引用本文： 呂明惠, 蘇少華, 武鑫, 鄭婉君, 張松江, 孫寧寧, 高劍峰. 電針穴位對癲癇持續狀態小鼠海馬神經元凋亡的研究. 癲癇雜志, 2018, 4(3): 207-213. doi: 10.7507/2096-0247.20180036 復制
癲癇是腦病中極為復雜且治療困難的疾病之一，其復發率高，嚴重影響患者正常生活，會引起難以恢復的認知記憶能力損傷，發展為癲癇持續狀態（Status epilepticus，SE）則更可能引起死亡。針灸防治癲癇在古代即有論述，具有良好療效，但因其多為醫家個案為主，并無系統總結，且由于其缺乏實驗支持，為現代醫學所懷疑。現代醫學對癲癇的定義是大腦神經元異常放電導致的反復性發作為特征的大腦功能失調綜合癥[1]。根據發作次數多少可以分為輕度和重度，國際抗癲癇聯盟（ILAE）2016 年根據其癲癇發作的不同情況，可分為局灶性、全面性、起源不明三大類[2]。隨著癲癇發作次數、時間等的增加，可導致患者出現行為運動、精神感覺、認知等多種功能障礙，對病患造成如睡眠障礙等一系列生活障礙，當單純癲癇發作進展為癲癇持續狀態則可能導致生命危險[3]。癲癇發病可能會引起腦部炎性損傷，炎癥因子進一步促進癲癇的發生，形成惡性循環，出現認知障礙等癥狀，其與海馬損傷聯系密切[4]。海馬為神經干細胞再生的重要場所，神經元的數目與認知正相關[5]。癲癇腦損傷可促使細胞表達凋亡蛋白（Caspase-3）導致神經元凋亡，凋亡促使細胞骨架的崩裂，微管相關蛋白 2（Microtubule-associated protein 2，MAP-2）為細胞骨架重要組成部分，本實驗通過免疫組織化學方法檢測 Caspase-3、MAP-2，探討電針穴位對癲癇持續狀態小鼠海馬神經元凋亡的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
雄性 C57BL/6J 小鼠 40 只，30 日齡；體重 18～23 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。本實驗通過河南中醫藥大學實驗動物倫理中心批準（倫理編號：DWLL17010033）。小鼠隨機數字表法分為：正常對照組（n=10，無電針、無鋰-匹羅卡品腹腔注射）、癲癇模型組（n=15，無電針，予鋰-匹羅卡品腹腔注射）、癲癇電針穴位組（n=15，電針針刺百會、風府，予鋰-匹羅卡品腹腔注射）。
1.2 主要儀器、試劑與藥品
主要儀器：旋轉石蠟切片機（Thermo，Finesse 325）、體視學顯微鏡（OLYMPUS，型號 DP73 ）、圖像分析系統（cell Sens dIMENSION 1.11，型號 H5ZDMVE8UPV）、電針刺激儀（上海華誼儀器制造廠，型號 G-6805）、全自動曠場實驗設備（淮北正華生物儀器設備有限公司，型號 Panlab smart，BS）。
試劑：anti-Caspase-3 antibody（美國 abcam）、anti-MAP-2 antibody（美國 abcam）、Goat anti-rabbit IgG（美國 abcam）、5% 多聚甲醛溶液（Solarbio）。
藥品：2% 戊巴比妥鈉、無水氯化鋰（批號 20160105）、匹羅卡品（批號 P441495）、鹽酸阿托品、地西泮、生理鹽水、5% 葡萄糖氯化鈉等。
1.3 鋰-匹羅卡品癲癇小鼠模型制備
在造模前小鼠腹腔注射無水氯化鋰（130 mg/kg），18～24 h 后注射鹽酸阿托品（1 mg/kg），30 min 后再注射匹羅卡品（150 mg/kg）。給藥小鼠在 15～30 min 后出現反復強直-陣攣發作，即 SE。癲癇發作依據 Racine 分級[6]進行評定。于 SE 后 90 min，腹腔注射地西泮（10 mg/kg），終止 SE，降低死亡率。若 30 min 后未出現癲癇發作的小鼠重復給予匹羅卡品（150 mg/kg），出現 SE 后 90 min 腹腔注射地西泮注射液（10 mg/kg）以終止 SE，如抗驚厥效果不佳可每隔 30 min 加 1 次地西泮，但所追加劑量不超過第 1 次注射劑量的 1/3；監測小鼠腦電圖（EEG）變化。空白對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，余同實驗組。SE 后 1 周內，每天給予 5% 葡萄糖氯化鈉 2.5 mL 腹腔注射 1 次以加強能量供給，并喂水 1～3 次，以防小鼠因缺水致死。
1.4 電針干預方法
參照余曙光，郭義注《實驗針灸學》[7]取百會：頂骨正中；風府：枕骨頂嵴后枕寰關節背凹陷處。分別取回路 1（百會、風府）、回路 2（雙側腎俞），用無菌針灸針（蘇州醫療用品廠 0.30 mm×13 mm）向后斜刺入皮下 1 mm 左右，連接電針儀并設置參數為：電壓 1.5 V，頻率 10 Hz，波寬 1 ms，針刺 30 min/次，1 次/d 連續針刺，每次 20 min，連續 7 d。
1.5 曠場實驗
電針針刺結束后，第 2 d 開始進行曠場實驗：將實驗小鼠依次放入敞箱內，敞箱為長 60 cm×寬 60 cm×高 50 cm，底部為定面積的 25 格，內壁為黑色。連續記錄 5 min 內小鼠穿越格數（穿越中心次數）、后肢站立次數（垂直得分）及修飾次數（小鼠雙手梳洗頭部及嘴部毛發）。每只小鼠實驗完成后采用 75% 酒精擦拭敞箱，再進行下一只實驗。記錄過程采用 Panlab Smart 記錄動物軌跡及分析。
新物體認知實驗于曠場實驗結束第 2 d 進行，敞箱規格同上，先放入完全相同的的物體 1（O1）和物體 2（O2），放入小鼠熟悉 5 min。然后將 O1 換為圓柱形盒子（O3），連續記錄 5 min 內小鼠在 O2、O3 時間。每只小鼠實驗完成后同樣采用 75% 酒精擦拭敞箱，再進行下一只實驗。記錄過程采用 Panlab Smart 記錄動物軌跡及分析，認知指數=O3/（O2+O3）。
1.6 取材
新物體實驗結束后，2% 戊巴比妥鈉（0.1 mL/10 g）深度麻醉小鼠，開胸暴露心臟，穿刺針經左心室穿刺至升主動脈，剪開右心耳，持續以 0.1 mol/L 的 PBS 液 （PH=7.4）30～40 mL 灌注沖洗血管約 10 min，直至右心耳流出液體變清亮，繼續灌注 5% 的多聚甲醛 35 mL，當小鼠四肢僵硬、牽拉不易、尾部翹起、肺臟及肝臟均變為蒼白色，即為灌注成功，再灌注 10 mL，然后斷頭，冰床上快速取腦。取出腦組織以 5% 多聚甲醛固定 1 周后，進行石蠟包埋。
1.7 HE 染色觀察海馬神經元病理改變
65℃ 恒溫箱烤片 2 h 后。常規脫蠟至水，流水沖洗 2 min；蘇木素復染 5 min，流水沖洗 2 min；1% 鹽酸乙醇 1s，流水沖洗 10 min，伊紅染色 1 min，流水沖洗 2 min，梯度脫水，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察拍片留存。
1.8 免疫組織化學檢測凋亡蛋白/微管相關蛋白 2
65℃ 恒溫箱烤片 2 h 后。常規脫蠟至水，組織上滴加 3% H2O2，室溫孵育 10 min，蒸餾水洗 3 次，每次 3 min；浸入檸檬酸鹽緩沖液，微波爐修復，自然放涼，PBS 洗 3 次，每次 3 min；滴加 10% 山羊血清封閉，37℃，30 min，甩去勿洗；滴加 Caspase-3（1∶80）/MAP-2（1∶50）一抗，置入 4℃ 冰箱，恒溫孵育過夜。次日冰箱取出，室溫 10 min，37℃，30 min。PBS 洗 3 次，每次 5 min；滴加 Goat anti-rabbit IgG（1∶100 ）/ 山羊抗小鼠 IgG（1∶50）二抗，37℃ 孵育 25 min。PBS 洗 3 次，每次 5 min；DAB 顯色，顯微鏡下觀察，流水沖洗 2～5 min；蘇木精復染 2～10 s，流水沖洗 5 min；梯度酒精脫水，中性樹膠二甲苯稀釋后封片。顯微鏡進行觀察拍片留存。
1.9 統計學方法
實驗數據采用 SPSS15.0 統計學軟件進行統計處理。定量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-t 法。檢驗水準 α 取 0.05，以 P 值<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
本次實驗造模，在注射藥物誘發 SE 過程中小鼠死亡 1 只；造模結束后第 2 d，小鼠死亡 5 只；第 3 d，小鼠死亡 6 只；第 4 d，小鼠死亡 2 只，第 5～7 d 無死亡。電針治療過程中無死亡，總死亡小鼠 14 只，死亡率 35%。
2.1 曠場及新物體認知實驗
與正常對照組相比，SE 模型組小鼠垂直次數、修飾次數和穿越中心次數均顯著提高，差異具有統計學意義（（P 均<0.000 1）。與 SE 模型組小鼠相比，電針穴位組小鼠垂直次數明顯提高，差異具有統計學意義（P<0.01）；修飾次數和穿越中心次數均有提高，差異具有統計學意義（P 均<0.05），見表 1，圖 1。
表1
電針干預癲癇持續狀態小鼠曠場實驗結果（
）
Table1.
Results of open field experiments (
)
圖1
各組小鼠曠場實驗統計圖
a. 垂直運動次數；b. 修飾次數；c. 穿越中心次數
Figure1. Open field experimental statistics grapha. times of rearing; b. times of modification; c. times of crossing
SE 模型組小鼠認知指數為（0.483±0.113），較正常對照組（0.879±0.035）顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.01）。電針穴位組小鼠認知指數 0.733±0.049，較 SE 模型組小鼠顯著提高，差異具有統計學意義（P<0.01），見圖 2。
圖2
各組小鼠新物體認知實驗統計圖
Figure2.
New object recognition experiments statistics graph
2.2 HE 檢測
與正常對照組相比，SE 模型組小鼠海馬區出現大量空泡狀神經元，細胞收縮，細胞核深染且有碎裂，染色質固縮，胞核腫脹增大，細胞整體結構模糊，發生濃縮。與 SE 模型組小鼠相比，電針穴位組海馬區神經元起泡較少，且細胞整體結構完整，邊界清晰，細胞排列良好（圖 3）。
圖3
各組小鼠海馬區齒狀回、CA1 區 HE 染色（×400）
a. 正常對照組 DG；b. SE 模型組 DG；c. 電針穴位組 DG；d. 正常對照組 CA1；e. SE 模型組 CA1；f. 電針穴位組 CA1
Figure3. The dentate gyrus CA1 area of hippocampus in each group of mice (×400)a. control group DG; b. SE model group DG; c. EA group DG; d. control group CA1; e. SE model group CA1; f. EA group CA1
2.3 免疫組織化學凋亡蛋白 Caspase-3 檢測
SE 模型組小鼠海馬區 Caspase-3 陽性細胞 IOD 值為（0.020±0.010），較正常對照組（0.016±0.008）顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.000 1）。電針穴位組小鼠 Caspase-3 陽性細胞 IOD 值為（0.013±0.007），較 SE 模型組小鼠顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖 4。
圖4
各組小鼠海馬區免疫組織化學凋亡蛋白 Caspase-3 陽性細胞表達（×400）
a. 正常對照組小鼠；b. SE 模型組小鼠；c. 電針穴位組小鼠；d. 各組海馬區 Caspase-3 陽性細胞表達 IOD 統計圖
Figure4. Expression of immunohistochemistry apoptosis protein positive cells in hippocampus of mice in each group（×400）a. control group; b. SE model group; c. EA group; d. the positive cells IOD statistics of each group in hippocampus
2.4 微管相關蛋白 2（MAP-2）檢測
SE 模型組小鼠海馬區 MAP-2 陽性細胞 IOD 值為（0.18±0.01），較正常對照組（0.27±0.02）顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。電針穴位組小鼠 MAP-2 陽性細胞 IOD 值為（0.25±0.03），較 SE 模型組小鼠顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖 5。
圖5
各組小鼠海馬區微管相關蛋白 2（MAP-2）陽性細胞表達（×400）
a. 正常對照組小鼠；b. SE 模型組小鼠；c. 電針穴位組小鼠；d. 各組海馬區 MAP-2 陽性細胞表達 IOD 統計圖
Figure5. Expression of MAP-2 positive cells in hippocampus of mice of each group（×400）a. control group; b. SE model group; c. EA group; d. the MAP-2 positive cells IOD statistics of each group in hippocampus
3 討論
“癲癇”、“癇證”在中醫為重要的腦部疾病之一，在先秦時期古人即對腦部功能有了一定認識，隨著腦的解剖、生理功能及其病因病機理論的發展，歷代先賢多將其歸為“風邪侵襲”、“先天腎氣不足”、“后天脾胃虛弱”、“肝腎風熱”等病因病機。據此，我們選取百會、風府兩穴進行電針干預。“百會”出自《針灸甲乙經》，又稱“三陽五會”，有開竅醒腦、回陽固本之功。分布著來自 C2 的枕大神經分支、來自三叉神經第一支的額神經。《現代針灸學理論與臨床應用》[8]：“百會”主治枕部、頸項部、膈肌等與該穴處在相關神經節段區內的組織器官疾病及腦部中樞的疾病。《備急千金方》認為百會可治療“狂癇不識人，癲病眩亂”“風府”出自《素問·氣府論第五十九》，功在清熱散風、通關開竅。分布著來自 C2 的枕大神經，來自 C3 的第三頸神經，深部為延髓和小腦。《針灸大成》言其為足太陽、督脈、陽維之會。百會為治療癲癇要穴，可以醒腦回陽；癲癇可因內風上擾發病，風府內外風皆可驅，兩穴相互為用，共奏治癲癇之功。
海馬損傷導致認知功能障礙，已有研究表明癲癇會對海馬神經元造成損傷[9-11]。本實驗運用曠場實驗及新物體認知實驗進行動物認知能力檢驗[12]，結果顯示：SE 模型組小鼠垂直運動、修飾次數、穿越次數均下降明顯（P 均<0.000 1），伴隨其認知能力顯著下降（P<0.01），表明 SE 對小鼠海馬造成損傷，導致其認知、記憶及學習能力降低。與 SE 模型組比較，電針穴位組小鼠垂直運動、修飾次數、穿越次數均有提高（P<0.01、P<0.05、P<0.05），對新物體的認知能力提高（P<0.01），表明在進行電針干預后，可以有效減緩 SE 小鼠認知、記憶及學習能力的障礙，并能在一定程度上促進 SE 后認知能力的改善。以上結果表明電針“百會”、“風府”對 SE 小鼠認知能力起到正向保護作用。
Caspase-3 是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族的成員，可通過外源性（死亡配體）和內源性（線粒體）途徑被激活，在細胞凋亡的執行階段起著核心作用[13-16]。該實驗結果顯示 SE 小鼠海馬區 Casepase-3 陽性細胞 IOD 表達異常增高（P<0.000 1），表明海馬神經元損傷，并進入病理性凋亡過程。給予電針針刺“百會”、“風府”后，與 SE 模型組相較，電針穴位組小鼠海馬區 Casepase-3 陽性細胞 IOD 表達降低（P<0.05），表明電針可以一定程度上通過拮抗 SE 模型小鼠海馬 Caspase-3 的激活來減緩細胞凋亡，保護癲癇導致的腦損傷。
MAP-2 是樹突棘發育過層中極為重要的骨架蛋白之一，可對神經元損傷后修復產生很重要的作用[17, 18]。電針對突觸可塑性均有良好的作用，我們之前的實驗表明 GRK5 和 MAP-2 協同參與癲癇中的樹突形成[19, 20]。癲癇會導致腦內細胞炎癥，產生炎性因子，損傷神經元和突觸結構，因此電針是否可以通過調控 MAP-2 來減輕癲癇損傷，促進神經元修復、認知記憶能力的改善具有探討意義。本課題實驗結果表明，SE 小鼠腦內 MAP-2 陽性細胞 IOD 降低，而在電針干預后，小鼠腦內 MAP-2 陽性細胞 IOD 有了明顯的回升，電針“百會”、“風府”對 SE 下小鼠神經元損傷后的修復產生了積極作用，促進微管蛋白的產生，穩定修復細胞骨架，保證細胞的完整性。
綜上所述，本研究表明電針干預可一定程度改善 SE 小鼠海馬神經元病理改變，并可能通過降低海馬區神經元凋亡，促進細胞骨架修復，拮抗 SE 對小鼠海馬神經元損傷，促進 SE 小鼠認知、學習記憶能力的改善。但是鑒于本課題并未設置非穴位組來作為治療對照組，且由于電針干預時間較短，無法檢測電針干預的長期效應。因此課題組將在后期進一步完善研究電針對 SE 模型小鼠腦損傷的作用。
癲癇是腦病中極為復雜且治療困難的疾病之一，其復發率高，嚴重影響患者正常生活，會引起難以恢復的認知記憶能力損傷，發展為癲癇持續狀態（Status epilepticus，SE）則更可能引起死亡。針灸防治癲癇在古代即有論述，具有良好療效，但因其多為醫家個案為主，并無系統總結，且由于其缺乏實驗支持，為現代醫學所懷疑。現代醫學對癲癇的定義是大腦神經元異常放電導致的反復性發作為特征的大腦功能失調綜合癥[1]。根據發作次數多少可以分為輕度和重度，國際抗癲癇聯盟（ILAE）2016 年根據其癲癇發作的不同情況，可分為局灶性、全面性、起源不明三大類[2]。隨著癲癇發作次數、時間等的增加，可導致患者出現行為運動、精神感覺、認知等多種功能障礙，對病患造成如睡眠障礙等一系列生活障礙，當單純癲癇發作進展為癲癇持續狀態則可能導致生命危險[3]。癲癇發病可能會引起腦部炎性損傷，炎癥因子進一步促進癲癇的發生，形成惡性循環，出現認知障礙等癥狀，其與海馬損傷聯系密切[4]。海馬為神經干細胞再生的重要場所，神經元的數目與認知正相關[5]。癲癇腦損傷可促使細胞表達凋亡蛋白（Caspase-3）導致神經元凋亡，凋亡促使細胞骨架的崩裂，微管相關蛋白 2（Microtubule-associated protein 2，MAP-2）為細胞骨架重要組成部分，本實驗通過免疫組織化學方法檢測 Caspase-3、MAP-2，探討電針穴位對癲癇持續狀態小鼠海馬神經元凋亡的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
雄性 C57BL/6J 小鼠 40 只，30 日齡；體重 18～23 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。本實驗通過河南中醫藥大學實驗動物倫理中心批準（倫理編號：DWLL17010033）。小鼠隨機數字表法分為：正常對照組（n=10，無電針、無鋰-匹羅卡品腹腔注射）、癲癇模型組（n=15，無電針，予鋰-匹羅卡品腹腔注射）、癲癇電針穴位組（n=15，電針針刺百會、風府，予鋰-匹羅卡品腹腔注射）。
1.2 主要儀器、試劑與藥品
主要儀器：旋轉石蠟切片機（Thermo，Finesse 325）、體視學顯微鏡（OLYMPUS，型號 DP73 ）、圖像分析系統（cell Sens dIMENSION 1.11，型號 H5ZDMVE8UPV）、電針刺激儀（上海華誼儀器制造廠，型號 G-6805）、全自動曠場實驗設備（淮北正華生物儀器設備有限公司，型號 Panlab smart，BS）。
試劑：anti-Caspase-3 antibody（美國 abcam）、anti-MAP-2 antibody（美國 abcam）、Goat anti-rabbit IgG（美國 abcam）、5% 多聚甲醛溶液（Solarbio）。
藥品：2% 戊巴比妥鈉、無水氯化鋰（批號 20160105）、匹羅卡品（批號 P441495）、鹽酸阿托品、地西泮、生理鹽水、5% 葡萄糖氯化鈉等。
1.3 鋰-匹羅卡品癲癇小鼠模型制備
在造模前小鼠腹腔注射無水氯化鋰（130 mg/kg），18～24 h 后注射鹽酸阿托品（1 mg/kg），30 min 后再注射匹羅卡品（150 mg/kg）。給藥小鼠在 15～30 min 后出現反復強直-陣攣發作，即 SE。癲癇發作依據 Racine 分級[6]進行評定。于 SE 后 90 min，腹腔注射地西泮（10 mg/kg），終止 SE，降低死亡率。若 30 min 后未出現癲癇發作的小鼠重復給予匹羅卡品（150 mg/kg），出現 SE 后 90 min 腹腔注射地西泮注射液（10 mg/kg）以終止 SE，如抗驚厥效果不佳可每隔 30 min 加 1 次地西泮，但所追加劑量不超過第 1 次注射劑量的 1/3；監測小鼠腦電圖（EEG）變化。空白對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，余同實驗組。SE 后 1 周內，每天給予 5% 葡萄糖氯化鈉 2.5 mL 腹腔注射 1 次以加強能量供給，并喂水 1～3 次，以防小鼠因缺水致死。
1.4 電針干預方法
參照余曙光，郭義注《實驗針灸學》[7]取百會：頂骨正中；風府：枕骨頂嵴后枕寰關節背凹陷處。分別取回路 1（百會、風府）、回路 2（雙側腎俞），用無菌針灸針（蘇州醫療用品廠 0.30 mm×13 mm）向后斜刺入皮下 1 mm 左右，連接電針儀并設置參數為：電壓 1.5 V，頻率 10 Hz，波寬 1 ms，針刺 30 min/次，1 次/d 連續針刺，每次 20 min，連續 7 d。
1.5 曠場實驗
電針針刺結束后，第 2 d 開始進行曠場實驗：將實驗小鼠依次放入敞箱內，敞箱為長 60 cm×寬 60 cm×高 50 cm，底部為定面積的 25 格，內壁為黑色。連續記錄 5 min 內小鼠穿越格數（穿越中心次數）、后肢站立次數（垂直得分）及修飾次數（小鼠雙手梳洗頭部及嘴部毛發）。每只小鼠實驗完成后采用 75% 酒精擦拭敞箱，再進行下一只實驗。記錄過程采用 Panlab Smart 記錄動物軌跡及分析。
新物體認知實驗于曠場實驗結束第 2 d 進行，敞箱規格同上，先放入完全相同的的物體 1（O1）和物體 2（O2），放入小鼠熟悉 5 min。然后將 O1 換為圓柱形盒子（O3），連續記錄 5 min 內小鼠在 O2、O3 時間。每只小鼠實驗完成后同樣采用 75% 酒精擦拭敞箱，再進行下一只實驗。記錄過程采用 Panlab Smart 記錄動物軌跡及分析，認知指數=O3/（O2+O3）。
1.6 取材
新物體實驗結束后，2% 戊巴比妥鈉（0.1 mL/10 g）深度麻醉小鼠，開胸暴露心臟，穿刺針經左心室穿刺至升主動脈，剪開右心耳，持續以 0.1 mol/L 的 PBS 液 （PH=7.4）30～40 mL 灌注沖洗血管約 10 min，直至右心耳流出液體變清亮，繼續灌注 5% 的多聚甲醛 35 mL，當小鼠四肢僵硬、牽拉不易、尾部翹起、肺臟及肝臟均變為蒼白色，即為灌注成功，再灌注 10 mL，然后斷頭，冰床上快速取腦。取出腦組織以 5% 多聚甲醛固定 1 周后，進行石蠟包埋。
1.7 HE 染色觀察海馬神經元病理改變
65℃ 恒溫箱烤片 2 h 后。常規脫蠟至水，流水沖洗 2 min；蘇木素復染 5 min，流水沖洗 2 min；1% 鹽酸乙醇 1s，流水沖洗 10 min，伊紅染色 1 min，流水沖洗 2 min，梯度脫水，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察拍片留存。
1.8 免疫組織化學檢測凋亡蛋白/微管相關蛋白 2
65℃ 恒溫箱烤片 2 h 后。常規脫蠟至水，組織上滴加 3% H2O2，室溫孵育 10 min，蒸餾水洗 3 次，每次 3 min；浸入檸檬酸鹽緩沖液，微波爐修復，自然放涼，PBS 洗 3 次，每次 3 min；滴加 10% 山羊血清封閉，37℃，30 min，甩去勿洗；滴加 Caspase-3（1∶80）/MAP-2（1∶50）一抗，置入 4℃ 冰箱，恒溫孵育過夜。次日冰箱取出，室溫 10 min，37℃，30 min。PBS 洗 3 次，每次 5 min；滴加 Goat anti-rabbit IgG（1∶100 ）/ 山羊抗小鼠 IgG（1∶50）二抗，37℃ 孵育 25 min。PBS 洗 3 次，每次 5 min；DAB 顯色，顯微鏡下觀察，流水沖洗 2～5 min；蘇木精復染 2～10 s，流水沖洗 5 min；梯度酒精脫水，中性樹膠二甲苯稀釋后封片。顯微鏡進行觀察拍片留存。
1.9 統計學方法
實驗數據采用 SPSS15.0 統計學軟件進行統計處理。定量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-t 法。檢驗水準 α 取 0.05，以 P 值<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
本次實驗造模，在注射藥物誘發 SE 過程中小鼠死亡 1 只；造模結束后第 2 d，小鼠死亡 5 只；第 3 d，小鼠死亡 6 只；第 4 d，小鼠死亡 2 只，第 5～7 d 無死亡。電針治療過程中無死亡，總死亡小鼠 14 只，死亡率 35%。
2.1 曠場及新物體認知實驗
與正常對照組相比，SE 模型組小鼠垂直次數、修飾次數和穿越中心次數均顯著提高，差異具有統計學意義（（P 均<0.000 1）。與 SE 模型組小鼠相比，電針穴位組小鼠垂直次數明顯提高，差異具有統計學意義（P<0.01）；修飾次數和穿越中心次數均有提高，差異具有統計學意義（P 均<0.05），見表 1，圖 1。
表1
電針干預癲癇持續狀態小鼠曠場實驗結果（
）
Table1.
Results of open field experiments (
)
圖1
各組小鼠曠場實驗統計圖
a. 垂直運動次數；b. 修飾次數；c. 穿越中心次數
Figure1. Open field experimental statistics grapha. times of rearing; b. times of modification; c. times of crossing
SE 模型組小鼠認知指數為（0.483±0.113），較正常對照組（0.879±0.035）顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.01）。電針穴位組小鼠認知指數 0.733±0.049，較 SE 模型組小鼠顯著提高，差異具有統計學意義（P<0.01），見圖 2。
圖2
各組小鼠新物體認知實驗統計圖
Figure2.
New object recognition experiments statistics graph
2.2 HE 檢測
與正常對照組相比，SE 模型組小鼠海馬區出現大量空泡狀神經元，細胞收縮，細胞核深染且有碎裂，染色質固縮，胞核腫脹增大，細胞整體結構模糊，發生濃縮。與 SE 模型組小鼠相比，電針穴位組海馬區神經元起泡較少，且細胞整體結構完整，邊界清晰，細胞排列良好（圖 3）。
圖3
各組小鼠海馬區齒狀回、CA1 區 HE 染色（×400）
a. 正常對照組 DG；b. SE 模型組 DG；c. 電針穴位組 DG；d. 正常對照組 CA1；e. SE 模型組 CA1；f. 電針穴位組 CA1
Figure3. The dentate gyrus CA1 area of hippocampus in each group of mice (×400)a. control group DG; b. SE model group DG; c. EA group DG; d. control group CA1; e. SE model group CA1; f. EA group CA1
2.3 免疫組織化學凋亡蛋白 Caspase-3 檢測
SE 模型組小鼠海馬區 Caspase-3 陽性細胞 IOD 值為（0.020±0.010），較正常對照組（0.016±0.008）顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.000 1）。電針穴位組小鼠 Caspase-3 陽性細胞 IOD 值為（0.013±0.007），較 SE 模型組小鼠顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖 4。
圖4
各組小鼠海馬區免疫組織化學凋亡蛋白 Caspase-3 陽性細胞表達（×400）
a. 正常對照組小鼠；b. SE 模型組小鼠；c. 電針穴位組小鼠；d. 各組海馬區 Caspase-3 陽性細胞表達 IOD 統計圖
Figure4. Expression of immunohistochemistry apoptosis protein positive cells in hippocampus of mice in each group（×400）a. control group; b. SE model group; c. EA group; d. the positive cells IOD statistics of each group in hippocampus
2.4 微管相關蛋白 2（MAP-2）檢測
SE 模型組小鼠海馬區 MAP-2 陽性細胞 IOD 值為（0.18±0.01），較正常對照組（0.27±0.02）顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。電針穴位組小鼠 MAP-2 陽性細胞 IOD 值為（0.25±0.03），較 SE 模型組小鼠顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖 5。
圖5
各組小鼠海馬區微管相關蛋白 2（MAP-2）陽性細胞表達（×400）
a. 正常對照組小鼠；b. SE 模型組小鼠；c. 電針穴位組小鼠；d. 各組海馬區 MAP-2 陽性細胞表達 IOD 統計圖
Figure5. Expression of MAP-2 positive cells in hippocampus of mice of each group（×400）a. control group; b. SE model group; c. EA group; d. the MAP-2 positive cells IOD statistics of each group in hippocampus
3 討論
“癲癇”、“癇證”在中醫為重要的腦部疾病之一，在先秦時期古人即對腦部功能有了一定認識，隨著腦的解剖、生理功能及其病因病機理論的發展，歷代先賢多將其歸為“風邪侵襲”、“先天腎氣不足”、“后天脾胃虛弱”、“肝腎風熱”等病因病機。據此，我們選取百會、風府兩穴進行電針干預。“百會”出自《針灸甲乙經》，又稱“三陽五會”，有開竅醒腦、回陽固本之功。分布著來自 C2 的枕大神經分支、來自三叉神經第一支的額神經。《現代針灸學理論與臨床應用》[8]：“百會”主治枕部、頸項部、膈肌等與該穴處在相關神經節段區內的組織器官疾病及腦部中樞的疾病。《備急千金方》認為百會可治療“狂癇不識人，癲病眩亂”“風府”出自《素問·氣府論第五十九》，功在清熱散風、通關開竅。分布著來自 C2 的枕大神經，來自 C3 的第三頸神經，深部為延髓和小腦。《針灸大成》言其為足太陽、督脈、陽維之會。百會為治療癲癇要穴，可以醒腦回陽；癲癇可因內風上擾發病，風府內外風皆可驅，兩穴相互為用，共奏治癲癇之功。
海馬損傷導致認知功能障礙，已有研究表明癲癇會對海馬神經元造成損傷[9-11]。本實驗運用曠場實驗及新物體認知實驗進行動物認知能力檢驗[12]，結果顯示：SE 模型組小鼠垂直運動、修飾次數、穿越次數均下降明顯（P 均<0.000 1），伴隨其認知能力顯著下降（P<0.01），表明 SE 對小鼠海馬造成損傷，導致其認知、記憶及學習能力降低。與 SE 模型組比較，電針穴位組小鼠垂直運動、修飾次數、穿越次數均有提高（P<0.01、P<0.05、P<0.05），對新物體的認知能力提高（P<0.01），表明在進行電針干預后，可以有效減緩 SE 小鼠認知、記憶及學習能力的障礙，并能在一定程度上促進 SE 后認知能力的改善。以上結果表明電針“百會”、“風府”對 SE 小鼠認知能力起到正向保護作用。
Caspase-3 是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族的成員，可通過外源性（死亡配體）和內源性（線粒體）途徑被激活，在細胞凋亡的執行階段起著核心作用[13-16]。該實驗結果顯示 SE 小鼠海馬區 Casepase-3 陽性細胞 IOD 表達異常增高（P<0.000 1），表明海馬神經元損傷，并進入病理性凋亡過程。給予電針針刺“百會”、“風府”后，與 SE 模型組相較，電針穴位組小鼠海馬區 Casepase-3 陽性細胞 IOD 表達降低（P<0.05），表明電針可以一定程度上通過拮抗 SE 模型小鼠海馬 Caspase-3 的激活來減緩細胞凋亡，保護癲癇導致的腦損傷。
MAP-2 是樹突棘發育過層中極為重要的骨架蛋白之一，可對神經元損傷后修復產生很重要的作用[17, 18]。電針對突觸可塑性均有良好的作用，我們之前的實驗表明 GRK5 和 MAP-2 協同參與癲癇中的樹突形成[19, 20]。癲癇會導致腦內細胞炎癥，產生炎性因子，損傷神經元和突觸結構，因此電針是否可以通過調控 MAP-2 來減輕癲癇損傷，促進神經元修復、認知記憶能力的改善具有探討意義。本課題實驗結果表明，SE 小鼠腦內 MAP-2 陽性細胞 IOD 降低，而在電針干預后，小鼠腦內 MAP-2 陽性細胞 IOD 有了明顯的回升，電針“百會”、“風府”對 SE 下小鼠神經元損傷后的修復產生了積極作用，促進微管蛋白的產生，穩定修復細胞骨架，保證細胞的完整性。
綜上所述，本研究表明電針干預可一定程度改善 SE 小鼠海馬神經元病理改變，并可能通過降低海馬區神經元凋亡，促進細胞骨架修復，拮抗 SE 對小鼠海馬神經元損傷，促進 SE 小鼠認知、學習記憶能力的改善。但是鑒于本課題并未設置非穴位組來作為治療對照組，且由于電針干預時間較短，無法檢測電針干預的長期效應。因此課題組將在后期進一步完善研究電針對 SE 模型小鼠腦損傷的作用。
