海馬硬化（Hippocampal sclerosis, HS）是難治性顳葉內側型癲癇中最常見的神經病理學改變。在研究中，分析了伴或不伴 HS 的顳葉內側癲癇患者齒狀顆粒細胞的基因表達譜，揭示下一代測序方法可以從小同源細胞群收集的 RNA 產生可解釋的基因組數據以及與 HS 相關的轉錄變化。手術切除伴或不伴有 HS 的顳葉內側癲癇患者的海馬，并通過激光捕獲顯微切割技術獲得手術切除海馬的齒狀顆粒細胞，從而提取 RNA，制備并擴增互補 DNA（cDNA）。對測序文庫進行測序，將所得測序讀數與參照基因組進行比對。差異表達分析用于確定伴或不伴 HS 患者之間的表達差異。結果發現，超過 90% 的 RNA-Seq 讀數與參考對齊。獲得的復樣轉錄譜之間存在高度一致性。主成分分析顯示，HS 的存在與否是數據差異的主要決定因素。HS 樣本中上調的基因中，參與氧化磷酸化的基因有顯著的富集。通過分析來自伴或不伴 HS 的顳葉內側癲癇患者的手術切除的海馬標本的齒狀顆粒細胞的基因表達譜，已經證明了下一代測序方法用于從小均勻細胞群產生生物學相關結果的實用性，并提供了與該病理學變化相關的轉錄變化的一些見解。
引用本文： Nicole G.Griffin, YuWang, Christine M.Hulette, 張穎穎 譯, 慕潔 審. 伴或不伴海馬硬化的顳葉內側癲癇患者齒狀顆粒細胞基因的差異表達分析. 癲癇雜志, 2018, 4(1): 72-80. doi: 10.7507/2096-0247.20180017 復制
海馬硬化（Hippocampal sclerosis，HS），也被稱為顳葉內側硬化（Mesial temporal sclerosis，MTS），是內側顳葉癲癇（Mesial temporal lobe epilepsy，MTLE）最常見的神經病理學改變。HS 可能與齒狀回中顆粒細胞分散和異常苔蘚纖維發芽有關，而且這些病理變化都伴隨著一系列的分子變化。在耐藥性顳葉癲癇手術治療中，HS 位于絕大多數患者的第三治療中心。HS 以海馬 CA1、CA3 和 CA4 區的神經元丟失及膠質細胞增生為主要特征。最近，越來越多的研究報道了齒狀回中發生的變化以及成人大腦中海馬神經發生的主要部位。
目前為止，許多研究已經證實了海馬細胞中分子變化與 MTLE 有關，而非特定的細胞群。這些研究報道了伴有 HS 的 MTLE 患者的 miR-218 和 miR-204 基因下調；這些 microRNAs （miRNAs）的靶基因參與軸突引導和突觸可塑性。也有研究報道表觀遺傳學中也有明顯的變化。Miller Delaney 等最近證明與對照組相比， TLE 患者基因甲基化涉及到海馬的突觸功能和離子通道；他們還注意到不同亞型的 HS 中存在著不同的甲基化譜，這也可以從選定的一組基因的差異表達中所體現。先前的研究已經注意到在 HS 中基因表達變化與幾個通路和處理過程有關；例如，HS 已經被證實與促凋亡基因過度表達有關，如 bcl-2 以及同時激活的幾個細胞存活通路。Johnson 等也表明與健康對照者相比，MTLE 患者的海馬存在炎性細胞因子激活和 Toll 樣受體（TLR）信號轉導通路；這些基因網絡涉及到了炎癥和癲癇。
在 MTLE-HS 中，齒狀回（Dentategyrus，DG）細胞的組織、行為和生長模式均有明顯的改變。其中一個標記是顆粒細胞分散，其特征是細胞密度的損失。另一個是異常的苔蘚纖維（軸突投射）出芽，導致了突觸的重組和促進了齒狀回內興奮性放電。研究者已經開始探究 MTLE-HS 中 DG 細胞的分子變化。在一個僅觀察 MTLE-HS 患者中 DG 細胞的 miRNA 表達譜的研究中，與不伴有顆粒細胞病理改變的患者相比；研究者發現伴有顆粒細胞病理改變的患者的 mir-1234、mir1281、mir-30c-1、miR-92b、mir-191 和 mir-1238 存在著高表達。這篇文章的目的是在 DG 細胞水平上通過評估 mRNA 的表達譜與是否有 HS 的相關性來擴展先前研究的結果。
通過檢測與 DG 細胞中與 HS 相關的基因表達的改變，本研究旨在揭示與攜帶某種特殊的 HS 相關病例改變的某種細胞亞型與 HS 存在聯系的分子的變化，我們假設不同于不伴 HS 的 MTLE，MTLE-HS 可能存在分子上的改變，也可能是病理生理學得改變。鑒于伴有 HS 的齒狀回顆粒細胞的組織和行為的明顯變化，它是可能的，在 DG 細胞中具體的病理變化可以通過僅在這些細胞中發生的分子變化來解釋，而這些變化可能在分析研究整個海馬標本時被忽視。因此，RNA 序列被用來評估手術切除海馬中的 DG 細胞的轉錄組，納入的 MTLE 患者中有 5 例伴有 HS，7 例則無。除了提供與 HS 相關的基因表達變化的觀點外，這項研究還證明了下一代測序方法能夠從少量的同質細胞群中得出可解釋的、可重復的和可能的生物學相關結果。
1 資料與方法
1.1 納入患者和標本收集
在杜克大學醫學院機構審查委員會批準的情況下，我們收集了 12 例在杜克大學接受癲癇手術治療患者的手術切除海馬標本，每例患者和/或其監護人簽寫了書面知情同意書。所有患者均由同一名神經外科醫生在沒有進行從后緣向鉤回進行燒灼的情況下執行的整體切除手術。取一份皮質標本和一部分海馬組織用作常規病理分析。手術切除后立即取一份相鄰的含有 DG 的海馬組織，并立即在–80℃ 的液氮中冷藏。然后有順序的包埋在最佳切割溫度（Opitonal cutting temperature，OCT）化合物中，并在干冰上冷凍。將冷凍標本在–18℃ 的低溫恒溫器上連續切成 8 μm 的切片，置于無菌正電荷防脫載玻片上。這些切片立即由 95% 乙醇固定 30 s，然后用 75% 乙醇洗脫 30 s 以除去 OCT。染色時切片在 75% 乙醇中用 1% 甲酚紫染色 30 s，并分別于 75% 和 95% 乙醇中脫水 30 s，100% 乙醇中脫水 30 s（×2），二甲苯脫水 5 min。在激光捕獲顯微切割（Laser capture microdissection，LCM）之前，將染色的 DG 細胞在倒置光學顯微鏡下顯像并鑒定。圖 1 說明在本研究中使用的代表性海馬組織標本中 DG 細胞的位置，并展示了 LCM 后的這些細胞。使用 Veritas LCM 儀器（分子裝置）對每個樣品進行純 DG 細胞的顯微切割，并在每個重復的 30 min 內使用紅外激光系統在 CapSure Macro LCM 帽上收獲約 800～1 000 個 DG 細胞。將含有捕獲的純 DG 細胞的 LCM 大帽立即置于具有 50μL 裂解緩沖液的 0.5mL 微量離心管中。將微量離心管在 42℃ 培養箱中倒置 30 min 以提取 RNA，并在–80℃ 下儲存直到 RNA 分離。對于每個患者，通過術前核磁共振（MRI）和切除組織中鄰近顯微切開標本部分組織的術后組織病理學檢查來確認 HS 存在與否。
圖1
內側顳葉癲癇患者手術切除的海馬組織齒狀顆粒細胞的激光捕獲顯微切割（LCM） （×10）
a. 海馬組織切片，甲酚紫染色后的齒狀顆粒細胞；b. 激光捕獲顯微切割（LCM）后相同組織切片；c. 捕獲到的齒狀顆粒細胞
1.2 RNA 測序
使用 ARCTURUS PicoPure RNA 分離試劑盒從收獲的 DG 細胞中提取總 RNA，并使用 2100 Agilent Bioanalyzer 6000 Pico 測定法確定 RNA 完整編號（RNA integrity numbers，RIN）。根據制造商的說明書，使用 Clontech SMARTer Ultra Low RNA Kit 擴增總 RNA。然后使用 TruSeq RNA 樣品制備試劑盒制備測序文庫。一起準備兩個樣本的 RNA 測序文庫，然后在 IlluminaHiSeq 2000 的一個泳道上進行多重復合。對于測序比對，先去除測序銜接子，將配對末端測序讀數與 TopHat2 對照，并通過 Cufflinks 軟件來組裝轉錄本。
1.3 主成分分析
使用 Sva 軟件包（版本 3.1.1）中的 comBat 函數計算批處理效果，然后在 R 軟件環境中使用的 DESeq2 軟件包（版本 3.1.2）來進行主成分分析（PCA）。具體來說，comBat 函數用于通過將批處理效應作為協變量計算出來，對來自最大差異的 500 個基因的原始讀數計數產生一組轉換的讀數；然后使用該變換后的數據集在 DESeq2 中創建一個計數矩陣。并將這些數據用 rld 函數進行 log 變換，并傳遞給 plotPCA 函數，以生成前兩個主成分的 PCA 圖。
1.4 差異表達分析
在 R 語言中使用 EdgeR 軟件包（版本 3.1.2），根據 EdgeR 手冊中第 1.4 節描述的廣義線性模型進行差分表達分析。首先，將重復測序文庫的測序讀數合并，以產生每個樣品的單一測序讀數，使用 Subread 軟件（版本 1.4.6）計算每個基因的原始讀數計數，并在 EdgeR 中產生一個 DGEList 對象。只有在所有樣品中至少讀取一次，基因才會被包括進來，這樣產生了 12 605 個基因的表達數據集。calcNorm Factors 函數用于說明每個樣本的庫大小的差異，并建立了由批次和 HS 狀態（HS 是否存在）組成的實驗設計模型。然后使用 estimate GLM Common Disp、estimate GLM Trended Disp）、estimate GLM Tag wise Disp 函數來分別計算表達式數據的普遍性，趨勢和標簽色分散。考慮到研究設計模型中提供的變異來源作為廣義線性模型，使用校正的 Cox-Reid 輪廓似然模型計算這些分散體。給定分散和廣義線性模型，使用 glmFit 函數對每個基因擬合負二項模型。最后，用 glmLRT 函數計算出模型的表達差異的統計學意義，將研究實驗模型的擬合與似然比檢驗的空模型進行比較。具有在兩種表型之間的折疊變化>|1.5|且校正的假發現率（False discovery rate，FDR）P 值<0.05 的基因被認為表達具有統計學意義，因為這些截止值已被證明可以平衡 edgeR 算法的特異性和靈敏度。將P 值最小的 50 個基因在 R 語言中生成熱圖。如前所述，通過 Sva 包批處理效果后，在 EdgeR 中使用 cpm 函數生成熱圖的數據。考慮到每個樣本庫大小的變化，cpm 函數計算每百萬次讀取發生的每個基因的測序讀數的 log2 轉換值。
1.5 基因功能分析
使用 PANTHER Over representation Test （版本 20150430）分析了差異表達轉錄的列表，以豐富 GO 術語，該測試訪問了 2015-08-06 發布的 GO 本體數據庫。使用了分子過程、細胞組分和生物過程注釋數據庫。
1.6 路徑分析
共同表達基因簇通過分別在伴有和不伴有 HS 的樣品中分析方差最大的 500 個轉錄物來定義，這一過程在 R 軟件中使用 Hopach 包（3.1.1 版本）實現。與不伴有 HS 樣本產生的簇相比其同一性<50% 的伴有 HS 樣本的最大共表達基因簇的基因列表與所有京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路的列表進行比較，并通過超幾何概率檢驗計算特定通路的濃縮的意義，并用 Bonferroni 校正進行多次測試。校正超幾何概率檢驗的樣本大小以解釋表達數據集的基因數量。
1.7 定量實時聚合酶鏈反應證實 RNA-Seq 表達
如上所述提取來自 DG 細胞的 RNA，用 ArcturusRiboAmp HS PLUS RNA 擴增試劑盒產生 cDNA，并根據制造商的說明書隨機引發第一鏈 cDNA 合成。在 ABI 7900 系統中使用 TaqMan 引物進行 qRT-PCR 擴增，并采用 β-actin 的 TaqMan 引物作為內源對照。使用以下轉錄物的引物：ARHGAP36、CDKN1C、CTGF、ELAVL2、GAD1、IL8、KCNIP2、KIT、QPCT 和 SV2C。所有測定分成兩份進行。我們使用 ΔΔCt 方法來量化具有和不具有 HS 個體的轉錄本相對表達。將與內參 β-actin 進行規范化處理后的轉錄物表達水平與無 HS 患者的轉錄本的平均表達水平進行標準化。
1.8 統計學方法
使用 p.adjust 函數“fdr”方法，在 edgeR 中用負二項模型計算差異表達分析報告的 P 值，并在 R 軟件中使用 p.adjus t（）函數進行多次測試。通過超幾何概率分布計算路徑分析報告的 P 值，并使用 Bonferroni 校正進行多次測試。使用單側 Student'st 檢驗計算 qRT-PCR 確認報告的 P 值。
2 結果
本研究納入 12 例 MTLE 患者，其臨床特征見表 1。所有患者均為歐洲血統。所有患者年齡為（38±12）歲，其中伴 HS 患者為（39±9）歲，病理證實無 HS 的患者為（38±14）歲。在 5 例伴有 HS 患者中，2 例為男性，3 例為女性；7 例無 HS 患者中，4 例為男性，3 例為女性。
表1
伴或不伴海馬硬化的顳葉內側癲癇患者的臨床特點
6 例患者伴有皮質發育不良，其中 4 例不伴 HS（MTLE-2，MTLE-4，MTLE-10，MTLE-12），2 例有 HS（MTLE-5-HS 和 MTLE-8-HS）。另 1 例 HS 患者即 MTLE-3-HS 顳葉側部具有由亞急性梗死引起的混合型腦膜炎和腦血管炎。在 MTLE-1-HS 和 MTLE-5-HS 患者中觀察到顆粒細胞分散，而所有不伴 HS 患者的腦組織中則不明顯。用于神經病理學的標本使用蘇木精和伊紅染色。如果在初步審查后懷疑皮質發育異常，則使用免疫組織化學分析神經元特異性核蛋白（Neuron-spedific nuclear protein，Neu N）和膠質纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）。未評估苔蘚纖維發芽。圖 S1（參見原文鏈接）包括了所有標本的神經病理圖像。
每個樣品的重復測序轉錄譜之間的一致性很高，分成一式兩份的 10 個海馬標本之間的平均相關系數轉錄表達水平>95%。12 例患者中有 2 例在第二次捕獲中沒有獲得足夠量的 cDNA 用于測序。每個測序運行獲得了約 800 萬條高質量的測序讀數，并且這些讀數的 90% 與參考基因組相對應。如果在所有 12 個樣品中存在至少 1 個測序讀數，則該轉錄本包括在差異表達分析中，最終得到了 12 605 個基因用于差異表達分析。
在進行差異表達分析之前，用最大方差的 500 個轉錄本進行 PCA，以確定批次效應校正后數據中最大的方差來源。第一個 PC 占表達數據方差的 82%（圖 2），根據伴或不伴 HS 將樣本分成兩組，表明表達數據的差異主要表現在海馬病理學上。
圖2
表達差異最大的 500個基因的前 2 個主成分分析圖
紅點代表伴有HS 樣品，綠色代表不伴HS 樣品，HS 的存在與否是表達數據差異的主要決定因素
接下來，通過構建占主導批次效應的廣義線性模型，在邊緣 R 中進行差分表達分析數據技術變化的來源以及 HS 的存在，這是數據中生物變異的主要來源。考慮到庫的大小和過度分散的差異，邊緣 R 包被設計為適合原始讀取計數的負二項模型；由于平均基因水平更加高度表達，表達數據的變化往往更大。通過計算每個基因的分散體，邊緣 R 減少了基因被視為差異表達的可能性，這是數據中存在異常值的結果。然后將廣義線性模型的負二項模型的擬合與使用似然比檢驗的負二項模型的擬合進行比較，以確定基因是否表達差異。因此，EdgeR 包適用于具有有限生物復制的數據集的差異表達分析，因為它減少了異常值和數據中過度分散的影響。在我們的數據中，與不伴 HS 患者相比，HS 患者標本中 55 個轉錄物顯著上調（表達增加 1.5 倍，FDR 調整 P<0.05），11 個轉錄物顯著下調（表達下降 1.5 倍，FDR 調整的P<0.05）。50 個最具有統計學意義的基因用于制作熱圖，其中 HS 的樣品再次聚集在一起，不伴 HS 的樣品則分離（圖 3）。HS 樣品中 10 個最具有顯著差異上調的基因是 CDKN1C、SV2C、PCSK1、SCRN1、KIAA1217、ELAVL2、GNG4、QPCT、KIT 和 STRIP2（表 2 a）。HS 樣品中最具有顯著差異的下調基因是 ANKRD20A19P、FST、ANO3、GRM2、ATP2B4、RP11-369E15.3、SLC3A1、JAG1、GNAL、PCP4 和 SLC5A12（表 2 b）。為了確認通過 RNA 測序檢測到的表達差異，所有一式兩份的樣品均對 10 個選擇的轉錄物（ARHGAP36、CDKN1C、CTGF、ELAVL2、GAD1、IL8、KCNIP2、KIT、QPCT 和 SV2C）進行 qRT-PCR。
圖3
海馬硬化中差異表達基因熱圖
樣品根據 HS 的存在與否聚類，紅色表示低水平表達，藍色表示高水平表達
表2
最大差異表達基因
對于所有 t10 轉錄物，伴 HS 與不伴 HS 樣品之間的存在表達差異（圖 S2 參見原文鏈接）。在 HS 顯著上調的基因中，其中有與凋亡相關的基因（BCL2）、PI3K-Akt 通路（TLR4，KIT，GNG4和LAMA2）、γ-氨基丁酸（GABA）、能量突觸（GNG4和GAD2）和河馬信號通路（CTGF和FZD7）。GO 本體論分析表明與質膜表達相關的基因有意義的聚集（P=0.02），并涉及多細胞生物過程的陽性調節（P=0.04）。
表3
伴有海馬硬化的樣品中的 C 簇中顯著富集途徑
為了更系統地確定哪些途徑可能在 HS 中發揮作用，使用聚類算法來鑒定共表達基因組。通過尋找在 HS 樣品中共表達但不在非 HS 樣品中共表達的大量基因簇，我們能夠確定出一個與 HS 樣本的轉錄組分不同的基因網絡。對具有最大方差的 500 個基因的原始讀數進行歸一化，并在 EdgeR 中進行對數轉換以減少過度分散。從不伴 HS 樣品的這些基因的表達數據中，分別出現了由 252、141 和 61 個基因組成的3個不同的共表達簇，這些基因分別由 1～3 個組成。對于具有 HS 的樣品，分別鑒定了由 143、95、68、29 和 24 個基因組成的共表達基因簇（以下為 A～E）。由于 HS 和非 HS 樣本中集群 A 與集群 1 具有較高的一致性，因此被排除在進一步分析之外。將剩余簇的基因列表與包含 KEGG 途徑的基因列表進行比較，以確定是否有任何特定途徑具有顯著的富集。在 C 組 68 個基因中，7 個參與氧化磷酸化的基因（hsa00190；P=5.12×10–5）：NDUFA5、ATP5C1、ATP6V0D1、ATP5A1、ATP6V1A、ATP6V1B2 和 ATP5B。此外，5 個基因參與了另一種能量生成途徑，即糖酵解/糖異生途徑（hsa00010；P=5.41×10–4）：ENO1、TPI1、PKM、GAPDH 和 LDHA。除了 ENO1 外，與不伴 HS 樣本相比，HS 樣本中中 12 個基因都表現為上調，但差異不具有統計學意義。與神經退行相關的兩種 KEGG 通路也有顯著富集：阿爾茨海默病（hsa05010；P=7.12×10–3）和帕金森病（hsa05012；P=0.025 8），分別說明了 C 簇中的 6 個和 5 個基因。與這兩種途徑相關的基因列表和前面描述的兩種能量產生途徑之間存在明顯重疊。阿爾茨海默病途徑中的基因是 NDUFA5、ATP5C1、ATP5A1、GAPDH、SNCA 和 ATP5B，帕金森病途徑中的基因為 NDUFA5、ATP5C1、ATP5B、SNCA 和 ATP5A1。簇 C 也富集了參與突觸小泡循環的基因（hsa04721；P=1.24 ×10–3）；這些基因分別是 CTLC、AP2M1、ATP6V1B2、ATP6V01 和 ATP6V1A。其中 2 個也與氧化磷酸化途徑有關。
3 討論
在本研究中，我們對伴 HS 和不伴 HS 的 MTLE 患者的 DG 細胞進行了 RNA 測序，以說明與該病理學相關的分子變化的特點。差異表達分析表明，HS 與不伴相比，55 個轉錄本顯著上調，11 個轉錄本顯著下調。
特別地關注于 DG 細胞，使與 HS 有關的關鍵細胞類型的 HS 相關基因表達變化的分析，比之前對 TLE 中整個海馬組織的分析進行了更高分辨率的評估。在一些病例中發現，DG 細胞與海馬組織活檢樣品具有相似的基因表達變化，而在另一些病例中，我們也觀察到了新的關聯。與之前研究一致，該途徑中的其他 4 個基因（KIT、GNG4、TLR4 和 LAMA2）在 HS 樣品中顯著上調。該途徑的作用已經在皮層發育畸形中得到證實，最近發現該途徑也涉及 MTLE 的發病機制。Xiao 等在原代培養的海馬神經元中誘導與 IL-1 相關的炎癥反應，該炎癥反應被癲癇發作所激活，并在癲癇患者的海馬中高度表達，然后通過引入 PI3K-Akt-mTOR 途徑的抑制劑來抑制這種炎癥反應。研究人員還觀察到 MTLE 患者海馬組織樣本中 p-Akt 水平升高。在本研究中，伴有 HS 的 MTLE 患者的 DG 細胞中 FOS、KIT、GNG4、TLR4和LAMA2 的上調為 PI3K-Akt-mTOR 通路在該病中的作用提供了額外的證據。我們的研究支持先前癲癇動物模型中有關 HS 的過程參與提供了支持。Elliott 等在癲癇大鼠模型中證實了 25 個關于發育和癲癇發生差異調節的基因。由于動物和人類的固有差異以及癲癇類型的差異，我們沒有必要預測個別基因在數據集中受到差異性調節，但這些研究者確實在 MTLE-HS 患者的 DG 細胞中觀察到 NPY 基因的顯著上調。Elliot 等在研究中注意到癲癇發作后 NPY 的表達在 DG 細胞中顯著上調，而且是神經元興奮的調節劑。
本研究還證實了在 HS 中氧化磷酸化和糖酵解與糖異生作用增強。盡管氧化磷酸化產生 ATP，但該過程也導致了活性氧（ROS）的產生。如果氧化磷酸化增強以滿足涉及癲癇發作時神經元的過度能量需求，這也將增加神經元內 ROS 的水平，從而導致氧化應激。雖然由于這些分子的不穩定性從而難以評估人體組織中的 ROS 水平，但有證據表明 HS 患者的海馬組織中存在氧化應激。Ristic 等通過除去 ROS 的 HS 樣品中的抗氧化酶活性顯著升高，證實了伴有 HS 的癲癇患者的海馬組織中存在氧化應激。我們的研究結果進一步補充了一個上調基因的網絡可能有助于 HS 患者海馬組織中特別是在 DG 細胞中 ROS 的產生這一發現。
通過基于簇的分析發現在 HS 中還涉及到了突觸小泡循環的過程。簇 C 中參與突觸小泡循環的基因（hsa04721；P=1.249×10–3）包括 CTLC、AP2M1、ATP6V1B2、ATP6V0D1 和 ATP6V1A。Winden 等在癲癇的毛果蕓香堿模型中檢測到 DG 的癲癇發生和相鄰的非致癇因區域，并證實了突觸過程豐富的共表達基因網絡。在 C 簇中也發現了這個網絡中的兩個基因，即 SDCBP 和 NBEA。
miRNA 以轉錄后的方式調控基因表達，一個研究證實 miR-218 和 miR-204 在 HS 患者的海馬組織中下調。與這些發現一致，我們的研究表明已經被歸類為 miR-204 的靶基因的幾個基因包括 BCL2、SOX4 和 ARHGAP29 在 HS 患者的 DG 細胞中顯著上調。
在本研究中，HS 樣品中下調的基因（包括 ANO3 和 GNAL）已被證明為共表達基因。在海馬中高度表達的 ANO3 基因及其變體與高熱驚厥有關。此外來自 Ano3-null 大鼠的海馬 CA1 錐體神經元表現出超興奮性。HS 中 ANO3 基因的下調可能促進發展為 HS 患者的過度興奮和癲癇發作活動。觀察體外確定的特定基因表達變化的影響研究證實了本研究，這可能幫助回答了長期以來在伴有 HS 的 MTLE 患者關于病理學改變到底是促進癲癇發作還是癲癇發作結果的爭論。
總之，目前研究表明，下一代測序方法可以從小的細胞群中產生可解釋、可重復和可能與生物相關的基因表達數據。這種方法已經開始闡明 DG 細胞中與 HS 相關基因表達的變化，并且為更多的 MTLE 患者群體研究提供了基礎，其中包括患者特殊因素，如發病年齡、癲癇發作類型和嚴重程度，以及抗癲癇藥物治療，以更好地了解 HS 的病理生理學變化。仍需進一步研究以了解特定轉錄物和轉錄物網絡差異表達的影響，了解其對神經元興奮性，顆粒細胞病理學變化和癲癇發生的影響。
海馬硬化（Hippocampal sclerosis，HS），也被稱為顳葉內側硬化（Mesial temporal sclerosis，MTS），是內側顳葉癲癇（Mesial temporal lobe epilepsy，MTLE）最常見的神經病理學改變。HS 可能與齒狀回中顆粒細胞分散和異常苔蘚纖維發芽有關，而且這些病理變化都伴隨著一系列的分子變化。在耐藥性顳葉癲癇手術治療中，HS 位于絕大多數患者的第三治療中心。HS 以海馬 CA1、CA3 和 CA4 區的神經元丟失及膠質細胞增生為主要特征。最近，越來越多的研究報道了齒狀回中發生的變化以及成人大腦中海馬神經發生的主要部位。
目前為止，許多研究已經證實了海馬細胞中分子變化與 MTLE 有關，而非特定的細胞群。這些研究報道了伴有 HS 的 MTLE 患者的 miR-218 和 miR-204 基因下調；這些 microRNAs （miRNAs）的靶基因參與軸突引導和突觸可塑性。也有研究報道表觀遺傳學中也有明顯的變化。Miller Delaney 等最近證明與對照組相比， TLE 患者基因甲基化涉及到海馬的突觸功能和離子通道；他們還注意到不同亞型的 HS 中存在著不同的甲基化譜，這也可以從選定的一組基因的差異表達中所體現。先前的研究已經注意到在 HS 中基因表達變化與幾個通路和處理過程有關；例如，HS 已經被證實與促凋亡基因過度表達有關，如 bcl-2 以及同時激活的幾個細胞存活通路。Johnson 等也表明與健康對照者相比，MTLE 患者的海馬存在炎性細胞因子激活和 Toll 樣受體（TLR）信號轉導通路；這些基因網絡涉及到了炎癥和癲癇。
在 MTLE-HS 中，齒狀回（Dentategyrus，DG）細胞的組織、行為和生長模式均有明顯的改變。其中一個標記是顆粒細胞分散，其特征是細胞密度的損失。另一個是異常的苔蘚纖維（軸突投射）出芽，導致了突觸的重組和促進了齒狀回內興奮性放電。研究者已經開始探究 MTLE-HS 中 DG 細胞的分子變化。在一個僅觀察 MTLE-HS 患者中 DG 細胞的 miRNA 表達譜的研究中，與不伴有顆粒細胞病理改變的患者相比；研究者發現伴有顆粒細胞病理改變的患者的 mir-1234、mir1281、mir-30c-1、miR-92b、mir-191 和 mir-1238 存在著高表達。這篇文章的目的是在 DG 細胞水平上通過評估 mRNA 的表達譜與是否有 HS 的相關性來擴展先前研究的結果。
通過檢測與 DG 細胞中與 HS 相關的基因表達的改變，本研究旨在揭示與攜帶某種特殊的 HS 相關病例改變的某種細胞亞型與 HS 存在聯系的分子的變化，我們假設不同于不伴 HS 的 MTLE，MTLE-HS 可能存在分子上的改變，也可能是病理生理學得改變。鑒于伴有 HS 的齒狀回顆粒細胞的組織和行為的明顯變化，它是可能的，在 DG 細胞中具體的病理變化可以通過僅在這些細胞中發生的分子變化來解釋，而這些變化可能在分析研究整個海馬標本時被忽視。因此，RNA 序列被用來評估手術切除海馬中的 DG 細胞的轉錄組，納入的 MTLE 患者中有 5 例伴有 HS，7 例則無。除了提供與 HS 相關的基因表達變化的觀點外，這項研究還證明了下一代測序方法能夠從少量的同質細胞群中得出可解釋的、可重復的和可能的生物學相關結果。
1 資料與方法
1.1 納入患者和標本收集
在杜克大學醫學院機構審查委員會批準的情況下，我們收集了 12 例在杜克大學接受癲癇手術治療患者的手術切除海馬標本，每例患者和/或其監護人簽寫了書面知情同意書。所有患者均由同一名神經外科醫生在沒有進行從后緣向鉤回進行燒灼的情況下執行的整體切除手術。取一份皮質標本和一部分海馬組織用作常規病理分析。手術切除后立即取一份相鄰的含有 DG 的海馬組織，并立即在–80℃ 的液氮中冷藏。然后有順序的包埋在最佳切割溫度（Opitonal cutting temperature，OCT）化合物中，并在干冰上冷凍。將冷凍標本在–18℃ 的低溫恒溫器上連續切成 8 μm 的切片，置于無菌正電荷防脫載玻片上。這些切片立即由 95% 乙醇固定 30 s，然后用 75% 乙醇洗脫 30 s 以除去 OCT。染色時切片在 75% 乙醇中用 1% 甲酚紫染色 30 s，并分別于 75% 和 95% 乙醇中脫水 30 s，100% 乙醇中脫水 30 s（×2），二甲苯脫水 5 min。在激光捕獲顯微切割（Laser capture microdissection，LCM）之前，將染色的 DG 細胞在倒置光學顯微鏡下顯像并鑒定。圖 1 說明在本研究中使用的代表性海馬組織標本中 DG 細胞的位置，并展示了 LCM 后的這些細胞。使用 Veritas LCM 儀器（分子裝置）對每個樣品進行純 DG 細胞的顯微切割，并在每個重復的 30 min 內使用紅外激光系統在 CapSure Macro LCM 帽上收獲約 800～1 000 個 DG 細胞。將含有捕獲的純 DG 細胞的 LCM 大帽立即置于具有 50μL 裂解緩沖液的 0.5mL 微量離心管中。將微量離心管在 42℃ 培養箱中倒置 30 min 以提取 RNA，并在–80℃ 下儲存直到 RNA 分離。對于每個患者，通過術前核磁共振（MRI）和切除組織中鄰近顯微切開標本部分組織的術后組織病理學檢查來確認 HS 存在與否。
圖1
內側顳葉癲癇患者手術切除的海馬組織齒狀顆粒細胞的激光捕獲顯微切割（LCM） （×10）
a. 海馬組織切片，甲酚紫染色后的齒狀顆粒細胞；b. 激光捕獲顯微切割（LCM）后相同組織切片；c. 捕獲到的齒狀顆粒細胞
1.2 RNA 測序
使用 ARCTURUS PicoPure RNA 分離試劑盒從收獲的 DG 細胞中提取總 RNA，并使用 2100 Agilent Bioanalyzer 6000 Pico 測定法確定 RNA 完整編號（RNA integrity numbers，RIN）。根據制造商的說明書，使用 Clontech SMARTer Ultra Low RNA Kit 擴增總 RNA。然后使用 TruSeq RNA 樣品制備試劑盒制備測序文庫。一起準備兩個樣本的 RNA 測序文庫，然后在 IlluminaHiSeq 2000 的一個泳道上進行多重復合。對于測序比對，先去除測序銜接子，將配對末端測序讀數與 TopHat2 對照，并通過 Cufflinks 軟件來組裝轉錄本。
1.3 主成分分析
使用 Sva 軟件包（版本 3.1.1）中的 comBat 函數計算批處理效果，然后在 R 軟件環境中使用的 DESeq2 軟件包（版本 3.1.2）來進行主成分分析（PCA）。具體來說，comBat 函數用于通過將批處理效應作為協變量計算出來，對來自最大差異的 500 個基因的原始讀數計數產生一組轉換的讀數；然后使用該變換后的數據集在 DESeq2 中創建一個計數矩陣。并將這些數據用 rld 函數進行 log 變換，并傳遞給 plotPCA 函數，以生成前兩個主成分的 PCA 圖。
1.4 差異表達分析
在 R 語言中使用 EdgeR 軟件包（版本 3.1.2），根據 EdgeR 手冊中第 1.4 節描述的廣義線性模型進行差分表達分析。首先，將重復測序文庫的測序讀數合并，以產生每個樣品的單一測序讀數，使用 Subread 軟件（版本 1.4.6）計算每個基因的原始讀數計數，并在 EdgeR 中產生一個 DGEList 對象。只有在所有樣品中至少讀取一次，基因才會被包括進來，這樣產生了 12 605 個基因的表達數據集。calcNorm Factors 函數用于說明每個樣本的庫大小的差異，并建立了由批次和 HS 狀態（HS 是否存在）組成的實驗設計模型。然后使用 estimate GLM Common Disp、estimate GLM Trended Disp）、estimate GLM Tag wise Disp 函數來分別計算表達式數據的普遍性，趨勢和標簽色分散。考慮到研究設計模型中提供的變異來源作為廣義線性模型，使用校正的 Cox-Reid 輪廓似然模型計算這些分散體。給定分散和廣義線性模型，使用 glmFit 函數對每個基因擬合負二項模型。最后，用 glmLRT 函數計算出模型的表達差異的統計學意義，將研究實驗模型的擬合與似然比檢驗的空模型進行比較。具有在兩種表型之間的折疊變化>|1.5|且校正的假發現率（False discovery rate，FDR）P 值<0.05 的基因被認為表達具有統計學意義，因為這些截止值已被證明可以平衡 edgeR 算法的特異性和靈敏度。將P 值最小的 50 個基因在 R 語言中生成熱圖。如前所述，通過 Sva 包批處理效果后，在 EdgeR 中使用 cpm 函數生成熱圖的數據。考慮到每個樣本庫大小的變化，cpm 函數計算每百萬次讀取發生的每個基因的測序讀數的 log2 轉換值。
1.5 基因功能分析
使用 PANTHER Over representation Test （版本 20150430）分析了差異表達轉錄的列表，以豐富 GO 術語，該測試訪問了 2015-08-06 發布的 GO 本體數據庫。使用了分子過程、細胞組分和生物過程注釋數據庫。
1.6 路徑分析
共同表達基因簇通過分別在伴有和不伴有 HS 的樣品中分析方差最大的 500 個轉錄物來定義，這一過程在 R 軟件中使用 Hopach 包（3.1.1 版本）實現。與不伴有 HS 樣本產生的簇相比其同一性<50% 的伴有 HS 樣本的最大共表達基因簇的基因列表與所有京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路的列表進行比較，并通過超幾何概率檢驗計算特定通路的濃縮的意義，并用 Bonferroni 校正進行多次測試。校正超幾何概率檢驗的樣本大小以解釋表達數據集的基因數量。
1.7 定量實時聚合酶鏈反應證實 RNA-Seq 表達
如上所述提取來自 DG 細胞的 RNA，用 ArcturusRiboAmp HS PLUS RNA 擴增試劑盒產生 cDNA，并根據制造商的說明書隨機引發第一鏈 cDNA 合成。在 ABI 7900 系統中使用 TaqMan 引物進行 qRT-PCR 擴增，并采用 β-actin 的 TaqMan 引物作為內源對照。使用以下轉錄物的引物：ARHGAP36、CDKN1C、CTGF、ELAVL2、GAD1、IL8、KCNIP2、KIT、QPCT 和 SV2C。所有測定分成兩份進行。我們使用 ΔΔCt 方法來量化具有和不具有 HS 個體的轉錄本相對表達。將與內參 β-actin 進行規范化處理后的轉錄物表達水平與無 HS 患者的轉錄本的平均表達水平進行標準化。
1.8 統計學方法
使用 p.adjust 函數“fdr”方法，在 edgeR 中用負二項模型計算差異表達分析報告的 P 值，并在 R 軟件中使用 p.adjus t（）函數進行多次測試。通過超幾何概率分布計算路徑分析報告的 P 值，并使用 Bonferroni 校正進行多次測試。使用單側 Student'st 檢驗計算 qRT-PCR 確認報告的 P 值。
2 結果
本研究納入 12 例 MTLE 患者，其臨床特征見表 1。所有患者均為歐洲血統。所有患者年齡為（38±12）歲，其中伴 HS 患者為（39±9）歲，病理證實無 HS 的患者為（38±14）歲。在 5 例伴有 HS 患者中，2 例為男性，3 例為女性；7 例無 HS 患者中，4 例為男性，3 例為女性。
表1
伴或不伴海馬硬化的顳葉內側癲癇患者的臨床特點
6 例患者伴有皮質發育不良，其中 4 例不伴 HS（MTLE-2，MTLE-4，MTLE-10，MTLE-12），2 例有 HS（MTLE-5-HS 和 MTLE-8-HS）。另 1 例 HS 患者即 MTLE-3-HS 顳葉側部具有由亞急性梗死引起的混合型腦膜炎和腦血管炎。在 MTLE-1-HS 和 MTLE-5-HS 患者中觀察到顆粒細胞分散，而所有不伴 HS 患者的腦組織中則不明顯。用于神經病理學的標本使用蘇木精和伊紅染色。如果在初步審查后懷疑皮質發育異常，則使用免疫組織化學分析神經元特異性核蛋白（Neuron-spedific nuclear protein，Neu N）和膠質纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）。未評估苔蘚纖維發芽。圖 S1（參見原文鏈接）包括了所有標本的神經病理圖像。
每個樣品的重復測序轉錄譜之間的一致性很高，分成一式兩份的 10 個海馬標本之間的平均相關系數轉錄表達水平>95%。12 例患者中有 2 例在第二次捕獲中沒有獲得足夠量的 cDNA 用于測序。每個測序運行獲得了約 800 萬條高質量的測序讀數，并且這些讀數的 90% 與參考基因組相對應。如果在所有 12 個樣品中存在至少 1 個測序讀數，則該轉錄本包括在差異表達分析中，最終得到了 12 605 個基因用于差異表達分析。
在進行差異表達分析之前，用最大方差的 500 個轉錄本進行 PCA，以確定批次效應校正后數據中最大的方差來源。第一個 PC 占表達數據方差的 82%（圖 2），根據伴或不伴 HS 將樣本分成兩組，表明表達數據的差異主要表現在海馬病理學上。
圖2
表達差異最大的 500個基因的前 2 個主成分分析圖
紅點代表伴有HS 樣品，綠色代表不伴HS 樣品，HS 的存在與否是表達數據差異的主要決定因素
接下來，通過構建占主導批次效應的廣義線性模型，在邊緣 R 中進行差分表達分析數據技術變化的來源以及 HS 的存在，這是數據中生物變異的主要來源。考慮到庫的大小和過度分散的差異，邊緣 R 包被設計為適合原始讀取計數的負二項模型；由于平均基因水平更加高度表達，表達數據的變化往往更大。通過計算每個基因的分散體，邊緣 R 減少了基因被視為差異表達的可能性，這是數據中存在異常值的結果。然后將廣義線性模型的負二項模型的擬合與使用似然比檢驗的負二項模型的擬合進行比較，以確定基因是否表達差異。因此，EdgeR 包適用于具有有限生物復制的數據集的差異表達分析，因為它減少了異常值和數據中過度分散的影響。在我們的數據中，與不伴 HS 患者相比，HS 患者標本中 55 個轉錄物顯著上調（表達增加 1.5 倍，FDR 調整 P<0.05），11 個轉錄物顯著下調（表達下降 1.5 倍，FDR 調整的P<0.05）。50 個最具有統計學意義的基因用于制作熱圖，其中 HS 的樣品再次聚集在一起，不伴 HS 的樣品則分離（圖 3）。HS 樣品中 10 個最具有顯著差異上調的基因是 CDKN1C、SV2C、PCSK1、SCRN1、KIAA1217、ELAVL2、GNG4、QPCT、KIT 和 STRIP2（表 2 a）。HS 樣品中最具有顯著差異的下調基因是 ANKRD20A19P、FST、ANO3、GRM2、ATP2B4、RP11-369E15.3、SLC3A1、JAG1、GNAL、PCP4 和 SLC5A12（表 2 b）。為了確認通過 RNA 測序檢測到的表達差異，所有一式兩份的樣品均對 10 個選擇的轉錄物（ARHGAP36、CDKN1C、CTGF、ELAVL2、GAD1、IL8、KCNIP2、KIT、QPCT 和 SV2C）進行 qRT-PCR。
圖3
海馬硬化中差異表達基因熱圖
樣品根據 HS 的存在與否聚類，紅色表示低水平表達，藍色表示高水平表達
表2
最大差異表達基因
對于所有 t10 轉錄物，伴 HS 與不伴 HS 樣品之間的存在表達差異（圖 S2 參見原文鏈接）。在 HS 顯著上調的基因中，其中有與凋亡相關的基因（BCL2）、PI3K-Akt 通路（TLR4，KIT，GNG4和LAMA2）、γ-氨基丁酸（GABA）、能量突觸（GNG4和GAD2）和河馬信號通路（CTGF和FZD7）。GO 本體論分析表明與質膜表達相關的基因有意義的聚集（P=0.02），并涉及多細胞生物過程的陽性調節（P=0.04）。
表3
伴有海馬硬化的樣品中的 C 簇中顯著富集途徑
為了更系統地確定哪些途徑可能在 HS 中發揮作用，使用聚類算法來鑒定共表達基因組。通過尋找在 HS 樣品中共表達但不在非 HS 樣品中共表達的大量基因簇，我們能夠確定出一個與 HS 樣本的轉錄組分不同的基因網絡。對具有最大方差的 500 個基因的原始讀數進行歸一化，并在 EdgeR 中進行對數轉換以減少過度分散。從不伴 HS 樣品的這些基因的表達數據中，分別出現了由 252、141 和 61 個基因組成的3個不同的共表達簇，這些基因分別由 1～3 個組成。對于具有 HS 的樣品，分別鑒定了由 143、95、68、29 和 24 個基因組成的共表達基因簇（以下為 A～E）。由于 HS 和非 HS 樣本中集群 A 與集群 1 具有較高的一致性，因此被排除在進一步分析之外。將剩余簇的基因列表與包含 KEGG 途徑的基因列表進行比較，以確定是否有任何特定途徑具有顯著的富集。在 C 組 68 個基因中，7 個參與氧化磷酸化的基因（hsa00190；P=5.12×10–5）：NDUFA5、ATP5C1、ATP6V0D1、ATP5A1、ATP6V1A、ATP6V1B2 和 ATP5B。此外，5 個基因參與了另一種能量生成途徑，即糖酵解/糖異生途徑（hsa00010；P=5.41×10–4）：ENO1、TPI1、PKM、GAPDH 和 LDHA。除了 ENO1 外，與不伴 HS 樣本相比，HS 樣本中中 12 個基因都表現為上調，但差異不具有統計學意義。與神經退行相關的兩種 KEGG 通路也有顯著富集：阿爾茨海默病（hsa05010；P=7.12×10–3）和帕金森病（hsa05012；P=0.025 8），分別說明了 C 簇中的 6 個和 5 個基因。與這兩種途徑相關的基因列表和前面描述的兩種能量產生途徑之間存在明顯重疊。阿爾茨海默病途徑中的基因是 NDUFA5、ATP5C1、ATP5A1、GAPDH、SNCA 和 ATP5B，帕金森病途徑中的基因為 NDUFA5、ATP5C1、ATP5B、SNCA 和 ATP5A1。簇 C 也富集了參與突觸小泡循環的基因（hsa04721；P=1.24 ×10–3）；這些基因分別是 CTLC、AP2M1、ATP6V1B2、ATP6V01 和 ATP6V1A。其中 2 個也與氧化磷酸化途徑有關。
3 討論
在本研究中，我們對伴 HS 和不伴 HS 的 MTLE 患者的 DG 細胞進行了 RNA 測序，以說明與該病理學相關的分子變化的特點。差異表達分析表明，HS 與不伴相比，55 個轉錄本顯著上調，11 個轉錄本顯著下調。
特別地關注于 DG 細胞，使與 HS 有關的關鍵細胞類型的 HS 相關基因表達變化的分析，比之前對 TLE 中整個海馬組織的分析進行了更高分辨率的評估。在一些病例中發現，DG 細胞與海馬組織活檢樣品具有相似的基因表達變化，而在另一些病例中，我們也觀察到了新的關聯。與之前研究一致，該途徑中的其他 4 個基因（KIT、GNG4、TLR4 和 LAMA2）在 HS 樣品中顯著上調。該途徑的作用已經在皮層發育畸形中得到證實，最近發現該途徑也涉及 MTLE 的發病機制。Xiao 等在原代培養的海馬神經元中誘導與 IL-1 相關的炎癥反應，該炎癥反應被癲癇發作所激活，并在癲癇患者的海馬中高度表達，然后通過引入 PI3K-Akt-mTOR 途徑的抑制劑來抑制這種炎癥反應。研究人員還觀察到 MTLE 患者海馬組織樣本中 p-Akt 水平升高。在本研究中，伴有 HS 的 MTLE 患者的 DG 細胞中 FOS、KIT、GNG4、TLR4和LAMA2 的上調為 PI3K-Akt-mTOR 通路在該病中的作用提供了額外的證據。我們的研究支持先前癲癇動物模型中有關 HS 的過程參與提供了支持。Elliott 等在癲癇大鼠模型中證實了 25 個關于發育和癲癇發生差異調節的基因。由于動物和人類的固有差異以及癲癇類型的差異，我們沒有必要預測個別基因在數據集中受到差異性調節，但這些研究者確實在 MTLE-HS 患者的 DG 細胞中觀察到 NPY 基因的顯著上調。Elliot 等在研究中注意到癲癇發作后 NPY 的表達在 DG 細胞中顯著上調，而且是神經元興奮的調節劑。
本研究還證實了在 HS 中氧化磷酸化和糖酵解與糖異生作用增強。盡管氧化磷酸化產生 ATP，但該過程也導致了活性氧（ROS）的產生。如果氧化磷酸化增強以滿足涉及癲癇發作時神經元的過度能量需求，這也將增加神經元內 ROS 的水平，從而導致氧化應激。雖然由于這些分子的不穩定性從而難以評估人體組織中的 ROS 水平，但有證據表明 HS 患者的海馬組織中存在氧化應激。Ristic 等通過除去 ROS 的 HS 樣品中的抗氧化酶活性顯著升高，證實了伴有 HS 的癲癇患者的海馬組織中存在氧化應激。我們的研究結果進一步補充了一個上調基因的網絡可能有助于 HS 患者海馬組織中特別是在 DG 細胞中 ROS 的產生這一發現。
通過基于簇的分析發現在 HS 中還涉及到了突觸小泡循環的過程。簇 C 中參與突觸小泡循環的基因（hsa04721；P=1.249×10–3）包括 CTLC、AP2M1、ATP6V1B2、ATP6V0D1 和 ATP6V1A。Winden 等在癲癇的毛果蕓香堿模型中檢測到 DG 的癲癇發生和相鄰的非致癇因區域，并證實了突觸過程豐富的共表達基因網絡。在 C 簇中也發現了這個網絡中的兩個基因，即 SDCBP 和 NBEA。
miRNA 以轉錄后的方式調控基因表達，一個研究證實 miR-218 和 miR-204 在 HS 患者的海馬組織中下調。與這些發現一致，我們的研究表明已經被歸類為 miR-204 的靶基因的幾個基因包括 BCL2、SOX4 和 ARHGAP29 在 HS 患者的 DG 細胞中顯著上調。
在本研究中，HS 樣品中下調的基因（包括 ANO3 和 GNAL）已被證明為共表達基因。在海馬中高度表達的 ANO3 基因及其變體與高熱驚厥有關。此外來自 Ano3-null 大鼠的海馬 CA1 錐體神經元表現出超興奮性。HS 中 ANO3 基因的下調可能促進發展為 HS 患者的過度興奮和癲癇發作活動。觀察體外確定的特定基因表達變化的影響研究證實了本研究，這可能幫助回答了長期以來在伴有 HS 的 MTLE 患者關于病理學改變到底是促進癲癇發作還是癲癇發作結果的爭論。
總之，目前研究表明，下一代測序方法可以從小的細胞群中產生可解釋、可重復和可能與生物相關的基因表達數據。這種方法已經開始闡明 DG 細胞中與 HS 相關基因表達的變化，并且為更多的 MTLE 患者群體研究提供了基礎，其中包括患者特殊因素，如發病年齡、癲癇發作類型和嚴重程度，以及抗癲癇藥物治療，以更好地了解 HS 的病理生理學變化。仍需進一步研究以了解特定轉錄物和轉錄物網絡差異表達的影響，了解其對神經元興奮性，顆粒細胞病理學變化和癲癇發生的影響。
