引用本文： 方子妍, 吳逢春, 陳樹達, 秦家明, 寧玉萍, 周列民. 苯妥英鈉耐藥性顳葉內側癲癇大鼠模型的構建. 癲癇雜志, 2019, 5(1): 21-25. doi: 10.7507/2096-0247.20190004 復制
盡管近年來癲癇在治療上已取得了長足的進步，但合理、規則地服用抗癲癇藥物（AEDs）仍是癲癇治療的主要手段。雖經正規 AEDs 治療，仍有約 30% 癲癇患者發作無法控制，即耐藥性癲癇[1, 2]。臨床上耐藥性癲癇以顳葉內側癲癇（Mesial temporal lobe epilepsy，MTLE）尤為多見。
雖然癲癇耐藥機制有多種假說，但耐藥性癲癇具有對多種 AEDs 均產生耐藥的特點，即使這些 AEDs 具有不同的作用機制[3]。這一現象可由多藥轉運體過表達學說解釋，即腦中 P 糖蛋白的過表達導致了藥物耐受[4, 5]，也是近年來耐藥性癲癇方向的研究熱點。手術切除耐藥性癲癇患者的腦組織上可見 P 糖蛋白（多藥轉運體之一）過表達，而現有的多種傳統的或新型 AEDs 都是 P 糖蛋白的作用底物[6]，因此推測腦中 P 糖蛋白過表達阻礙了 AEDs 進入癲癇灶的劑量，導致癲癇發作控制不佳，從而產生 AEDs 耐受現象。但由于倫理問題，無法比較不耐藥性癲癇患者腦中 P 糖蛋白表達水平的差異，因此耐藥性癲癇動物模型是目前耐藥性癲癇研究領域用于篩選新型 AEDs 療效判斷的最佳選擇。
研究證明，慢性 MTLE 動物模型通過 AEDs 耐藥篩選出不耐藥和耐藥兩個亞組，可作為研究兩亞組動物模型腦中 P 糖蛋白表達差異的合適研究對象。例如，對杏仁核電點燃大鼠模型予最大耐受劑量的苯巴比妥治療，根據其對苯巴比妥治療的效果可將其分成是否耐藥兩個亞組，并證實耐藥性模型鼠腦中 P 糖蛋白表達顯著高于不耐藥性模型鼠[7]。但無直接證據證實癲癇灶的 AEDs 濃度降低是由于局部腦組織中多藥轉運體過表達從而降低 AEDs 進入腦中的濃度，導致模型動物癲癇發作控制不佳。因此，本研究通過在鋰-匹羅卡品化學誘導的慢性 MTLE 模型大鼠上，經過苯妥英鈉篩選出耐藥及不耐藥模型鼠，采用活體微透析腦局部取樣技術直接檢測比較篩選出的耐藥性模型大鼠與不耐藥性模型大鼠腦中 AEDs 濃度的差異進一步驗證。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、試劑與儀器
1.1.1 動物來源
雌性 6～8 周 SD 大鼠 30 只，體重 160～180 g（廣東省實驗動物研究所）。
1.1.2 主要試劑
氯化鋰（Sigma L9650-100G）；匹羅卡品（Sigma P6503-10G）；東莨菪堿（Sigma S8502-1G）；苯妥英鈉（Sigma）。
1.1.3 主要儀器設備
微量進樣泵（MD-1020，Bioanalytical Systems Inc，USA）；微量收集器（MD-1027，Bioanalytical Systems Inc，USA）；液相色譜輸液泵（Waters Model 510 Millipore HPLC Pump）；進樣器（Waters 717 plus Autosampler）；檢測器（Waters 486 Tunable Absorbance Detector）；數據采集軟件（Empower）。
1.2 鋰-匹羅卡品化學誘導構建耐藥性 MTLE 模型大鼠
1.2.1 鋰-匹羅卡品構建慢性 MTLE 模型大鼠
1.2.2 苯妥英鈉篩選耐藥性及不耐藥性 MTLE 模型大鼠
采用視頻腦電圖（VEEG）進行連續監測，分為 3 個時期（基線期，即癲癇持續狀態后慢性期第 46～60 天；苯妥英鈉篩選期，即持續狀態后慢性期第 61～75 天；苯妥英鈉洗脫期，即持續狀態后慢性期第 76～90 天）。根據苯妥英鈉給藥前后癲癇頻次變化篩選出苯妥英鈉耐藥性模型（篩選期發作頻次較基線期降低<50%），余為苯妥英鈉不耐藥模型鼠。篩選期予以苯妥英鈉腹腔注射 35 mg/kg（2 次/ d，連續 2 周），于篩選期第 2、8、15 天清晨給藥前，眼底靜脈叢采血收集新鮮血 300 uL，4℃ 12 000 rmp 離心 4 min，采集上層血清 –20℃ 冰箱保存，待測濃度。基線期及洗脫期均于相同時間段腹腔注射同體積的生理鹽水替代藥物。
1.2.3 苯妥英鈉耐藥性及不耐藥性模型大鼠腦中藥物濃度檢測
苯妥英鈉洗脫期后，模型大鼠頸靜脈置管后固定在立體定位儀[8, 9]，定位于前囟后 5.2 mm，左 5.0 mm，微透析探針置入深度為前囟以下 7.5 mm。探針置入后穩定 2 h 才開始給藥（苯妥英鈉，35 mg/kg，2 mL/kg，靜脈注射）。給藥后 30、60、120、180、240 和 300 min，取全血 300 μL，4℃ 12 000rpm 離心 4 min 取上清液 –20℃ 保存。同時收集 0～30、30～60、60～120、120～180、180～240 和 240～300 min 的微透析液，–20℃ 保存。微透析實驗后，大鼠斷頭取腦，免疫組織化學檢測 P 糖蛋白表達。苯妥英鈉在腦中的分布用腦/血漿的時間藥物濃度曲線的曲線下面積比值進行量化。高效液相色譜法檢測待測樣品中苯妥英鈉濃度[10]。
1.2.4 苯妥英鈉耐藥性及不耐藥性模型大鼠腦中 P 糖蛋白檢測
采用單克隆小鼠抗大鼠 Mdr C-19 抗體（sc-1517，Santa Cruz Biotechnology，USA），具體步驟參見前期研究結果[8, 9, 11]。
1.3 統計學方法
用 SPSS 21.0 統計軟件進行數據處理。計量資料以均數±標準差或中位值（四分位間距）表示，t 檢驗（或 Wilcoxon 秩和檢驗）和 One-way ANOVA（或 Kruskal Wallis 秩和檢驗）進行數據比較。以 P 值 <0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
30 只大鼠中成功構建為慢性 MTLE 模型 16 只，成功篩選出耐藥模型大鼠 6 只（6/16）。
2.1 鋰-匹羅卡品構建慢性 MTLE 模型鼠
急性期：腹腔注射匹羅卡品至大鼠出現持續狀態的時間為（50.2±26.6） min，匹羅卡品用藥劑量為（42.6±13.4） mg/kg，發作程度分級達到 Racine 分級[12]Ⅳ級或以上視為急性期造模成功。有 5 只大鼠給藥后沒有出現發作；25 只大鼠出現發作中僅有 21 只發作程度達到 Racine 分級 IV 級及以上，其中 1 只大鼠在 SE 過程中死亡。鋰-匹羅卡品化學誘導大鼠急性期出現持續狀態的成功率為 66.7%（20/30）。大鼠在注射鋰-匹羅卡品后急性期出現以下不同程度的表現，包括：少動、盯視、嘴部自動癥、點頭、眨眼及濕狗樣晃動；隨后出現瞬時性驚厥發作：表現為直立、前肢和頭部陣攣、下肢強直，隨后摔倒，達到 Racine 分級Ⅳ/Ⅴ標準，并形成驚厥持續狀態持續 90 min。
慢性期：有 20 只大鼠持續狀態后經過 1～3 周潛伏期過渡到慢性期，2 只大鼠在飼養過程中死亡，2 只大鼠未出現慢性期發作，建模成功率為 53.3%（16/30），其發作表現為咀嚼、盯視等動作，每次持續數秒至十余秒，有時則泛化為全身性發作，符合臨床 MTLE 患者類似的行為學表現，并根據 Racine 分級記錄發作程度，發作期 EEG 記錄可見癇性放電（圖 1a）。與正常對照鼠（10 只）相比，具有癲癇發作的模型鼠于慢性期均出現海馬硬化的病理改變（正常大鼠海馬 CA3 區神經元形態見圖 1b，MTLE 模型鼠海馬 CA3 區神經元形態見圖 1c）。
圖1
鋰-匹羅卡品構建的慢性顳葉內側癲癇模型大鼠的海馬神經元形態及發作期腦電圖改變
a. 慢性顳葉內側癲癇模型大鼠腦電圖；b. 正常大鼠海馬 CA3 區神經元形態（尼氏染色 ×400）；c. 慢性顳葉內側癲癇模型大鼠海馬 CA3 區神經元形態（尼氏染色 ×400）
Figure1. Nissl’s staining in hippocampus CA3 and EEG in epileptic stage of MTLE rat model induced by Li-pilocarpinea. EEG in epileptic stage of MTLE rat model; b. the morphology of neurons in hippocampus CA3 of normal rat (Nissl’s staing ×400); c. the morphology of neurons in hippocampus CA3 of MTLE rat model (Nissl’s staing ×400)
2.2 苯妥英鈉篩選耐藥性及不耐藥性 MTLE 模型鼠
苯妥英鈉血藥濃度：篩選期第 2、8、15 天，耐藥性及不耐藥性模型大鼠兩組之間苯妥英鈉血藥濃度均無統計學差異（P>0.05）。兩組苯妥英鈉血藥濃度于第 2、8、15 天之間也均無統計學差異（P>0.05）。
苯妥英鈉療效篩選分組：16 只具有發作的模型鼠中篩選出耐藥性模型鼠 6 只，另 10 只為不耐藥性模型鼠。苯妥英鈉篩選期時，10 只不耐藥性模型鼠中有 2 只模型鼠完全無發作，8 只發作頻次相較于基線期降低>50%。6 只耐藥性模型鼠發作頻次不但沒有降低，反而比基線期發作頻次增高；在不耐藥性模型鼠中，苯妥英鈉篩選期較基線期及苯妥英鈉洗脫期癲癇發作頻次有明顯降低（P<0.05）；在耐藥性模型鼠中，苯妥英鈉篩選期較基線期及苯妥英鈉洗脫期癲癇發作頻次無降低，反而稍有增高，差異無統計學意義（P>0.05），見表 1。
表1
耐藥性及不耐藥性顳葉內側癲癇模型大鼠不同時期的癲癇發作頻次比較（
）
Table1.
Comparison of seizures frequency of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model during different periods (
)
2.3 耐藥性及不耐藥性 MTLE 模型大鼠腦中藥物濃度
腦微透析液藥物濃度：不耐藥性模型大鼠與耐藥模型大鼠予一次性給藥苯妥英鈉后 30、60、120、180、240 及 300 min，腦中藥物濃度均有統計學差異，耐藥模性型鼠低于不耐藥性模型鼠（P<0.05），圖 2。
圖2
耐藥性及不耐藥性顳葉內側癲癇模型大鼠腦中苯妥英鈉濃度比較
Figure2.
Comparison of phenytoin level in brain of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model
血漿藥物濃度：不耐藥性模型鼠與耐藥性模型大鼠于一次性給藥 PHT 后 30、60、120、180、240 及 300 min，外周血中藥物濃度均無統計學差異（P>0.05），圖 3。
圖3
耐藥性及不耐藥性顳葉內側癲癇模型大鼠血中苯妥英鈉濃度比較
Figure3.
Comparison of phenytoin level in plasma of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model
腦/血漿的時間藥物濃度曲線的曲線下面積比值：不耐藥性與耐藥性模型大鼠的腦/血漿的時間藥物濃度曲線的曲線下面積比值之間有統計學差異，耐藥性模型鼠明顯低于不耐藥性模型鼠（0.15±0.03 vs. 0.28±0.05，P<0.05），圖 4。
圖4
耐藥性及不耐藥性顳葉內側癲癇模型大鼠腦中苯妥英鈉分布比較
Figure4.
Comparison of phenytoin distribution in brain of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model
2.4 耐藥性及不耐藥性 MTLE 模型大鼠腦中 P 糖蛋白表達
相較于正常對照大鼠，MTLE 模型鼠海馬各區的 P 糖蛋白的表達均明顯增高；相較于不耐藥模型鼠，耐藥性模型鼠海馬各區的 P 糖蛋白表達均顯著增高（P<0.05）。
3 討論
建立慢性癲癇動物模型的主要目的是利用模型來探索人類癲癇發作，尤其是耐藥性癲癇發作的成因及演變規律。而理想的耐藥性癲癇動物模型除應具備慢性、自發性、復發性這 3 個共同特征外，還應具備以下特征：模型的癇性發作應與人類癲癇的臨床表現相似；模型的癇性發作應與 EEG 的改變相對應，以便從行為和 EEG 改變兩個方面評估 AEDs 的作用效果；標準的 AEDs 不能或只能微弱的控制慢性自主發作；模型應滿足進行長期 AEDs 的藥效研究，即動物可伴隨癲癇發作長期存活，且治療過程中能保持有效的藥物濃度[13]。
目前癲癇動物模型主要有遺傳模型和點燃模型，而遺傳模型因制作復雜和費用昂貴，且特異性太強，不適合廣泛應用，因此目前應用最多的是點燃模型，即化學點燃模型和電點燃模型。電點燃模型由于構建相對快捷，但是其自然發生發展進程與人類 MTLE 病程相悖，并不是適合的模型。我們的研究采用鋰-匹羅卡品化學誘導模型早期出現驚厥樣發作，經一段潛伏期后慢性期出現自發性反復發作，慢性期的發作在行為學上類似于人類 MTLE 復雜部分性癲癇發作和/或伴繼發性全身強直陣攣發作，其同步 EEG 也類似于人類。發生發展進程與人類 MTLE 病程相似[14]。另外，由于鋰-匹羅卡品聯合使用而毒性作用小，慢性自主發作期持續時間較長，大鼠可長期存活。本課題組前期研究發現鋰-匹羅卡品注射致驚厥持續狀態后 60 天海馬 CA1、CA3 及 DG 區錐體細胞層見部分細胞腫脹、破裂，細胞輪廓模糊、界限不清，呈空泡樣變性，胞漿尼氏小體減少，出現神經元的缺失，再次證實了該模型的病理學特點，與人類 MTLE 病理改變一致[15]。因此，該模型無論臨床特征還是病理改變均很好的模擬了人類 MTLE。
在此基礎上，我們進一步對該模型進行了耐藥性的篩查和機制驗證。鑒于模型大鼠慢性期自發性反復發作具有波動性和呈簇性出現。因此，非給藥期及給藥期的持續 VEEG 監測對于完整的準確的評估是必不可少的。另外，我們在設置了基線期和篩選期的基礎上還增加了苯妥英鈉洗脫期，形成自身對照，以證實模型大鼠發作頻次變化與苯妥英鈉治療具有明顯的相關性。
該研究中，30 只大鼠中 16 只在癲癇持續狀態后慢性期出現自發性反復發作，造模成功率為 53.3%（16/30），其中有 6 只對最大耐受劑量的苯妥英鈉給藥無效，這一比例與既往報道的研究所篩選的結果是一致的；另 10 只發作頻次降低至少有 50%，達到臨床上判斷藥物治療有效的標準。10 只不耐藥性模型鼠中有 2 只在篩選期出現完全無發作。在此期間，不耐藥與耐藥組之間癲癇發作頻次有明顯差別，而基線期并無統計學差異。因此我們認為，利用苯妥英鈉篩選鋰-匹羅卡品誘導持續狀態后慢性期具有自發性反復發作的 MTLE 模型大鼠中的不耐藥性與耐藥性模型的方式是可行的。
綜上，以鋰-匹羅卡品誘導的 MTLE 大鼠模型為基礎，應用苯妥英鈉篩選出的耐藥性癲癇模型大鼠腦中苯妥英鈉藥物濃度下降，可作為研究該耐藥性機制及藥物篩選的理想模型進行后續研究。
盡管近年來癲癇在治療上已取得了長足的進步，但合理、規則地服用抗癲癇藥物（AEDs）仍是癲癇治療的主要手段。雖經正規 AEDs 治療，仍有約 30% 癲癇患者發作無法控制，即耐藥性癲癇[1, 2]。臨床上耐藥性癲癇以顳葉內側癲癇（Mesial temporal lobe epilepsy，MTLE）尤為多見。
雖然癲癇耐藥機制有多種假說，但耐藥性癲癇具有對多種 AEDs 均產生耐藥的特點，即使這些 AEDs 具有不同的作用機制[3]。這一現象可由多藥轉運體過表達學說解釋，即腦中 P 糖蛋白的過表達導致了藥物耐受[4, 5]，也是近年來耐藥性癲癇方向的研究熱點。手術切除耐藥性癲癇患者的腦組織上可見 P 糖蛋白（多藥轉運體之一）過表達，而現有的多種傳統的或新型 AEDs 都是 P 糖蛋白的作用底物[6]，因此推測腦中 P 糖蛋白過表達阻礙了 AEDs 進入癲癇灶的劑量，導致癲癇發作控制不佳，從而產生 AEDs 耐受現象。但由于倫理問題，無法比較不耐藥性癲癇患者腦中 P 糖蛋白表達水平的差異，因此耐藥性癲癇動物模型是目前耐藥性癲癇研究領域用于篩選新型 AEDs 療效判斷的最佳選擇。
研究證明，慢性 MTLE 動物模型通過 AEDs 耐藥篩選出不耐藥和耐藥兩個亞組，可作為研究兩亞組動物模型腦中 P 糖蛋白表達差異的合適研究對象。例如，對杏仁核電點燃大鼠模型予最大耐受劑量的苯巴比妥治療，根據其對苯巴比妥治療的效果可將其分成是否耐藥兩個亞組，并證實耐藥性模型鼠腦中 P 糖蛋白表達顯著高于不耐藥性模型鼠[7]。但無直接證據證實癲癇灶的 AEDs 濃度降低是由于局部腦組織中多藥轉運體過表達從而降低 AEDs 進入腦中的濃度，導致模型動物癲癇發作控制不佳。因此，本研究通過在鋰-匹羅卡品化學誘導的慢性 MTLE 模型大鼠上，經過苯妥英鈉篩選出耐藥及不耐藥模型鼠，采用活體微透析腦局部取樣技術直接檢測比較篩選出的耐藥性模型大鼠與不耐藥性模型大鼠腦中 AEDs 濃度的差異進一步驗證。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、試劑與儀器
1.1.1 動物來源
雌性 6～8 周 SD 大鼠 30 只，體重 160～180 g（廣東省實驗動物研究所）。
1.1.2 主要試劑
氯化鋰（Sigma L9650-100G）；匹羅卡品（Sigma P6503-10G）；東莨菪堿（Sigma S8502-1G）；苯妥英鈉（Sigma）。
1.1.3 主要儀器設備
微量進樣泵（MD-1020，Bioanalytical Systems Inc，USA）；微量收集器（MD-1027，Bioanalytical Systems Inc，USA）；液相色譜輸液泵（Waters Model 510 Millipore HPLC Pump）；進樣器（Waters 717 plus Autosampler）；檢測器（Waters 486 Tunable Absorbance Detector）；數據采集軟件（Empower）。
1.2 鋰-匹羅卡品化學誘導構建耐藥性 MTLE 模型大鼠
1.2.1 鋰-匹羅卡品構建慢性 MTLE 模型大鼠
1.2.2 苯妥英鈉篩選耐藥性及不耐藥性 MTLE 模型大鼠
采用視頻腦電圖（VEEG）進行連續監測，分為 3 個時期（基線期，即癲癇持續狀態后慢性期第 46～60 天；苯妥英鈉篩選期，即持續狀態后慢性期第 61～75 天；苯妥英鈉洗脫期，即持續狀態后慢性期第 76～90 天）。根據苯妥英鈉給藥前后癲癇頻次變化篩選出苯妥英鈉耐藥性模型（篩選期發作頻次較基線期降低<50%），余為苯妥英鈉不耐藥模型鼠。篩選期予以苯妥英鈉腹腔注射 35 mg/kg（2 次/ d，連續 2 周），于篩選期第 2、8、15 天清晨給藥前，眼底靜脈叢采血收集新鮮血 300 uL，4℃ 12 000 rmp 離心 4 min，采集上層血清 –20℃ 冰箱保存，待測濃度。基線期及洗脫期均于相同時間段腹腔注射同體積的生理鹽水替代藥物。
1.2.3 苯妥英鈉耐藥性及不耐藥性模型大鼠腦中藥物濃度檢測
苯妥英鈉洗脫期后，模型大鼠頸靜脈置管后固定在立體定位儀[8, 9]，定位于前囟后 5.2 mm，左 5.0 mm，微透析探針置入深度為前囟以下 7.5 mm。探針置入后穩定 2 h 才開始給藥（苯妥英鈉，35 mg/kg，2 mL/kg，靜脈注射）。給藥后 30、60、120、180、240 和 300 min，取全血 300 μL，4℃ 12 000rpm 離心 4 min 取上清液 –20℃ 保存。同時收集 0～30、30～60、60～120、120～180、180～240 和 240～300 min 的微透析液，–20℃ 保存。微透析實驗后，大鼠斷頭取腦，免疫組織化學檢測 P 糖蛋白表達。苯妥英鈉在腦中的分布用腦/血漿的時間藥物濃度曲線的曲線下面積比值進行量化。高效液相色譜法檢測待測樣品中苯妥英鈉濃度[10]。
1.2.4 苯妥英鈉耐藥性及不耐藥性模型大鼠腦中 P 糖蛋白檢測
采用單克隆小鼠抗大鼠 Mdr C-19 抗體（sc-1517，Santa Cruz Biotechnology，USA），具體步驟參見前期研究結果[8, 9, 11]。
1.3 統計學方法
用 SPSS 21.0 統計軟件進行數據處理。計量資料以均數±標準差或中位值（四分位間距）表示，t 檢驗（或 Wilcoxon 秩和檢驗）和 One-way ANOVA（或 Kruskal Wallis 秩和檢驗）進行數據比較。以 P 值 <0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
30 只大鼠中成功構建為慢性 MTLE 模型 16 只，成功篩選出耐藥模型大鼠 6 只（6/16）。
2.1 鋰-匹羅卡品構建慢性 MTLE 模型鼠
急性期：腹腔注射匹羅卡品至大鼠出現持續狀態的時間為（50.2±26.6） min，匹羅卡品用藥劑量為（42.6±13.4） mg/kg，發作程度分級達到 Racine 分級[12]Ⅳ級或以上視為急性期造模成功。有 5 只大鼠給藥后沒有出現發作；25 只大鼠出現發作中僅有 21 只發作程度達到 Racine 分級 IV 級及以上，其中 1 只大鼠在 SE 過程中死亡。鋰-匹羅卡品化學誘導大鼠急性期出現持續狀態的成功率為 66.7%（20/30）。大鼠在注射鋰-匹羅卡品后急性期出現以下不同程度的表現，包括：少動、盯視、嘴部自動癥、點頭、眨眼及濕狗樣晃動；隨后出現瞬時性驚厥發作：表現為直立、前肢和頭部陣攣、下肢強直，隨后摔倒，達到 Racine 分級Ⅳ/Ⅴ標準，并形成驚厥持續狀態持續 90 min。
慢性期：有 20 只大鼠持續狀態后經過 1～3 周潛伏期過渡到慢性期，2 只大鼠在飼養過程中死亡，2 只大鼠未出現慢性期發作，建模成功率為 53.3%（16/30），其發作表現為咀嚼、盯視等動作，每次持續數秒至十余秒，有時則泛化為全身性發作，符合臨床 MTLE 患者類似的行為學表現，并根據 Racine 分級記錄發作程度，發作期 EEG 記錄可見癇性放電（圖 1a）。與正常對照鼠（10 只）相比，具有癲癇發作的模型鼠于慢性期均出現海馬硬化的病理改變（正常大鼠海馬 CA3 區神經元形態見圖 1b，MTLE 模型鼠海馬 CA3 區神經元形態見圖 1c）。
圖1
鋰-匹羅卡品構建的慢性顳葉內側癲癇模型大鼠的海馬神經元形態及發作期腦電圖改變
a. 慢性顳葉內側癲癇模型大鼠腦電圖；b. 正常大鼠海馬 CA3 區神經元形態（尼氏染色 ×400）；c. 慢性顳葉內側癲癇模型大鼠海馬 CA3 區神經元形態（尼氏染色 ×400）
Figure1. Nissl’s staining in hippocampus CA3 and EEG in epileptic stage of MTLE rat model induced by Li-pilocarpinea. EEG in epileptic stage of MTLE rat model; b. the morphology of neurons in hippocampus CA3 of normal rat (Nissl’s staing ×400); c. the morphology of neurons in hippocampus CA3 of MTLE rat model (Nissl’s staing ×400)
2.2 苯妥英鈉篩選耐藥性及不耐藥性 MTLE 模型鼠
苯妥英鈉血藥濃度：篩選期第 2、8、15 天，耐藥性及不耐藥性模型大鼠兩組之間苯妥英鈉血藥濃度均無統計學差異（P>0.05）。兩組苯妥英鈉血藥濃度于第 2、8、15 天之間也均無統計學差異（P>0.05）。
苯妥英鈉療效篩選分組：16 只具有發作的模型鼠中篩選出耐藥性模型鼠 6 只，另 10 只為不耐藥性模型鼠。苯妥英鈉篩選期時，10 只不耐藥性模型鼠中有 2 只模型鼠完全無發作，8 只發作頻次相較于基線期降低>50%。6 只耐藥性模型鼠發作頻次不但沒有降低，反而比基線期發作頻次增高；在不耐藥性模型鼠中，苯妥英鈉篩選期較基線期及苯妥英鈉洗脫期癲癇發作頻次有明顯降低（P<0.05）；在耐藥性模型鼠中，苯妥英鈉篩選期較基線期及苯妥英鈉洗脫期癲癇發作頻次無降低，反而稍有增高，差異無統計學意義（P>0.05），見表 1。
表1
耐藥性及不耐藥性顳葉內側癲癇模型大鼠不同時期的癲癇發作頻次比較（
）
Table1.
Comparison of seizures frequency of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model during different periods (
)
2.3 耐藥性及不耐藥性 MTLE 模型大鼠腦中藥物濃度
腦微透析液藥物濃度：不耐藥性模型大鼠與耐藥模型大鼠予一次性給藥苯妥英鈉后 30、60、120、180、240 及 300 min，腦中藥物濃度均有統計學差異，耐藥模性型鼠低于不耐藥性模型鼠（P<0.05），圖 2。
圖2
耐藥性及不耐藥性顳葉內側癲癇模型大鼠腦中苯妥英鈉濃度比較
Figure2.
Comparison of phenytoin level in brain of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model
血漿藥物濃度：不耐藥性模型鼠與耐藥性模型大鼠于一次性給藥 PHT 后 30、60、120、180、240 及 300 min，外周血中藥物濃度均無統計學差異（P>0.05），圖 3。
圖3
耐藥性及不耐藥性顳葉內側癲癇模型大鼠血中苯妥英鈉濃度比較
Figure3.
Comparison of phenytoin level in plasma of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model
腦/血漿的時間藥物濃度曲線的曲線下面積比值：不耐藥性與耐藥性模型大鼠的腦/血漿的時間藥物濃度曲線的曲線下面積比值之間有統計學差異，耐藥性模型鼠明顯低于不耐藥性模型鼠（0.15±0.03 vs. 0.28±0.05，P<0.05），圖 4。
圖4
耐藥性及不耐藥性顳葉內側癲癇模型大鼠腦中苯妥英鈉分布比較
Figure4.
Comparison of phenytoin distribution in brain of drug-resistant and drug-responsive MTLE rat model
2.4 耐藥性及不耐藥性 MTLE 模型大鼠腦中 P 糖蛋白表達
相較于正常對照大鼠，MTLE 模型鼠海馬各區的 P 糖蛋白的表達均明顯增高；相較于不耐藥模型鼠，耐藥性模型鼠海馬各區的 P 糖蛋白表達均顯著增高（P<0.05）。
3 討論
建立慢性癲癇動物模型的主要目的是利用模型來探索人類癲癇發作，尤其是耐藥性癲癇發作的成因及演變規律。而理想的耐藥性癲癇動物模型除應具備慢性、自發性、復發性這 3 個共同特征外，還應具備以下特征：模型的癇性發作應與人類癲癇的臨床表現相似；模型的癇性發作應與 EEG 的改變相對應，以便從行為和 EEG 改變兩個方面評估 AEDs 的作用效果；標準的 AEDs 不能或只能微弱的控制慢性自主發作；模型應滿足進行長期 AEDs 的藥效研究，即動物可伴隨癲癇發作長期存活，且治療過程中能保持有效的藥物濃度[13]。
目前癲癇動物模型主要有遺傳模型和點燃模型，而遺傳模型因制作復雜和費用昂貴，且特異性太強，不適合廣泛應用，因此目前應用最多的是點燃模型，即化學點燃模型和電點燃模型。電點燃模型由于構建相對快捷，但是其自然發生發展進程與人類 MTLE 病程相悖，并不是適合的模型。我們的研究采用鋰-匹羅卡品化學誘導模型早期出現驚厥樣發作，經一段潛伏期后慢性期出現自發性反復發作，慢性期的發作在行為學上類似于人類 MTLE 復雜部分性癲癇發作和/或伴繼發性全身強直陣攣發作，其同步 EEG 也類似于人類。發生發展進程與人類 MTLE 病程相似[14]。另外，由于鋰-匹羅卡品聯合使用而毒性作用小，慢性自主發作期持續時間較長，大鼠可長期存活。本課題組前期研究發現鋰-匹羅卡品注射致驚厥持續狀態后 60 天海馬 CA1、CA3 及 DG 區錐體細胞層見部分細胞腫脹、破裂，細胞輪廓模糊、界限不清，呈空泡樣變性，胞漿尼氏小體減少，出現神經元的缺失，再次證實了該模型的病理學特點，與人類 MTLE 病理改變一致[15]。因此，該模型無論臨床特征還是病理改變均很好的模擬了人類 MTLE。
在此基礎上，我們進一步對該模型進行了耐藥性的篩查和機制驗證。鑒于模型大鼠慢性期自發性反復發作具有波動性和呈簇性出現。因此，非給藥期及給藥期的持續 VEEG 監測對于完整的準確的評估是必不可少的。另外，我們在設置了基線期和篩選期的基礎上還增加了苯妥英鈉洗脫期，形成自身對照，以證實模型大鼠發作頻次變化與苯妥英鈉治療具有明顯的相關性。
該研究中，30 只大鼠中 16 只在癲癇持續狀態后慢性期出現自發性反復發作，造模成功率為 53.3%（16/30），其中有 6 只對最大耐受劑量的苯妥英鈉給藥無效，這一比例與既往報道的研究所篩選的結果是一致的；另 10 只發作頻次降低至少有 50%，達到臨床上判斷藥物治療有效的標準。10 只不耐藥性模型鼠中有 2 只在篩選期出現完全無發作。在此期間，不耐藥與耐藥組之間癲癇發作頻次有明顯差別，而基線期并無統計學差異。因此我們認為，利用苯妥英鈉篩選鋰-匹羅卡品誘導持續狀態后慢性期具有自發性反復發作的 MTLE 模型大鼠中的不耐藥性與耐藥性模型的方式是可行的。
綜上，以鋰-匹羅卡品誘導的 MTLE 大鼠模型為基礎，應用苯妥英鈉篩選出的耐藥性癲癇模型大鼠腦中苯妥英鈉藥物濃度下降，可作為研究該耐藥性機制及藥物篩選的理想模型進行后續研究。
