨酸（KA）癲癇模型
盡管基于 KA 癲癇模型具有重要價值，其已經明確地為我們對癲癇的理解做出了很大的貢獻，但其仍存在巨大缺陷：高死亡率（高至 50%）、多變的神經病理學、自發性癲癇不穩定的潛伏期（在接受相同治療的年齡匹配的動物中第一次癲癇發作可能相隔數周）和無反應者（多達 50% 的幸存的動物從來沒有表現出自發性癲癇發作）。我們從另一角度來解決這個問題，而非嘗試逐步增加 cSE 的可靠性或存活率。我們的目標是構建一種基于 KA 的簡單可靠的動物模型，對人類疾病高度有效模擬，同時避免 cSE 及其并發癥。在此，我們闡述了一種全新方法，即給成年 Sprague-Dawley 大鼠單次注射 KA，并聯合單劑注射低劑量勞拉西泮（一種苯二氮卓類藥物，為 cSE 的一線用藥）。
1 方法
1.1 實驗動物
雄性 Sprague-Dawley 大鼠（Harlan-Winkelmann，Borchen，德國），體重約 330 g（范圍為 318～344 g），按照歐洲委員會的指導方針（EUVD 86/609/EEC）進行處理。所有的實驗都得到了當地監管機構批準（Regierungsprasidium Gie?en）。大鼠被安置在一個現場的動物設施中（21～25℃；31%～47% 濕度）在 12∶12 的光/暗循環下，有充足的食物與水供給。
1.2 紅藻氨酸+勞拉西泮用藥
在異氟醚鎮靜后，單次皮下注射 5 mg（相當于 14 5～15.7 mg/kg，取決于動物體重）KA?水化物（K0250，10 mg/mL 溶于磷酸鹽緩沖鹽水中；Sigma，德國）和 0.25～1.5 mg（約 0.75～4.5 mg/kg）勞拉西泮（2 mg/mL；輝瑞，德國）。大鼠被放置在一個含有 5% 異氟醚的丙烯酸盒子里，直到鎮靜狀態（15～30 s），然后將其取出并放置在一干凈的桌子上進行注射。如果植入電極和/或腦電圖（EEG）發射器（見下文），至少在 4 d 的恢復期后進行注射。在注射后，大鼠被安置在透明的丙烯酸盒子里可供其自由移動和觀察。
1.3 癲癇監測（持續的視頻腦電圖）
EEG 數據通過 ① 安裝在齒狀回（大約 2 mm 側，接近前囟尾部約 3 mm，距大腦表面約 3.5 mm）的記錄電極或 ② 大腦表面的螺釘。電極和地腳螺絲與在動物的側面皮下移植的微型無線發射器相連（FT20；美國國際數據科學公司），以記錄點尾部及內側的螺釘位置作為參電極，而非背側海馬。所有的手術都是在異氟醚麻醉下利用立體定位儀（David Kopf）進行的（氧氣中含 3%～5% 的異氟醚）。如前所述，利用 LabChart 7 軟件（AD 儀器，新西蘭）持續記錄（24/7）自發的電活動，并每 3 h 以數字方式自動存儲。所有的文件都至少被兩名經驗豐富的評審檢查；至少有一名評審對所作的處理是不知情的。目測分析電極記錄，并分析了振幅明顯大于基線的所有事件。同時使用 Edimax-7110w 紅外攝像機（臺灣）進行視頻監控。視頻文件以 15 幀/s 記錄，并使用 SecuritySpy 監視軟件（Ben Software，英國）整合 VEEG 的數據并以數字儲存。癲癇發作情況根據 Racine 量表進行評分。
1.4 灌注固定
大鼠注射過量氯胺酮（>100 mg/kg，腹腔注射）和甲苯噻嗪（10 mg/kg，腹腔注射），然后經主動脈注射 0.9% 的生理鹽水 90 s，以去除血管內的血液。之后用 0.1 M PBS 溶解的 4% 多聚甲醛進行主動脈灌注。大腦立即從顱骨內取出放入 4% 多聚甲醛溶液浸泡至少 48 h 再用冷凍切片機切片（30 um）。
1.5 熒光和光學顯微鏡
如前所述，通過 Nissl 染色、Fluoro-Jade B 染色、Timm 染色和神經元核抗原（NeuN）免疫細胞組化手段分析上述切片。用配備了 DCF360FX 相機（徠卡，德國）的 DMI6000B 顯微鏡拍照。這些數據經 Photoshop CS6 軟件（Adobe，美國）優化對比度和亮度，但并未改變圖像的內容。
1.6 量化神經退行性病變
利用 Adobe Photoshop CS6 中的 Count Tool 計數，來自背側海馬相應的 Fluoro-Jade B 染色區域（一只動物 1 個切片）中 Fluoro-Jade B 陽性的神經細胞數目。
1.7 海馬區量化
如前所述，計算背側海馬 5 個匹配且不相鄰的 NeuN 免疫染色或 Nissl-染色區域，不規則邊界的區域使用 Adobe Photoshop CS6 Extended Measurement 功能測量計算。獲取整個海馬（不包括海馬傘）、齒狀回和海馬角的值。用 Student’s t 檢驗進行組間比較。
1.8 Timm 染色量化苔蘚纖維出芽
5 個均勻分布在海馬區背部 Timm 染色的切片，使用 Adobe Photoshop CS6 直方圖功能進行評估計算出選定區域的平均灰度值。彩色圖像被轉換成灰度值并反轉，記錄并計算分子間層的 64 個像素點的平均灰度值。將分子間層的值減去由輻射層的無細胞區計算出來的背景值。用 Student’s t 檢驗進行組間比較。
2 結果
2.1 小劑量勞拉西泮促進海馬神經退化
評估使用不同劑量的勞拉西泮（0.25～1.5 mg/只動物；約 0.75～4.5 mg/kg），同時保持 KA 劑量不變（5 mg/動物；相當于 14.5～15.7 mg/kg，取決于體重）（每組 n≥4，總共 n=33）。勞拉西泮的使用劑量遠低于在通常用于在嚙齒動物身上終止實驗性癲癇持續狀態的劑量（6～8 mg/kg）。雖然 1 mg/只（n=8）和 1.5 mg/只（n=5）的勞拉西泮的用量下 KA 可以誘發急性海馬癲癇發作，但未檢測到神經退行性病變的跡象和之后的自發性癲癇。接受較少劑量勞拉西泮的動物可觀察到更嚴重的神經退行性病變，反之亦然（圖 1）。通過全身給藥時減少勞拉西泮的劑量，我們發現最佳劑量為 0.25 mg/只（約 0.75 mg/kg）。KA 5 mg 和勞拉西泮 0.25 mg （n=8）給藥 4 d 后處死實驗動物，在海馬區背部檢測到平均值為 565.4（標準差 43.7）的 Fluoro-Jade B 陽性神經元數目，相比之下，給藥 KA 5 mg 和勞拉西泮 1.0 mg（n=8）的動物中其平均值為 0（標準差 0）的。進一步觀察海馬分區，CA1 平均值為 （255.4±31.7），CA3 為（273.0 ±29.1），門區為（37±7.7）。通過在 KA 和勞拉西泮給藥后 24 h 的連續 VEEG 監測，任何組別無一動物發生驚厥發作以及 cSE（n=33）。任何動物在任何時候都沒有表現出其他疾病跡象；存活率為百分之百。
圖1
全身同時注射 KA 5 mg 和勞拉西泮 1 mg 或 1/4 mg 的急性和慢性海馬體神經病理學變化（比例尺：200 μm）
a. Fluoro-Jade B（FJB）染色；b. NeuN 免疫活性；c. 從未經治療的控制鼠的背側海馬中進行的 Timm 染色，顯示正常的神經解剖學；d. FJB 染色 4 d 后治療（勞拉西泮 1 mg），顯示沒有明顯的神經退行性病變；e. NeuN-免疫染色 10 周后治療（勞拉西泮 1 mg），顯示明顯正常的神經解剖學；f. Timm 染色 10 周后治療（勞拉西泮 1 mg），證實正常的顆粒細胞傳出，即缺乏苔蘚纖維出芽的形成；g. FJB 染色 4 d 治療（勞拉西泮 1/4 mg），顯示齒狀回門區、CA3 和 CA1 的廣泛神經退化；h. 在 10 周的治療后（勞拉西泮 1/4 mg），齒狀回門區、CA3 和 CA1 中顯示大量的神經元丟失，也就是典型的海馬硬化 i. Timm 染色 10 周后的治療（勞拉西泮 1/4 mg），顯示顆粒細胞軸突的異常重組，即局部異常神經環路的形成
2.2 低劑量的勞拉西泮可阻斷紅藻氨酸誘導的驚厥發作，但并未抑制海馬癲癇電活動
皮下聯合注射 KA 5 mg 和勞拉西泮 0.25 mg （n = 8）后數分鐘內位于齒狀回背側的電極檢測到異常的腦電活動，30～40 min 后記錄到首次海馬起源的癲癇發作。在所有動物中海馬顆粒細胞的癲癇樣放電持續至少 3 h，平均為（3.3±0.4）h。在給藥過程中，在部分而非全部大鼠中癲癇行為僅限于偶爾像濕狗一樣抖動。由于癲癇發作是自動終止的，因此沒有使用額外的勞拉西泮。在給藥 3 d 后，動物表現正常。沒有出現例如≥10% 的體重下降，跳動，或活動性減低等患病跡象。因此，不需要姑息治療。接受 KA 5 mg 和勞拉西泮 1.0 mg 的動物海馬癲癇發作的平均時間為（12±7）min（n = 5）。
2.3 不連續的潛伏期后出現自發海馬體癲癇發作
連續的 VEEG 監測顯示，在服用 KA 5 mg 和勞拉西泮 0.25 mg n = 5）后的平均 12.1 d，出現第一次非驚厥性自發的癲癇發作（圖 2a）。在所有動物中都出現自發癲癇發作，通常持續 45～60 s（圖 3a），出現頻率約為每只動物每天發生 7.8 次（圖 2b）。72% 的癲癇發作發生在白天（6 點～17 點 59 分）（圖 2c）。從齒狀回獲得的顱內記錄顯示海馬參與，例如，顆粒細胞的癲癇樣放電（圖 3b）。相應的，視頻文件未顯示明顯的驚厥行為，而只是發抖/發呆。隨后的自發性癲癇（≥給藥后 3 周）行為表現還包括，咀嚼和前爪陣攣，在 Racine 評價表上對應 3～5 級 ［參見原文鏈接 S1 和 S2（視頻）］。KA 5 mg 和勞拉西泮 1.0 mg（n = 4，4 周連續的 VEEG 監測）給藥大鼠均未發現自發癲癇。
圖2
全身同時進行 KA 5 mg 和勞拉西泮 1/4 mg 聯合用藥后的自發性癲癇發作的特征
a. 從治療到第一次自發發作的延遲，這是由連續的 VEEG 記錄在背齒狀回的電極上進行的，癲癇平均時間為（12.1±1.7）d；b. 自發性癲癇發作的頻率。在自發性癲癇發作的前兩周內，動物平均每天發作（7.8±5.1）次；c. 白天（6:00～17:59）和夜間（18:00～5:59）的癲癇發作，大多數的癲癇發作（72%）發生在白天；d. 在治療后的頭 2 周內發生的所有自發性癲癇都是非驚厥類的。從第 3 周開始，見驚厥性發作數據以平均掃描電子顯微鏡的形式呈現；b 階段是根據 Racine 尺度，n’s=5
圖3
KA 誘發和自發的海馬癲癇樣放電，從齒狀回中記錄到自由活動的 Sprague-Dawley 大鼠
a. 58 s 的活動，記錄了 KA 和勞拉西泮（分別為 5 mg 和 1/4 mg）注射后的 44 min；b. 從 a 圖提取的 800 ms 的 EEG，表現出癲癇樣的海馬狀顆粒細胞的放電；c. 大鼠第一次自發（集中）發作 10 d 后 KA（5 mg）和勞拉西泮（1/4 mg）；d. 從 c 圖提取的 800 ms 的 EEG，顯示海馬狀顆粒細胞的癲癇放電。在自發性發作期間的行為僅表現為凝視；在 EEG 信號返回到基線后，人們看到了一些輕微的震動。校準：所有圖均為 2 mV；圖 a 和 c 為 4 s，圖 b 和 d 為 55 msec；采樣率 2 kHz
2.4 神經病理學類似（難治性）中央顳葉癲癇與海馬硬化
該模型中的海馬神經病理學與顳葉內側癲癇中藥物難治的癲癇［國際抗癲癇聯盟（ILAE）類型 I］相似。事實上，ILAE I 型是最常見的 TLE 病理類型。值得注意的是 KA 5 mg 和勞拉西泮 0.25 mg 給藥后，CA3 和 CA1 區域的錐體神經元幾乎死亡，以及大量的齒狀門神經元（圖 1b）。遠期組織學（≥2 個月）分析顯示顳葉內側癲癇標志，如經典的海馬硬化（圖 1d、圖 4a）和苔蘚纖維出芽的形成（圖 1f、圖 4 b）。與對照組相比，在海馬整體萎縮［（–40.0±9.6）% mm2］，特別是海馬體的部分［（74.3±7.6）% mm2］，而在 3/4 的樣本中齒狀回擴大了至少 34%（n’s=4，P 值均≤0.01）。盡管顆粒細胞層的厚度相較于對照組持續增大 124.7%±25.0%，這是一種被稱為“顆粒分散”的現象，但這種膨脹似乎并沒有推動分子層整體的擴張（圖 1d）。
圖4
KA 5 mg 和勞拉西泮 1 mg（紅）或 1/4 mg（綠）注射 10 周后海馬形態變化與年齡匹配的對照大鼠（藍）的比較
a. 海馬區，也被分為 DG 和 CA 子區，相對于控制，從方法部分中描述的 NeuN-免疫染色或 Nissl-染色部分獲得，1/4 mg 組的 3/4 的海馬體顯示了 DG 肥大；b. 方法一節中所描述的，在 Timm 染色的大腦部分中從 IML 中獲得的灰色值，更大的數字表示更暗的灰色值，即在 IML 有更多的苔蘚纖維出芽的形成，DG，齒狀回；CA，海馬角；IML，內分子層；誤差線±SEM；Student’s t 檢驗；每一組的 4 個大腦取
3 討論
本研究結果表明，單劑量 KA 與低劑量勞拉西泮聯合注射用藥可靠地在大鼠上模擬了人類獲得性 TLE 的基本特征，同時避免 cSE 及其相關問題，例如顯著的差異性和死亡率。實驗步驟簡單。動物接受單次皮下注射 KA 和勞拉西泮，無需額外的治療或照顧，這點與通常需要多次注射和/或大量姑息治療的基于 cSE 的模型不同。多次注射是為了最大化 cSE 發作的動物數量，大量姑息治療是為了降低死亡率。目前結果表明，動物模型的關鍵不應該是誘導 cSE，而應該是延長 EEG 上的癲癇活動，因為癲癇發作并不總是伴隨著明顯的行為癥狀。事實上，人類癲癇持續狀態通常是非驚厥狀態。沿著這些思路，在實驗室和臨床中終止癲癇持續狀態需要充分的治療和 EEG 確認癲癇已經停止。我們在這里展示了“不足”劑量的勞拉西泮可以阻斷 cSE，但不能阻斷急性海馬癇性發作、神經退行性病變或癲癇發生。
Williams 等提出了重復低劑量 KA 模型并對該模型進行詳細的描述，雖然該模型無疑是有力可靠的，但本文提出的模型有一些明顯的優點—首先是簡單。反復給藥需要持續數小時的觀察，每只動物都需要個體化的治療，必須非常小心確保不會給藥過量。因為我們的方法是基于對所有動物都有效的 KA 單次給藥，所以不需要額外的關注，也沒有必要為每只動物計算滴定劑量。這種易用性，加上沒有顯著的個體差異，能促進在實驗性癲癇研究中這一動物模型的應用。
第二個優點是不會發生 cSE，這實際上是低劑量模型的關鍵。從本質上講就是反復 KA 給藥直到誘導 cSE 產生并持續 3 h。經受住 cSE 存活下來的動物經常在給藥后需要十分細致的照顧。幾天的恢復期是很常見的，在此期間，動物可能無法正常進食或飲水。目前的模型避免了 cSE 及其帶來的副作用，例如，發病率和死亡率，但也可以誘導海馬癲癇發作持續 3～4 h。推測因避免了 cSE，動物不需要任何姑息治療。
第一次之后的自發性癲癇均表現為痙攣性發作，可能暗示神經網絡的重構，例如，苔蘚纖維出芽的形成需要數周或數月才能完成。這樣的重組通過早期隱蔽的癲癇活動提供一種異常的途徑來退出海馬體并傳播到大腦的其他區域。這也許可以解釋盡管所有的癲癇發作都涉及到顆粒細胞的異常放電，但后來的癲癇發作才被普遍化。
最后，迫切需要實施新的癲癇模型，以揭示新的和不同的干預靶點和開發基于這些新治療方法。盡管在治療癲癇方面新型的 AEDs 具有優勢，如較小副作用或過敏反應，但在過去的 25 年里，它們的療效和耐受性并沒有明顯改善。因此，藥物治療對 30% 的癲癇患者沒有令人滿意的療效，這一數字在此期間也沒有改善。這個問題持續存在的原因之一是，除了極少數的例外，基于同一動物模型的所有藥物都已經被發現。因此，我們建議在藥物篩選中加入新的動物模型，以努力發現靶向新的誘發癲癇機制的物質。本模型特別可用于難治性 TLE 的藥物研發。雖然該模型中顯著的海馬硬化只在少數的 TLE 患者中可見，但這種損傷模式與藥物難治性癲癇密切相關。
綜上所述，本研究結果表明，單次聯合注射 KA 與低劑量勞拉西泮可靠地在大鼠上模擬人類獲得性顳葉癲癇的基本特征，同時避免 cSE 及其固有的問題。“KaL 模型”的主要特征是：治療方案簡單，自行終止的持續 3～4 h 的急性海馬癲癇發作，大量海馬神經退行性變，在 10～15 d 無癲癇期后的自發性海馬起源癲癇，發病率和死亡率不高。由于該模型的可靠性和易用性，有望在癲癇發生（癲癇的發展）和癲癇發作（個體、自發癲癇的表現）的機制研究以及針對難治性癲癇的藥物發現方面發揮作用。
要點
? 大鼠用紅藻氨酸和勞拉西泮聯合給藥可靠地構建了自發性海馬硬化的顳葉癲癇模型
? 在這個模型中，10～15 d 之后出現自發性海馬癲癇發作
? 勞拉西泮可以阻斷驚厥性癲癇持續狀態而不能阻斷癇樣放電
癲癇是一種慢性神經系統疾病，其特點是反復的、無誘因的癲癇發作，是最常見的神經系統疾病，約占世界人口的 1%（約 6 500 萬），每年新增 240 萬例。癲癇發作起源于顳葉的顳葉癲癇（TLE）是最常見的癲癇綜合征，通常被認為是由腦損傷引起的難治性癲癇。TLE 的特征是明顯的海馬萎縮和有限的海馬外損傷，以及源自海馬和/或臨近區域的癲癇發作。
紅藻氨酸（Kainic acid，KA）是一種用于誘發急性癲癇發作和神經退行性疾病的谷氨酸類似物，并在動物身上模擬人類的 TLE 發作的模型，最常用于嚙齒類動物。KA 首先是從熱帶和亞熱帶水域發現的紅藻（Digenea simplex）中分離出來的，它通過激活 KA 受體（一種親離子型谷氨酸受體），以及通過部分激活 AMPA 受體來誘發癲癇。最初的 KA 致癇模型是由 Ben-Ari 及其同事構建的。最初的研究中發現，杏仁核內注射 KA 會導致癲癇樣行為及背側海馬神經退行性病變，這主要發生在 CA3 區域。從那以后，一些基于 KA 的癲癇模型被構建出來（表 1），這些模型的關鍵是誘導一段嚴重的、長時間的癲癇發作，即驚厥性癲癇持續狀態（convulsive Status epilepticus，cSE），這在沒有藥物干預的情況下通常是致命的。已經制定了各種各樣的實驗方案，目的是在不預防 cSE 和隨后的癲癇發作的情況下降低變異性和死亡率，例如低劑量重復給藥，這在某種程度上是成功的（表 1）。
表1
常見的紅藻氨酸（KA）癲癇模型
盡管基于 KA 癲癇模型具有重要價值，其已經明確地為我們對癲癇的理解做出了很大的貢獻，但其仍存在巨大缺陷：高死亡率（高至 50%）、多變的神經病理學、自發性癲癇不穩定的潛伏期（在接受相同治療的年齡匹配的動物中第一次癲癇發作可能相隔數周）和無反應者（多達 50% 的幸存的動物從來沒有表現出自發性癲癇發作）。我們從另一角度來解決這個問題，而非嘗試逐步增加 cSE 的可靠性或存活率。我們的目標是構建一種基于 KA 的簡單可靠的動物模型，對人類疾病高度有效模擬，同時避免 cSE 及其并發癥。在此，我們闡述了一種全新方法，即給成年 Sprague-Dawley 大鼠單次注射 KA，并聯合單劑注射低劑量勞拉西泮（一種苯二氮卓類藥物，為 cSE 的一線用藥）。
1 方法
1.1 實驗動物
雄性 Sprague-Dawley 大鼠（Harlan-Winkelmann，Borchen，德國），體重約 330 g（范圍為 318～344 g），按照歐洲委員會的指導方針（EUVD 86/609/EEC）進行處理。所有的實驗都得到了當地監管機構批準（Regierungsprasidium Gie?en）。大鼠被安置在一個現場的動物設施中（21～25℃；31%～47% 濕度）在 12∶12 的光/暗循環下，有充足的食物與水供給。
1.2 紅藻氨酸+勞拉西泮用藥
在異氟醚鎮靜后，單次皮下注射 5 mg（相當于 14 5～15.7 mg/kg，取決于動物體重）KA?水化物（K0250，10 mg/mL 溶于磷酸鹽緩沖鹽水中；Sigma，德國）和 0.25～1.5 mg（約 0.75～4.5 mg/kg）勞拉西泮（2 mg/mL；輝瑞，德國）。大鼠被放置在一個含有 5% 異氟醚的丙烯酸盒子里，直到鎮靜狀態（15～30 s），然后將其取出并放置在一干凈的桌子上進行注射。如果植入電極和/或腦電圖（EEG）發射器（見下文），至少在 4 d 的恢復期后進行注射。在注射后，大鼠被安置在透明的丙烯酸盒子里可供其自由移動和觀察。
1.3 癲癇監測（持續的視頻腦電圖）
EEG 數據通過 ① 安裝在齒狀回（大約 2 mm 側，接近前囟尾部約 3 mm，距大腦表面約 3.5 mm）的記錄電極或 ② 大腦表面的螺釘。電極和地腳螺絲與在動物的側面皮下移植的微型無線發射器相連（FT20；美國國際數據科學公司），以記錄點尾部及內側的螺釘位置作為參電極，而非背側海馬。所有的手術都是在異氟醚麻醉下利用立體定位儀（David Kopf）進行的（氧氣中含 3%～5% 的異氟醚）。如前所述，利用 LabChart 7 軟件（AD 儀器，新西蘭）持續記錄（24/7）自發的電活動，并每 3 h 以數字方式自動存儲。所有的文件都至少被兩名經驗豐富的評審檢查；至少有一名評審對所作的處理是不知情的。目測分析電極記錄，并分析了振幅明顯大于基線的所有事件。同時使用 Edimax-7110w 紅外攝像機（臺灣）進行視頻監控。視頻文件以 15 幀/s 記錄，并使用 SecuritySpy 監視軟件（Ben Software，英國）整合 VEEG 的數據并以數字儲存。癲癇發作情況根據 Racine 量表進行評分。
1.4 灌注固定
大鼠注射過量氯胺酮（>100 mg/kg，腹腔注射）和甲苯噻嗪（10 mg/kg，腹腔注射），然后經主動脈注射 0.9% 的生理鹽水 90 s，以去除血管內的血液。之后用 0.1 M PBS 溶解的 4% 多聚甲醛進行主動脈灌注。大腦立即從顱骨內取出放入 4% 多聚甲醛溶液浸泡至少 48 h 再用冷凍切片機切片（30 um）。
1.5 熒光和光學顯微鏡
如前所述，通過 Nissl 染色、Fluoro-Jade B 染色、Timm 染色和神經元核抗原（NeuN）免疫細胞組化手段分析上述切片。用配備了 DCF360FX 相機（徠卡，德國）的 DMI6000B 顯微鏡拍照。這些數據經 Photoshop CS6 軟件（Adobe，美國）優化對比度和亮度，但并未改變圖像的內容。
1.6 量化神經退行性病變
利用 Adobe Photoshop CS6 中的 Count Tool 計數，來自背側海馬相應的 Fluoro-Jade B 染色區域（一只動物 1 個切片）中 Fluoro-Jade B 陽性的神經細胞數目。
1.7 海馬區量化
如前所述，計算背側海馬 5 個匹配且不相鄰的 NeuN 免疫染色或 Nissl-染色區域，不規則邊界的區域使用 Adobe Photoshop CS6 Extended Measurement 功能測量計算。獲取整個海馬（不包括海馬傘）、齒狀回和海馬角的值。用 Student’s t 檢驗進行組間比較。
1.8 Timm 染色量化苔蘚纖維出芽
5 個均勻分布在海馬區背部 Timm 染色的切片，使用 Adobe Photoshop CS6 直方圖功能進行評估計算出選定區域的平均灰度值。彩色圖像被轉換成灰度值并反轉，記錄并計算分子間層的 64 個像素點的平均灰度值。將分子間層的值減去由輻射層的無細胞區計算出來的背景值。用 Student’s t 檢驗進行組間比較。
2 結果
2.1 小劑量勞拉西泮促進海馬神經退化
評估使用不同劑量的勞拉西泮（0.25～1.5 mg/只動物；約 0.75～4.5 mg/kg），同時保持 KA 劑量不變（5 mg/動物；相當于 14.5～15.7 mg/kg，取決于體重）（每組 n≥4，總共 n=33）。勞拉西泮的使用劑量遠低于在通常用于在嚙齒動物身上終止實驗性癲癇持續狀態的劑量（6～8 mg/kg）。雖然 1 mg/只（n=8）和 1.5 mg/只（n=5）的勞拉西泮的用量下 KA 可以誘發急性海馬癲癇發作，但未檢測到神經退行性病變的跡象和之后的自發性癲癇。接受較少劑量勞拉西泮的動物可觀察到更嚴重的神經退行性病變，反之亦然（圖 1）。通過全身給藥時減少勞拉西泮的劑量，我們發現最佳劑量為 0.25 mg/只（約 0.75 mg/kg）。KA 5 mg 和勞拉西泮 0.25 mg （n=8）給藥 4 d 后處死實驗動物，在海馬區背部檢測到平均值為 565.4（標準差 43.7）的 Fluoro-Jade B 陽性神經元數目，相比之下，給藥 KA 5 mg 和勞拉西泮 1.0 mg（n=8）的動物中其平均值為 0（標準差 0）的。進一步觀察海馬分區，CA1 平均值為 （255.4±31.7），CA3 為（273.0 ±29.1），門區為（37±7.7）。通過在 KA 和勞拉西泮給藥后 24 h 的連續 VEEG 監測，任何組別無一動物發生驚厥發作以及 cSE（n=33）。任何動物在任何時候都沒有表現出其他疾病跡象；存活率為百分之百。
圖1
全身同時注射 KA 5 mg 和勞拉西泮 1 mg 或 1/4 mg 的急性和慢性海馬體神經病理學變化（比例尺：200 μm）
a. Fluoro-Jade B（FJB）染色；b. NeuN 免疫活性；c. 從未經治療的控制鼠的背側海馬中進行的 Timm 染色，顯示正常的神經解剖學；d. FJB 染色 4 d 后治療（勞拉西泮 1 mg），顯示沒有明顯的神經退行性病變；e. NeuN-免疫染色 10 周后治療（勞拉西泮 1 mg），顯示明顯正常的神經解剖學；f. Timm 染色 10 周后治療（勞拉西泮 1 mg），證實正常的顆粒細胞傳出，即缺乏苔蘚纖維出芽的形成；g. FJB 染色 4 d 治療（勞拉西泮 1/4 mg），顯示齒狀回門區、CA3 和 CA1 的廣泛神經退化；h. 在 10 周的治療后（勞拉西泮 1/4 mg），齒狀回門區、CA3 和 CA1 中顯示大量的神經元丟失，也就是典型的海馬硬化 i. Timm 染色 10 周后的治療（勞拉西泮 1/4 mg），顯示顆粒細胞軸突的異常重組，即局部異常神經環路的形成
2.2 低劑量的勞拉西泮可阻斷紅藻氨酸誘導的驚厥發作，但并未抑制海馬癲癇電活動
皮下聯合注射 KA 5 mg 和勞拉西泮 0.25 mg （n = 8）后數分鐘內位于齒狀回背側的電極檢測到異常的腦電活動，30～40 min 后記錄到首次海馬起源的癲癇發作。在所有動物中海馬顆粒細胞的癲癇樣放電持續至少 3 h，平均為（3.3±0.4）h。在給藥過程中，在部分而非全部大鼠中癲癇行為僅限于偶爾像濕狗一樣抖動。由于癲癇發作是自動終止的，因此沒有使用額外的勞拉西泮。在給藥 3 d 后，動物表現正常。沒有出現例如≥10% 的體重下降，跳動，或活動性減低等患病跡象。因此，不需要姑息治療。接受 KA 5 mg 和勞拉西泮 1.0 mg 的動物海馬癲癇發作的平均時間為（12±7）min（n = 5）。
2.3 不連續的潛伏期后出現自發海馬體癲癇發作
連續的 VEEG 監測顯示，在服用 KA 5 mg 和勞拉西泮 0.25 mg n = 5）后的平均 12.1 d，出現第一次非驚厥性自發的癲癇發作（圖 2a）。在所有動物中都出現自發癲癇發作，通常持續 45～60 s（圖 3a），出現頻率約為每只動物每天發生 7.8 次（圖 2b）。72% 的癲癇發作發生在白天（6 點～17 點 59 分）（圖 2c）。從齒狀回獲得的顱內記錄顯示海馬參與，例如，顆粒細胞的癲癇樣放電（圖 3b）。相應的，視頻文件未顯示明顯的驚厥行為，而只是發抖/發呆。隨后的自發性癲癇（≥給藥后 3 周）行為表現還包括，咀嚼和前爪陣攣，在 Racine 評價表上對應 3～5 級 ［參見原文鏈接 S1 和 S2（視頻）］。KA 5 mg 和勞拉西泮 1.0 mg（n = 4，4 周連續的 VEEG 監測）給藥大鼠均未發現自發癲癇。
圖2
全身同時進行 KA 5 mg 和勞拉西泮 1/4 mg 聯合用藥后的自發性癲癇發作的特征
a. 從治療到第一次自發發作的延遲，這是由連續的 VEEG 記錄在背齒狀回的電極上進行的，癲癇平均時間為（12.1±1.7）d；b. 自發性癲癇發作的頻率。在自發性癲癇發作的前兩周內，動物平均每天發作（7.8±5.1）次；c. 白天（6:00～17:59）和夜間（18:00～5:59）的癲癇發作，大多數的癲癇發作（72%）發生在白天；d. 在治療后的頭 2 周內發生的所有自發性癲癇都是非驚厥類的。從第 3 周開始，見驚厥性發作數據以平均掃描電子顯微鏡的形式呈現；b 階段是根據 Racine 尺度，n’s=5
圖3
KA 誘發和自發的海馬癲癇樣放電，從齒狀回中記錄到自由活動的 Sprague-Dawley 大鼠
a. 58 s 的活動，記錄了 KA 和勞拉西泮（分別為 5 mg 和 1/4 mg）注射后的 44 min；b. 從 a 圖提取的 800 ms 的 EEG，表現出癲癇樣的海馬狀顆粒細胞的放電；c. 大鼠第一次自發（集中）發作 10 d 后 KA（5 mg）和勞拉西泮（1/4 mg）；d. 從 c 圖提取的 800 ms 的 EEG，顯示海馬狀顆粒細胞的癲癇放電。在自發性發作期間的行為僅表現為凝視；在 EEG 信號返回到基線后，人們看到了一些輕微的震動。校準：所有圖均為 2 mV；圖 a 和 c 為 4 s，圖 b 和 d 為 55 msec；采樣率 2 kHz
2.4 神經病理學類似（難治性）中央顳葉癲癇與海馬硬化
該模型中的海馬神經病理學與顳葉內側癲癇中藥物難治的癲癇［國際抗癲癇聯盟（ILAE）類型 I］相似。事實上，ILAE I 型是最常見的 TLE 病理類型。值得注意的是 KA 5 mg 和勞拉西泮 0.25 mg 給藥后，CA3 和 CA1 區域的錐體神經元幾乎死亡，以及大量的齒狀門神經元（圖 1b）。遠期組織學（≥2 個月）分析顯示顳葉內側癲癇標志，如經典的海馬硬化（圖 1d、圖 4a）和苔蘚纖維出芽的形成（圖 1f、圖 4 b）。與對照組相比，在海馬整體萎縮［（–40.0±9.6）% mm2］，特別是海馬體的部分［（74.3±7.6）% mm2］，而在 3/4 的樣本中齒狀回擴大了至少 34%（n’s=4，P 值均≤0.01）。盡管顆粒細胞層的厚度相較于對照組持續增大 124.7%±25.0%，這是一種被稱為“顆粒分散”的現象，但這種膨脹似乎并沒有推動分子層整體的擴張（圖 1d）。
圖4
KA 5 mg 和勞拉西泮 1 mg（紅）或 1/4 mg（綠）注射 10 周后海馬形態變化與年齡匹配的對照大鼠（藍）的比較
a. 海馬區，也被分為 DG 和 CA 子區，相對于控制，從方法部分中描述的 NeuN-免疫染色或 Nissl-染色部分獲得，1/4 mg 組的 3/4 的海馬體顯示了 DG 肥大；b. 方法一節中所描述的，在 Timm 染色的大腦部分中從 IML 中獲得的灰色值，更大的數字表示更暗的灰色值，即在 IML 有更多的苔蘚纖維出芽的形成，DG，齒狀回；CA，海馬角；IML，內分子層；誤差線±SEM；Student’s t 檢驗；每一組的 4 個大腦取
3 討論
本研究結果表明，單劑量 KA 與低劑量勞拉西泮聯合注射用藥可靠地在大鼠上模擬了人類獲得性 TLE 的基本特征，同時避免 cSE 及其相關問題，例如顯著的差異性和死亡率。實驗步驟簡單。動物接受單次皮下注射 KA 和勞拉西泮，無需額外的治療或照顧，這點與通常需要多次注射和/或大量姑息治療的基于 cSE 的模型不同。多次注射是為了最大化 cSE 發作的動物數量，大量姑息治療是為了降低死亡率。目前結果表明，動物模型的關鍵不應該是誘導 cSE，而應該是延長 EEG 上的癲癇活動，因為癲癇發作并不總是伴隨著明顯的行為癥狀。事實上，人類癲癇持續狀態通常是非驚厥狀態。沿著這些思路，在實驗室和臨床中終止癲癇持續狀態需要充分的治療和 EEG 確認癲癇已經停止。我們在這里展示了“不足”劑量的勞拉西泮可以阻斷 cSE，但不能阻斷急性海馬癇性發作、神經退行性病變或癲癇發生。
Williams 等提出了重復低劑量 KA 模型并對該模型進行詳細的描述，雖然該模型無疑是有力可靠的，但本文提出的模型有一些明顯的優點—首先是簡單。反復給藥需要持續數小時的觀察，每只動物都需要個體化的治療，必須非常小心確保不會給藥過量。因為我們的方法是基于對所有動物都有效的 KA 單次給藥，所以不需要額外的關注，也沒有必要為每只動物計算滴定劑量。這種易用性，加上沒有顯著的個體差異，能促進在實驗性癲癇研究中這一動物模型的應用。
第二個優點是不會發生 cSE，這實際上是低劑量模型的關鍵。從本質上講就是反復 KA 給藥直到誘導 cSE 產生并持續 3 h。經受住 cSE 存活下來的動物經常在給藥后需要十分細致的照顧。幾天的恢復期是很常見的，在此期間，動物可能無法正常進食或飲水。目前的模型避免了 cSE 及其帶來的副作用，例如，發病率和死亡率，但也可以誘導海馬癲癇發作持續 3～4 h。推測因避免了 cSE，動物不需要任何姑息治療。
第一次之后的自發性癲癇均表現為痙攣性發作，可能暗示神經網絡的重構，例如，苔蘚纖維出芽的形成需要數周或數月才能完成。這樣的重組通過早期隱蔽的癲癇活動提供一種異常的途徑來退出海馬體并傳播到大腦的其他區域。這也許可以解釋盡管所有的癲癇發作都涉及到顆粒細胞的異常放電，但后來的癲癇發作才被普遍化。
最后，迫切需要實施新的癲癇模型，以揭示新的和不同的干預靶點和開發基于這些新治療方法。盡管在治療癲癇方面新型的 AEDs 具有優勢，如較小副作用或過敏反應，但在過去的 25 年里，它們的療效和耐受性并沒有明顯改善。因此，藥物治療對 30% 的癲癇患者沒有令人滿意的療效，這一數字在此期間也沒有改善。這個問題持續存在的原因之一是，除了極少數的例外，基于同一動物模型的所有藥物都已經被發現。因此，我們建議在藥物篩選中加入新的動物模型，以努力發現靶向新的誘發癲癇機制的物質。本模型特別可用于難治性 TLE 的藥物研發。雖然該模型中顯著的海馬硬化只在少數的 TLE 患者中可見，但這種損傷模式與藥物難治性癲癇密切相關。
綜上所述，本研究結果表明，單次聯合注射 KA 與低劑量勞拉西泮可靠地在大鼠上模擬人類獲得性顳葉癲癇的基本特征，同時避免 cSE 及其固有的問題。“KaL 模型”的主要特征是：治療方案簡單，自行終止的持續 3～4 h 的急性海馬癲癇發作，大量海馬神經退行性變，在 10～15 d 無癲癇期后的自發性海馬起源癲癇，發病率和死亡率不高。由于該模型的可靠性和易用性，有望在癲癇發生（癲癇的發展）和癲癇發作（個體、自發癲癇的表現）的機制研究以及針對難治性癲癇的藥物發現方面發揮作用。
