引用本文： 葛利吉, 劉宇, 黃紹平, 楊琳. 17β-雌二醇對苯巴比妥導致的未成熟腦學習記憶損傷的保護作用. 癲癇雜志, 2018, 4(1): 14-17. doi: 10.7507/2096-0247.20180004 復制
驚厥是臨床常見的急癥，是指腦神經元異常過度或者同步放電而產生的突發性、一過性的腦功能障礙，包括意識、運動、感覺、情感、認知等的短暫異常。流行病學研究顯示，全球約有 1%～2% 的人一生中至少有一次驚厥發作。在出生后 1 歲以內，尤其新生兒時期是發病高峰，這一時期神經元對內外界環境的變化極為敏感[1, 2]。臨床研究及實驗室研究均發現，早期驚厥的發生是造成嬰幼兒死亡的主要原因之一，同時也是引起嚴重的腦損傷及遠期神經系統后遺癥的主要原因，可能增加遠期癲癇發病率[3]。目前預防及控制驚厥發作的一線用藥仍為抗癲癇藥物（AEDs）。AEDs 在控制驚厥發作的同時，也抑制了神經系統興奮性，從而可能影響正常的神經系統功能[4, 5]。因此，尋找神經保護藥物、減弱 AEDs 的神經毒性顯得十分必要。
雌二醇（Estradiol，E2）是一種甾體激素，2009 年，Gerstner 等使用 17β-E2 保護缺血缺氧新生大鼠的腦組織，結果證實，E2 可以對少突膠質細胞起到腦保護作用，并且減輕缺血缺氧所致腦白質軟化[6]。本實驗給予新生大鼠腹腔注射 AEDs—苯巴比妥（Phenobarbital，PB），通過 Morris 水迷宮實驗，了解短期內應用該藥物是否會對未成熟腦產生遠期的認知損害；同時應用 17β-E2 進行干預，了解 E2 是否具有腦保護作用，為 AEDs 使用及神經保護提供新的研究方向。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及藥品
清潔級健康未成熟 Sprague Dawley（SD）窩鼠，鼠齡 3 d，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。實驗中嚴格遵守實驗動物管理與動物保護有關規定進行飼養。12h 黑暗/光亮條件，22℃～25℃ 環境溫度。PB 粉針由福建閩東力捷迅藥業有限公司提供（批號 140613）；17β-E2 由美國 Sigma 公司提供（批號 069K5010V）；Morris 水迷宮（MT200USB）由西安交通大學醫學院實驗中心提供。實驗獲得醫院倫理委員會批準。
1.2 方法
1.2.1 動物模型建立
30 只新生 SD 大鼠，隨機分為 3 組：生理鹽水對照組、PB 組和 PB+17β-E2 組，每組各 10 只大鼠。依據 Meeh-Rubner 人與大鼠間藥物劑量體表面積換算公式及相關文獻[7-11]來確定用藥劑量，分別是：生理鹽水 10 mL/（kg·d），PB 62.5 mg/（kg·d）［相當于臨床搶救劑量 10 mg/（kg·d）］，17β-E2 300 ug/（kg·d）。
1.2.2 實驗裝備情況
Morris 水迷宮跟蹤系統包括一個圓形乳白色水池，直徑 120 cm，高 50 cm；池壁上標有N、S、W和E 4 個入水點，將水池等分為 4 個象限；目標象限的固定位置放一直徑 9 cm、高 27 cm 的圓形乳白色平臺，水面高于平臺 1.5 cm，整個實驗期間平臺位置保持不變；水中加 1kg 奶粉，溫水沖開，以隱藏平臺，水溫保持在（22.0±0.5）℃，用苦味酸在實驗動物的頭部和背部涂成較大相連的區域，便于攝像；實驗期間迷宮外有足夠的參照物，且始終保持不變。迷宮上方安置帶有顯示系統的攝像機，同步記錄動物游泳軌跡，Morris 水迷宮數據采集和分析軟件記錄相關數據及圖像結果。
1.2.3 水迷宮行為測試
測試包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分。在正式 Moriss 水迷宮測試前 1 d，將實驗大鼠帶入實驗室熟悉環境，并將大鼠放入水中 120 s 進行適應性訓練。
① 定位航行試驗：用于檢測大鼠在水迷宮訓練中對空間線索的學習和記憶能力。第 30 天正式實驗，每只大鼠每天訓練 8 次，上午 4 次，下午 4 次，連續 4 d。測試大鼠面向池壁沒入水中，其入水點在 N、S、E 和 W 中隨機選取。記錄大鼠游上平臺所需時間（即潛伏期）。每次大鼠游上平臺，待其在平臺上停留 30 s 后取出動物，再進行下一只實驗。若潛伏期超過 120 s，用硬尺將大鼠引導至平臺并停留 30 s，且該次測驗的潛伏期記錄為 120 s。取 8 次逃避潛伏期平均值為每天的逃避潛伏期。
② 空間探索實驗：用于測試大鼠學會尋找平臺后，對平臺空間位置的記憶能力。于第 5 天上午撤除平臺，將大鼠頭向平臺對側象限宮壁的中點放入水中，記錄大鼠 120 s 內穿過原平臺位置的次數。和在原平臺象限探索時間與總時間（120 s）的百分比，原平臺象限與 120 s 內游泳總路程之比，以此評價動物對已獲取信息的存儲、記憶能力。
1.3 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行處理。數據采用均數±標準差表示，采用 t 檢驗和方差分析，P 值<0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 苯巴比妥組
從圖 1 可以看出，各組大鼠尋找平臺的潛伏期隨著實驗進行逐日遞減，從第 3 天開始潛伏期趨于平穩，選取第 4 天數據進行統計：PB 組大鼠較對照組大鼠尋找水下平臺的潛伏期明顯延長，存在顯著差異性（P<0.01）。穿越有效區次數，與對照組比較明顯減少，存在統計學差異（P<0.05）。120 s 內平臺象限路程與總路程之比低于對照組，但無統計學意義（表 1）。
2.2 苯巴比妥+17β-雌二醇組
PB+17β-E2 組大鼠較 PB 組尋找水下平臺潛伏期縮短，組間比較存在統計學差異（P<0.01）。穿越有效區次數較 PB 組明顯增多，有統計學意義（P<0.05）。120 s 內平臺象限路程與總路程之比高于 PB 組，但無統計學意義。PB+17β-E2 組與對照組比較以上各指標無明顯差異，見表 1。
圖1
各組大鼠每日平均潛伏期（s）
Figure1.
The average latent periods (s) of rats
表1
各組大鼠 Morris 水迷宮實驗結果的比較（
）
Table1.
Comparison of Morris experiment between each group
3 討論
嬰幼兒期是驚厥發生的高風險時期，有報道稱[12, 13]在美國新生兒驚厥的發生率為 0.18%～0.35%，早產兒更高。臨床及動物研究均已證實[1, 14-17]，嚴重或反復地驚厥發作會導致驚厥性腦損傷，大部分專家主張對新生兒驚厥采取積極藥物治療。然而，目前各國用于嬰幼兒驚厥的一線藥物仍是 AEDs，其中，PB 更是最常被列為首選用藥[18, 19]。本實驗以出生 3 d 的 SD 大鼠模擬嬰幼兒，給予臨床搶救劑量的 PB，觀察 PB 是否會對未成熟腦遠期學習記憶產生行為學上的損害。
已有研究證明，17β-E2 對缺血性腦損傷具有神經保護作用，17β-E2 神經保護作用機制包括受體依賴機制和非受體依賴機制[20]，與靶器官中的雌激素受體結合是 17β-E2 在體內最主要的作用途徑。研究證明，17β-E2 作為新生兒尤其是早產兒缺血缺氧的保護劑，可以作用于少突膠質細胞，減輕缺血缺氧導致的腦白質病變[21]。但是國內外有關 E2 對未成熟腦使用 PB 的保護研究較少。我們給予未成熟腦短療程 PB 的同時加用 E2 保護，水迷宮實驗中發現與 PB 組比較，大鼠平均逃避潛伏期縮短，穿越平臺象限次數增加。證明 E2 對未成熟腦使用 PB 物造成的腦損傷具有保護作用。
由于嬰幼兒處在特定的年齡階段，各系統發育尚未成熟，藥代動力學參數也不穩定，因此，藥物安全性顯得更為重要。同時，安全性又是神經保護藥物的首要條件之一。17β-E2 在臨床已經有廣泛應用，在嬰幼兒神經保護方面的安全性也得到了動物實驗的證實。在兒科臨床領域，17β-E2 在早產兒骨代謝異常中已經得到應用，并且目前尚無不良反應報告，因此，臨床應用具有很高的安全性[12]。
在該實驗中，我們對出生后 3 d 的 SD 大鼠腹腔注射 17β-E2，并未發現動物明顯的不良反應，提示該藥具有較高的安全性。因此，在 PB 臨床應用中，輔助使用 17β-E2 以保護未成熟腦神經發育的可行性仍值得進一步探討。
驚厥是臨床常見的急癥，是指腦神經元異常過度或者同步放電而產生的突發性、一過性的腦功能障礙，包括意識、運動、感覺、情感、認知等的短暫異常。流行病學研究顯示，全球約有 1%～2% 的人一生中至少有一次驚厥發作。在出生后 1 歲以內，尤其新生兒時期是發病高峰，這一時期神經元對內外界環境的變化極為敏感[1, 2]。臨床研究及實驗室研究均發現，早期驚厥的發生是造成嬰幼兒死亡的主要原因之一，同時也是引起嚴重的腦損傷及遠期神經系統后遺癥的主要原因，可能增加遠期癲癇發病率[3]。目前預防及控制驚厥發作的一線用藥仍為抗癲癇藥物（AEDs）。AEDs 在控制驚厥發作的同時，也抑制了神經系統興奮性，從而可能影響正常的神經系統功能[4, 5]。因此，尋找神經保護藥物、減弱 AEDs 的神經毒性顯得十分必要。
雌二醇（Estradiol，E2）是一種甾體激素，2009 年，Gerstner 等使用 17β-E2 保護缺血缺氧新生大鼠的腦組織，結果證實，E2 可以對少突膠質細胞起到腦保護作用，并且減輕缺血缺氧所致腦白質軟化[6]。本實驗給予新生大鼠腹腔注射 AEDs—苯巴比妥（Phenobarbital，PB），通過 Morris 水迷宮實驗，了解短期內應用該藥物是否會對未成熟腦產生遠期的認知損害；同時應用 17β-E2 進行干預，了解 E2 是否具有腦保護作用，為 AEDs 使用及神經保護提供新的研究方向。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及藥品
清潔級健康未成熟 Sprague Dawley（SD）窩鼠，鼠齡 3 d，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。實驗中嚴格遵守實驗動物管理與動物保護有關規定進行飼養。12h 黑暗/光亮條件，22℃～25℃ 環境溫度。PB 粉針由福建閩東力捷迅藥業有限公司提供（批號 140613）；17β-E2 由美國 Sigma 公司提供（批號 069K5010V）；Morris 水迷宮（MT200USB）由西安交通大學醫學院實驗中心提供。實驗獲得醫院倫理委員會批準。
1.2 方法
1.2.1 動物模型建立
30 只新生 SD 大鼠，隨機分為 3 組：生理鹽水對照組、PB 組和 PB+17β-E2 組，每組各 10 只大鼠。依據 Meeh-Rubner 人與大鼠間藥物劑量體表面積換算公式及相關文獻[7-11]來確定用藥劑量，分別是：生理鹽水 10 mL/（kg·d），PB 62.5 mg/（kg·d）［相當于臨床搶救劑量 10 mg/（kg·d）］，17β-E2 300 ug/（kg·d）。
1.2.2 實驗裝備情況
Morris 水迷宮跟蹤系統包括一個圓形乳白色水池，直徑 120 cm，高 50 cm；池壁上標有N、S、W和E 4 個入水點，將水池等分為 4 個象限；目標象限的固定位置放一直徑 9 cm、高 27 cm 的圓形乳白色平臺，水面高于平臺 1.5 cm，整個實驗期間平臺位置保持不變；水中加 1kg 奶粉，溫水沖開，以隱藏平臺，水溫保持在（22.0±0.5）℃，用苦味酸在實驗動物的頭部和背部涂成較大相連的區域，便于攝像；實驗期間迷宮外有足夠的參照物，且始終保持不變。迷宮上方安置帶有顯示系統的攝像機，同步記錄動物游泳軌跡，Morris 水迷宮數據采集和分析軟件記錄相關數據及圖像結果。
1.2.3 水迷宮行為測試
測試包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分。在正式 Moriss 水迷宮測試前 1 d，將實驗大鼠帶入實驗室熟悉環境，并將大鼠放入水中 120 s 進行適應性訓練。
① 定位航行試驗：用于檢測大鼠在水迷宮訓練中對空間線索的學習和記憶能力。第 30 天正式實驗，每只大鼠每天訓練 8 次，上午 4 次，下午 4 次，連續 4 d。測試大鼠面向池壁沒入水中，其入水點在 N、S、E 和 W 中隨機選取。記錄大鼠游上平臺所需時間（即潛伏期）。每次大鼠游上平臺，待其在平臺上停留 30 s 后取出動物，再進行下一只實驗。若潛伏期超過 120 s，用硬尺將大鼠引導至平臺并停留 30 s，且該次測驗的潛伏期記錄為 120 s。取 8 次逃避潛伏期平均值為每天的逃避潛伏期。
② 空間探索實驗：用于測試大鼠學會尋找平臺后，對平臺空間位置的記憶能力。于第 5 天上午撤除平臺，將大鼠頭向平臺對側象限宮壁的中點放入水中，記錄大鼠 120 s 內穿過原平臺位置的次數。和在原平臺象限探索時間與總時間（120 s）的百分比，原平臺象限與 120 s 內游泳總路程之比，以此評價動物對已獲取信息的存儲、記憶能力。
1.3 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行處理。數據采用均數±標準差表示，采用 t 檢驗和方差分析，P 值<0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 苯巴比妥組
從圖 1 可以看出，各組大鼠尋找平臺的潛伏期隨著實驗進行逐日遞減，從第 3 天開始潛伏期趨于平穩，選取第 4 天數據進行統計：PB 組大鼠較對照組大鼠尋找水下平臺的潛伏期明顯延長，存在顯著差異性（P<0.01）。穿越有效區次數，與對照組比較明顯減少，存在統計學差異（P<0.05）。120 s 內平臺象限路程與總路程之比低于對照組，但無統計學意義（表 1）。
2.2 苯巴比妥+17β-雌二醇組
PB+17β-E2 組大鼠較 PB 組尋找水下平臺潛伏期縮短，組間比較存在統計學差異（P<0.01）。穿越有效區次數較 PB 組明顯增多，有統計學意義（P<0.05）。120 s 內平臺象限路程與總路程之比高于 PB 組，但無統計學意義。PB+17β-E2 組與對照組比較以上各指標無明顯差異，見表 1。
圖1
各組大鼠每日平均潛伏期（s）
Figure1.
The average latent periods (s) of rats
表1
各組大鼠 Morris 水迷宮實驗結果的比較（
）
Table1.
Comparison of Morris experiment between each group
3 討論
嬰幼兒期是驚厥發生的高風險時期，有報道稱[12, 13]在美國新生兒驚厥的發生率為 0.18%～0.35%，早產兒更高。臨床及動物研究均已證實[1, 14-17]，嚴重或反復地驚厥發作會導致驚厥性腦損傷，大部分專家主張對新生兒驚厥采取積極藥物治療。然而，目前各國用于嬰幼兒驚厥的一線藥物仍是 AEDs，其中，PB 更是最常被列為首選用藥[18, 19]。本實驗以出生 3 d 的 SD 大鼠模擬嬰幼兒，給予臨床搶救劑量的 PB，觀察 PB 是否會對未成熟腦遠期學習記憶產生行為學上的損害。
已有研究證明，17β-E2 對缺血性腦損傷具有神經保護作用，17β-E2 神經保護作用機制包括受體依賴機制和非受體依賴機制[20]，與靶器官中的雌激素受體結合是 17β-E2 在體內最主要的作用途徑。研究證明，17β-E2 作為新生兒尤其是早產兒缺血缺氧的保護劑，可以作用于少突膠質細胞，減輕缺血缺氧導致的腦白質病變[21]。但是國內外有關 E2 對未成熟腦使用 PB 的保護研究較少。我們給予未成熟腦短療程 PB 的同時加用 E2 保護，水迷宮實驗中發現與 PB 組比較，大鼠平均逃避潛伏期縮短，穿越平臺象限次數增加。證明 E2 對未成熟腦使用 PB 物造成的腦損傷具有保護作用。
由于嬰幼兒處在特定的年齡階段，各系統發育尚未成熟，藥代動力學參數也不穩定，因此，藥物安全性顯得更為重要。同時，安全性又是神經保護藥物的首要條件之一。17β-E2 在臨床已經有廣泛應用，在嬰幼兒神經保護方面的安全性也得到了動物實驗的證實。在兒科臨床領域，17β-E2 在早產兒骨代謝異常中已經得到應用，并且目前尚無不良反應報告，因此，臨床應用具有很高的安全性[12]。
在該實驗中，我們對出生后 3 d 的 SD 大鼠腹腔注射 17β-E2，并未發現動物明顯的不良反應，提示該藥具有較高的安全性。因此，在 PB 臨床應用中，輔助使用 17β-E2 以保護未成熟腦神經發育的可行性仍值得進一步探討。
