引用本文： 張君, 高麗, 李彥, 楊柳, 范宏業, 齊暉, 殷曉靜, 李俊龍. 95例癲癇患兒的基因型表型分析及臨床研究. 癲癇雜志, 2017, 3(6): 490-496. doi: 10.7507/2096-0247.20170078 復制
癲癇是一種由于腦神經元過度放電所導致的反復、短暫、發作性的中樞神經系統功能失常的腦部疾病，癲癇的病因各種各樣，遺傳性癲癇分為單基因性癲癇、多基因性癲癇、染色體異常所致的癲癇和其他系統疾病中的癲癇，離子通道或相關分子的結構或功能等基因產物的改變是導致癲癇發生的主要原因。不同年齡組的癲癇患兒病因不同，新生兒及嬰兒期最常見于基因突變等先天性遺傳或缺氧、窒息、產傷等圍產期因素，學齡期的患兒一般為代謝性異常或中樞神經系統感染等因素.
隨著醫學研究的進展，分子遺傳診斷技術包括基因組學、蛋白質組學、代謝組學、表觀遺傳學等幫助實現更準確、更早期的臨床診斷，尤其在神經發育障礙方面的疾病方面。
本研究以95例癲癇患兒為研究對象，通過總結分析其臨床特征，以及二代高通量基因測序及一代驗證的突變基因型，進一步了解患兒的遺傳模式，增加對癲癇的病因學了解，為臨床的藥物治療提供方向。
1 資料與方法
1.1 研究對象
2014年9月-2016年12月于河南省人民醫院兒科神經內科門診就診并確診為癲癇的95例患兒。所有研究對象及其法定監護人均簽署知情同意書，研究獲得河南省人民醫院醫學倫理委員會的批準。
1.1.1 基因檢測的癲癇患兒入選標準
年齡＜18歲，伴或不伴有精神發育遲滯；符合2001年國際抗癲癇聯盟(ILAE)制定的癲癇診斷標準。
1.1.2 排除標準
年齡＞18歲；反射性發作、發作性運動障礙、精神心理行為異常、睡眠障礙等；其他原因致生父母資料不完善者，無法進行一代基因驗證者。
1.2 資料采集
采用門診現場詢問患兒法定監護人，填寫問卷的方式建立詳細的病史資料庫，包括基本資料如年齡、性別、出生年月、家庭住址、聯系方式；首次發作的日期、年齡、類型、表現、持續時間頻率及發作后的狀態；母孕史、生育史、既往史、家族史；既往用藥史、治療情況等；定期檢測必要的生化指標如肝腎功能、心肌酶、血脂五項、血藥濃度等，完善頭顱影像學及腦電圖(EEG)的檢查，必要時進行代謝篩查；開始抗癲癇藥物(AEDs)治療后，跟蹤隨訪藥物依從性、濃度、療效等；隨訪方式為兒科神經門診的定期復查，定期電話或家庭隨訪。
1.3 基因檢測
1.3.1 方法
采取患兒及父母靜脈血各2mL(EDTA抗凝)，送檢至北京智因東方轉化醫學研究有限公司進行二代高通量基因測序，操作流程包括：①基因組片段化-末端補平修復-3’端腺苷化-擴增-加接頭-雜交-洗滌磁珠和洗脫DNA-洗脫產物擴增；② Illumina平臺測序：得到圖像原始數據-進行數據分析；③一代測序(Sanger法)驗證。
1.3.2 明確變異基因的致病性標準
① 查閱相關致病突變庫(OMIM、HGMD)，了解突變基因的蛋白質功能是否受到影響；②基因變異攜帶方式是否支持疾病遺傳方式，不能排除遺傳復雜性；③全面了解研究對象及監護人的臨床表型。
1.4 療效判定標準
截止到最后隨訪時間，3年內無臨床發作為控制；發作較前減少＞75%為顯效；發作較前減少在50%~75%之間為有效；發作較前減少＜50%或增多為無效。
2 結果
2.1 一般資料
95例癲癇患兒中男65例，女30例，男女比例13 :6；年齡4月齡~6.2歲。依據臨床診斷的類型分類，全面性癲癇發作64例(67.3%)，其中強直-陣攣8例(8.4%)，肌陣攣16例(16.8%)，陣攣23例(24.2%)，強直12例(12.6%)，失神1例(1.1%)，失張力4例(4.2%)；部分性發作8例(8.4%)；分類未明的23例(24.2%)。
95例中母孕期有流產史39例(41.1%)，出生時有缺氧窒息史55例(57.9%)。家族有抽搐史14例(14.7%)，家族有智力低下者12例(12.6%)。50例(52.6%)正常，鼻竇區壓痛者5例(5.3%)，生長發育落后(1歲以內，包括不追物，不追聽，不會抬頭，不會坐或不會站，肌張力高)9例(9.5%)，雙側巴氏征陽性或可疑陽性(＞1歲半)4例(4.2%)，伴眨眼、聳肩1例(1.1%)，小頭畸形者1例(1.1%)，伴面部色素脫失斑3例(3.2%)，不會說話、不會人交流(＞1歲半)5例(5.3%)，面色蒼白、體格瘦小者3例(3.2%)。
2.2 腦電圖
EEG未見明顯異常者38例(40.0%)，異常者57例(60.0%)，其中棘慢波、尖慢波45例(47.4%，局灶31例，一側半球導聯8例，全導聯6例)，棘慢綜合波8例(8.4%，左額、顳部2例，枕部2例，中央頂枕3例，左側1例)、高度失律1例(1%，全導聯)，慢波3例(3.2%，全導聯)。
2.3 頭顱影像學
正常63例(66.3%)，異常32例(33.7%)，其中腦白質發育不良5例(5.3%)、蛛網膜下腔增寬5例(5.3%)，蛛網膜囊腫、顳極囊腫6例(6.3%)，小腦萎縮3例(3.2%)，白質脫髓鞘2例(2.1%)，異常信號4例(4.2%)，副鼻竇炎4例(4.2%)，大枕大池2例(2.1%), 鈣化點2例(1.1%)，見表 1。
表1
95例癲癇患兒頭顱MRI檢查
Table1.
MRI examination of 95 children with epilepsy
2.4 血生化
正常26例(27.4%)，堿性磷酸酶高61例(64.2%)，血脂高21例(22.1%)，貧血36例(37.9%)，血氨、血乳酸高27例(28.4%)，ALT高12例(12.6%)，25-(OH)D3低9例(9.5%)，見圖 1。
圖1
95例癲癇患兒血生化檢查
Figure1.
Blood biochemical examination of 95 children with epilepsy
2.5 基因檢測
2.5.1 明確致病的基因
共16例(16.8%)，除CASK為母源遺傳外，余均為新生突變，Dravet綜合征5例(5.3%)，突變基因均為SCN1A。嬰兒痙攣癥1例(1.1%)，突變基因為BRAF。余9例突變基因分別為3例SCN1A、1例TSC1、1例TSC2、1例STS、2例FLNA、1例KCNQ2。見表 2。
表2
16例有明確致病基圖的癲癇患兒的臨床表型及基因型
Table2.
Clinical phenotype and genotype of 16 children with epilepsy with clear pathogenicity
2.5.2 可能致病的基因
共21例(22.1%)，其中嬰兒嬰兒痙攣癥患兒3例，突變基因為DIAPH3 (合并RNF213)、ABCC8 (合并RANBP2)、ASPM，余致病基因分別為1例CLCN2、3例DMD、1例SMN1、2例KCNT1、1例KANK1、1例SYNE1、1例SRPX2、1例MBD5、1例EFHC2、1例SPTAN1、1例GRIA1、1例DIAPH3、1例GRIN3B、1例SV2A、1例KACNF1。
2.5.3 不致病的基因
共30例(31.6%)，突變基因分別為1例SMN2、1例GRIA1、1例PAH、4例SCN3A、1例COL6A3、1例FOXP1、1例TREX1、3例KCNQ4、1例SLC3A1、1例PRF1、1例CPT1A、1例PSEN2、1例PSEN2、6例SCN9A、1例ASPM、1例MECP2、1例RNF213、1例KTNF、1例OTC、1例ANKR。
2.5.4 未檢測到突變基因
共28例(29.5%)。
2.6 抗癲癇藥物及療效
單藥治療38例，其中丙戊酸鈉(Valproate，VPA)18例(18.9%)，左乙拉西坦(Levetiracetam LEV)14例(14.7%)，奧卡西平(Oxcarbazepine, OXC)6例(6.3%)；兩種藥物治療41例(43.2%)，其中LEV+VPA 34例(35.8%)，LEV+托吡酯(Topiramate, TPM)7例(7.4%)；三聯治療LEV+VPA+硝基西泮(Clonazepam, CZP)15例(15.8%)，其中1例(1.1%)對OXC過敏；四聯治療LEV+VPA+NVP+苯巴比妥(Phenobarbitone, PB)1例(1.1%)對OXC過敏。
大多數患兒治療效果一般，其中27例(28.4%)為控制，單藥18例，兩種藥物9例；有效：20例(21.1%)有效，其中單藥15例，兩種藥物4例，三種藥物1例；顯效：32例(33.7%)，其中單藥7例，兩種藥物21例，三種藥物4例；無效：12例(12.6%)，三種藥物12例。由于電話停機，4例(4.2%)患兒失訪；18例(18.9%)預后較差，合并有運動、智力發育落后。見圖 2。
圖2
95例癲癇患兒治療療效分布
Figure2.
The distribution of therapeutic effect in 95 children with epilepsy
3 討論
隨著分子遺傳學的發展，多個系統疾病的遺傳學病因被越發關注。神經系統也不例外，尤其是癲癇，越來越多的致病基因被發現。癲癇的致病基因很多，大致可以分為4類，第一類是癲癇基因，是指導致癲癇或以癲癇為核心癥狀的綜合征的基因，目前報道的約有84種；第二類是神經發育相關的癲癇基因，一般是指導致腦發育畸形和癲癇的基因，目前發現約73個；第三類是癲癇關聯基因，主要引起軀體或其他系統異常，合并癲癇或癇性發作的基因，目前大約發現有536個；第四類是可能與癲癇相關的基因，是指與癲癇有關，需要進一步證實的基因，目前發現約284個。不同的癲癇類型，其致病基因也不盡相同。
16例有明確致病基因的癲癇患兒中，1例患兒為嬰兒痙攣癥，該患兒面容特殊合并運動發育遲緩、智力低下。發作表現為屈曲抱團、點頭樣發作，頭顱影像學特點為腦白質發育不良、小腦出血灶可能，缺血缺氧性腦病。心臟超聲示卵圓孔未閉。目前聯合使用兩種AEDs，未控制發作。致病基因是BRAF，為新生突變，c.1391G>T(exon11)，p.G464V，父母c.1391G>T野生型，該基因可導致心面皮膚綜合征(CFC)的發生。CFC是一種常染色體顯性遺傳疾病，臨床上極為罕見。1991年由Reynolds、Baraitser、Patton首次報道，可致腦、胃腸、血管多臟器損害，以面部畸形、先天性心臟、皮膚異常、生長發育遲緩、胃腸道功能障礙、智力障礙及癲癇為主要特征。BRAF基因主要作用于RAS-MAPK傳導通路，該通路是信號轉導級聯反應，主要調節細胞分化，增殖，存活和凋亡[1]；CFC屬心肌細胞群相關疾病，嬰兒痙攣患兒的基因是否與一些心肌細胞發育相關基因有關，這為我們打開一個更廣闊的視角，為癲癇基因的研究提供了更多方向，同時也為癲癇的治療提供了依據。許多研究證明，嬰兒痙攣與另外一些基因，比如神經發育相關的基因有關。目前發現較多的基因如SCN1A、TSC2、TSC1、POXG1等，這些基因突變可引其早發性嬰兒癲癇性腦病。另外還有一些有遺傳基因包括：同源基因(Homologous gene，ARX)[2, 3]、細胞周期蛋白依賴激酶樣5基因(Cyclin-dependent kinase-like 5 gene，CDKL5)[4, 5]、離子通道基因[6, 7]、促黑激素皮質素受體-4基因(Melanocortin receptor-4 gene，MC4R)[8]等。6例臨床診斷為Dravet綜合征患兒均有明確致病基因，突變基因均為SCN1A基因。其中3例患兒出現強直陣攣發作，2例表現為肌陣攣發作，1例表現為局灶性發作，1例表現為不典型失神。4例患兒合并有不同程度的智力運動的發育倒退。1例患兒口服一種AEDs，5例患兒口服兩種以上的AEDs，其中3例患兒在二線添加使用LTG時加重，調換其他藥物后發作次數明顯減少，有1例患兒得到控制，另外5例患兒仍有較頻繁的發作，臨床治療效果差。基因檢測結果示6例患兒均為鈉離子通道SCN1A基因的新生突變，其中4例為新生剪切突變，2例為錯義突變，新生突變。新生突變即父母無此基因的變異以及臨床表現，一般少利多害。Dravet綜合征患兒多1歲起病，首次發作均表現為熱性驚厥，之后發作多不伴發熱，且發作形式多樣。有研究報告，Dravet綜合征的大部分患兒有SCNlA基因突變，大約占60%~80%左右[9-11]。不同種族的研究報告表明，SCN1A基因突變率約占1/3[12]。SCN1A基因主要編碼神經元鈉離子通道，Dravet綜合征患兒在治療時應盡量不選用奧卡西平等鈉離子通道阻滯劑，但有項研究表明，奧卡西平等并不能使癲癇的發作次數增多[13]，LTG可能會加重SCN1A基因突變的癲癇患兒癥狀，應避免使用，但本研究例數少，需要擴大樣本量進一步分析。另外9例有明確致病基因的癲癇患兒中，2例患兒的致病基因為SCN1A基因，2例為FLNA基因突變，其余患兒的致病基因分別為TSC1，TSC2，CASK、STS、KCNQ2。2例癲癇患兒的SCN1A基因均為新生突變，一個為錯義突變，一個為剪切突變，臨床均合并有不同程度的智力低下，發作形式均為肌陣攣，均口服兩種以上的AEDs，療效為顯效。SCN1A基因目前報道較多，由于鈉離子通道亞單位的編碼基因突變導致癲癇的發生，同時也是多種疾病的致病基因，包括Dravet綜合征、FS+、GEFS+、家族性偏癱性偏頭疼等，一般為常染色體顯性遺傳。2例癲癇患兒合并有TSC，面部及軀干均可見多個大小不一的牛奶斑，頭顱影像學可見多個鈣化點。1例患兒應用VPA單藥治療，控制3月未發作，未出現智力或行為能力倒退。另外1例患兒三種AEDs聯合應用，控制不佳，已影響生活學習。突變基因分別為為TSC1，TSC2，均為新生突變，致病性顯著。結節性硬化是嬰兒痙攣癥常見的合并癥。有報道超過80%的癲癇患兒＜1歲時即有癲癇發作[14]大約一半的患兒為嬰兒痙攣[15]，其明確的致病基因是TSC1，TSC2，兩基因突變率比約為3.4 :1[16]，有學者研究表明，TSC1基因突變的類型很多，包括無義突變、錯義突變，微小片段的插入或大片段的缺失等，且TSC1突變所致的臨床表型要輕于TSC2，TSC2突變的患兒往往合并有不同程度的智力低下，另外TSC2突變也可見于肝血管肌脂瘤等疾病中。本研究中TSC1基因突變所致的癲癇合并結節性硬化的患兒臨床癥狀輕，治療效果優于TSC2基因突變的患兒，與既往報道相符。1例癲癇患兒合并有小頭畸形、小腦及腦橋發育不良，智力障礙等，頭顱影像學提示雙側大腦半球腦回寬平，腦溝變淺，腦白質發育不良，小頭畸形，小腦萎縮，患兒面容特殊，生長發育落后，該患兒與其母親臨床特征相似，突變基因相同，為母源突變。癲癇發作表現形式為肌陣攣，目前兩種AEDs聯合使用，治療效果差，未控制。其致病基因為CASK，c.1837C>T，p.R613X, 309，屬于無義突變，突變來自其母親。該基因突變可引起的嚴重神經發育異常，主要使神經細胞遷移紊亂，導致無腦回畸形以及嚴重小腦和海馬發育不全等[17]，有報道稱該基因在女性中突變致使病理特征表現更明顯[18]。該基因是神經發育相關的基因，目前報道甚少，為最新發現，這為癲癇的致病基因的隊伍增添了新的一員。1例癲癇患兒突變基因為KCNQ2，為新生突變，同時合并有CPS1基因突變，KCNQ2基因突變可使鉀離子亞單位通道的編碼基因突變，影響腦和神經的發育，從而致使癲癇的發生，是一種常染色體顯性遺傳。另外，KCNQ2基因同時還是嬰兒早發性的癲癇性腦病及良性家族性新生兒驚厥的致病基因。既往有報道，母源遺傳的KCNQ2基因突變也很多。該例患兒合并有智力低下，臨床發作形式是陣攣發作，聯合兩種AEDs使用，療效為顯效，有學者研究，依佐加濱對KCNQ2基因突變引起的癲癇的治療效果好，由于該藥不常見，未廣泛應用于臨床，其作用機制及臨床療效還不是很明確。1例癲癇患兒為FLNA基因突變，發病機制為X染色體顯性遺傳，為新生突變，是半合子遺傳，臨床以強直形式起病，聯合兩種AEDs治療，控制發作，該基因是X-連鎖的腦室旁結節性異位的致病基因，主要影響大腦神經元的遷移，導致癲癇的發生。1例癲癇患兒突變基因為STS，屬于半合子新生突變，該患兒起病年齡為1歲2個月，目前發作形式為肌陣攣，口服使用兩種AEDs，未能控制發作，屬于難治性癲癇。有報道STS基因與智力障礙有關，多以肌陣攣形式起病，常常合并有智力低下和語言障礙，該基因目前報道的不多，其致病機制還待進一步研究，也有報道稱該基因與X-連鎖魚鱗病有關。本研究16例明確致病基因的患兒，13例患兒口服兩種以上的AEDs治療，效果較差。
突變基因可能致病的癲癇患兒有21例，臨床表現為強直發作的患兒6例，肌陣攣發作9例，失張力3例，痙攣發作3例，1例合并神經肌肉病變，2例合并智力障礙。其中3例臨床診斷為嬰兒痙攣癥，1例癲癇患兒為DIAPH3基因聯合RNF213基因突變，均為錯義突變，突變來自父親，突變位點報道有致病性，但該患兒父親無臨床表現，考慮可能與遺傳異質性有關。1例為ABCC8基因聯合RANBP2基因突變的癲癇患兒，為剪切突變，突變位點未見致病報道，為母源突變, ABCC8是家族性高胰島素低血糖癥1型，母親無相關臨床表現，但生物軟件功能預測可能致病。另外一例患兒突變基因是ASPM，該基因是原發性小頭畸形的突變基因，突變位點未見文獻報道，功能預測可能有害，突變來來自于母親，母親無相關臨床表現，考慮與遺傳異質體有關。3例患兒中，有1例患兒三種AEDs聯合應用, 未控制發作，2例患兒兩種AEDs聯合應用，療效為2例顯效，1例無效；2例患兒有DMD基因變異，均為雜合突變，母系來源，均為為移碼變異，該基因是杜氏/貝氏肌營養不良的致病基因，2例患兒臨床口服兩種AEDs治療，療效為有效。2例患兒有KCNT1基因變異，均為雜合突變，母系來源，母親無相關臨床表現，考慮遺傳異質體可能性大，該基因被報道是夜間額葉癲癇及早期嬰兒癲癇腦病的致病基因，該2例患兒臨床為強直陣攣發作，目前均口服1種AED單藥治療，療效為控制，1例患兒檢測有SMN1基因7，8號外顯子純合缺失變異，氨基酸變化為剪切突變，突變位點致病未見報道。4例患兒基因既往報道與癲癇相關，突變基因分別為GRIN3B、SV2A、KACNF1、KCNH8，該4例患兒均為雜合突變，父系、母系來源各2例，父母均無臨床特征，臨床均為單藥治療，療效為控制；1例患兒的突變基因為KANK1，純合突變，為移碼變異，考慮可能致病，該基因被報道是痙攣性腦性癱瘓的致病基因，患兒臨床為痙攣發作，口服三種藥物治療，療效無效，1例患兒的致病基因為SYNE1，為雜合突變，突變位點報道有致病性，父母無相關臨床表現，該基因被報道是Emer-Dreifuss肌營養不良4型的致病基因；5例患兒的致病基因是SCN9A，2例患兒檢測到的突變基因為CLCN2，該基因有1個雜合突變，為剪切突變，來自父親，父親考慮致病可能性大，無先關臨床特征，考慮遺傳異質體的可能。該基因是特發性全面性癲癇、青少年失神癲癇和青少年肌陣攣癲癇的易感基因，患兒目前應用兩種AEDs治療，療效為顯效。總結來說，變異基因可能致病，其原因可能有以下三點：①先證者基因變異的形式多為錯義變異，這種變異很大程度上會對蛋白質功能造成影響，父母該位點表現為一方或雙方為雜合子，該變異位點無致病性，或可能有致病性但尚未見文獻報道，人群中出現極少，發生率極低，不屬于多態性變化；②先證者基因被報導是非癲癇疾病的致病基因，遺傳方式未明，而先證者與父母均未有該疾病相關的臨床表現，但仍需要考慮先證者及父母臨床特征不完全外顯的可能；③基因檢測技術上存在的局限性，比如基因組DNA上檢測到的變異未必都能體現在該基因所有mRNA變體序列中。
不致病的突變基因有30例，其中臨床表現為強直-陣攣發作的患兒9例，肌陣攣發作7例，陣攣發作3例，失張力1例，痙攣發作1例，不能分類的發作9例。3例合并智力障礙。18例患兒口服2種AEDs治療，12例患兒AED單藥治療，控制3例，有效者14例，顯效9例，無效4例。突變基因不支持致病的原因主要是該些突變基因的遺傳方式為常染色體隱性遺傳(Autosomal recessive, AR)疾病，盡管臨床特征有一定的匹配度，蛋白結構經軟件預測可能有害，但查找正常人數據庫中未見收錄，而且患兒為雜合子，父母無攜帶有相同臨床特征，單一雜合變異不會導致發病，不符合AR疾病的發病機制。無致病基因的患兒臨床特征比較輕，治療效果可，本研究中的30例患兒預后較好，未發現智力發育落后的癲癇患兒。
近年來，基因在神經系統疾病中的研究越來越明確，比如嬰兒痙攣癥、Dravet等[19]，明確突變基因特點可幫助研制新型AEDs以及提供靶向治療途徑。
本研究中發現CASK、BRAF兩個新的致病基因，國內報道甚少，在一定意義上擴充了神經發育相關的癲癇基因和癲癇關聯基因的數目。SCN1A基因突變所致的Dravet綜合征的患兒的臨床特征更嚴重，包括起病更早、發作頻繁、治療效果差。有明確致病基因的患兒，多數需要兩種或以上AEDs聯合應用，治療上困難。
癲癇是一種由于腦神經元過度放電所導致的反復、短暫、發作性的中樞神經系統功能失常的腦部疾病，癲癇的病因各種各樣，遺傳性癲癇分為單基因性癲癇、多基因性癲癇、染色體異常所致的癲癇和其他系統疾病中的癲癇，離子通道或相關分子的結構或功能等基因產物的改變是導致癲癇發生的主要原因。不同年齡組的癲癇患兒病因不同，新生兒及嬰兒期最常見于基因突變等先天性遺傳或缺氧、窒息、產傷等圍產期因素，學齡期的患兒一般為代謝性異常或中樞神經系統感染等因素.
隨著醫學研究的進展，分子遺傳診斷技術包括基因組學、蛋白質組學、代謝組學、表觀遺傳學等幫助實現更準確、更早期的臨床診斷，尤其在神經發育障礙方面的疾病方面。
本研究以95例癲癇患兒為研究對象，通過總結分析其臨床特征，以及二代高通量基因測序及一代驗證的突變基因型，進一步了解患兒的遺傳模式，增加對癲癇的病因學了解，為臨床的藥物治療提供方向。
1 資料與方法
1.1 研究對象
2014年9月-2016年12月于河南省人民醫院兒科神經內科門診就診并確診為癲癇的95例患兒。所有研究對象及其法定監護人均簽署知情同意書，研究獲得河南省人民醫院醫學倫理委員會的批準。
1.1.1 基因檢測的癲癇患兒入選標準
年齡＜18歲，伴或不伴有精神發育遲滯；符合2001年國際抗癲癇聯盟(ILAE)制定的癲癇診斷標準。
1.1.2 排除標準
年齡＞18歲；反射性發作、發作性運動障礙、精神心理行為異常、睡眠障礙等；其他原因致生父母資料不完善者，無法進行一代基因驗證者。
1.2 資料采集
采用門診現場詢問患兒法定監護人，填寫問卷的方式建立詳細的病史資料庫，包括基本資料如年齡、性別、出生年月、家庭住址、聯系方式；首次發作的日期、年齡、類型、表現、持續時間頻率及發作后的狀態；母孕史、生育史、既往史、家族史；既往用藥史、治療情況等；定期檢測必要的生化指標如肝腎功能、心肌酶、血脂五項、血藥濃度等，完善頭顱影像學及腦電圖(EEG)的檢查，必要時進行代謝篩查；開始抗癲癇藥物(AEDs)治療后，跟蹤隨訪藥物依從性、濃度、療效等；隨訪方式為兒科神經門診的定期復查，定期電話或家庭隨訪。
1.3 基因檢測
1.3.1 方法
采取患兒及父母靜脈血各2mL(EDTA抗凝)，送檢至北京智因東方轉化醫學研究有限公司進行二代高通量基因測序，操作流程包括：①基因組片段化-末端補平修復-3’端腺苷化-擴增-加接頭-雜交-洗滌磁珠和洗脫DNA-洗脫產物擴增；② Illumina平臺測序：得到圖像原始數據-進行數據分析；③一代測序(Sanger法)驗證。
1.3.2 明確變異基因的致病性標準
① 查閱相關致病突變庫(OMIM、HGMD)，了解突變基因的蛋白質功能是否受到影響；②基因變異攜帶方式是否支持疾病遺傳方式，不能排除遺傳復雜性；③全面了解研究對象及監護人的臨床表型。
1.4 療效判定標準
截止到最后隨訪時間，3年內無臨床發作為控制；發作較前減少＞75%為顯效；發作較前減少在50%~75%之間為有效；發作較前減少＜50%或增多為無效。
2 結果
2.1 一般資料
95例癲癇患兒中男65例，女30例，男女比例13 :6；年齡4月齡~6.2歲。依據臨床診斷的類型分類，全面性癲癇發作64例(67.3%)，其中強直-陣攣8例(8.4%)，肌陣攣16例(16.8%)，陣攣23例(24.2%)，強直12例(12.6%)，失神1例(1.1%)，失張力4例(4.2%)；部分性發作8例(8.4%)；分類未明的23例(24.2%)。
95例中母孕期有流產史39例(41.1%)，出生時有缺氧窒息史55例(57.9%)。家族有抽搐史14例(14.7%)，家族有智力低下者12例(12.6%)。50例(52.6%)正常，鼻竇區壓痛者5例(5.3%)，生長發育落后(1歲以內，包括不追物，不追聽，不會抬頭，不會坐或不會站，肌張力高)9例(9.5%)，雙側巴氏征陽性或可疑陽性(＞1歲半)4例(4.2%)，伴眨眼、聳肩1例(1.1%)，小頭畸形者1例(1.1%)，伴面部色素脫失斑3例(3.2%)，不會說話、不會人交流(＞1歲半)5例(5.3%)，面色蒼白、體格瘦小者3例(3.2%)。
2.2 腦電圖
EEG未見明顯異常者38例(40.0%)，異常者57例(60.0%)，其中棘慢波、尖慢波45例(47.4%，局灶31例，一側半球導聯8例，全導聯6例)，棘慢綜合波8例(8.4%，左額、顳部2例，枕部2例，中央頂枕3例，左側1例)、高度失律1例(1%，全導聯)，慢波3例(3.2%，全導聯)。
2.3 頭顱影像學
正常63例(66.3%)，異常32例(33.7%)，其中腦白質發育不良5例(5.3%)、蛛網膜下腔增寬5例(5.3%)，蛛網膜囊腫、顳極囊腫6例(6.3%)，小腦萎縮3例(3.2%)，白質脫髓鞘2例(2.1%)，異常信號4例(4.2%)，副鼻竇炎4例(4.2%)，大枕大池2例(2.1%), 鈣化點2例(1.1%)，見表 1。
表1
95例癲癇患兒頭顱MRI檢查
Table1.
MRI examination of 95 children with epilepsy
2.4 血生化
正常26例(27.4%)，堿性磷酸酶高61例(64.2%)，血脂高21例(22.1%)，貧血36例(37.9%)，血氨、血乳酸高27例(28.4%)，ALT高12例(12.6%)，25-(OH)D3低9例(9.5%)，見圖 1。
圖1
95例癲癇患兒血生化檢查
Figure1.
Blood biochemical examination of 95 children with epilepsy
2.5 基因檢測
2.5.1 明確致病的基因
共16例(16.8%)，除CASK為母源遺傳外，余均為新生突變，Dravet綜合征5例(5.3%)，突變基因均為SCN1A。嬰兒痙攣癥1例(1.1%)，突變基因為BRAF。余9例突變基因分別為3例SCN1A、1例TSC1、1例TSC2、1例STS、2例FLNA、1例KCNQ2。見表 2。
表2
16例有明確致病基圖的癲癇患兒的臨床表型及基因型
Table2.
Clinical phenotype and genotype of 16 children with epilepsy with clear pathogenicity
2.5.2 可能致病的基因
共21例(22.1%)，其中嬰兒嬰兒痙攣癥患兒3例，突變基因為DIAPH3 (合并RNF213)、ABCC8 (合并RANBP2)、ASPM，余致病基因分別為1例CLCN2、3例DMD、1例SMN1、2例KCNT1、1例KANK1、1例SYNE1、1例SRPX2、1例MBD5、1例EFHC2、1例SPTAN1、1例GRIA1、1例DIAPH3、1例GRIN3B、1例SV2A、1例KACNF1。
2.5.3 不致病的基因
共30例(31.6%)，突變基因分別為1例SMN2、1例GRIA1、1例PAH、4例SCN3A、1例COL6A3、1例FOXP1、1例TREX1、3例KCNQ4、1例SLC3A1、1例PRF1、1例CPT1A、1例PSEN2、1例PSEN2、6例SCN9A、1例ASPM、1例MECP2、1例RNF213、1例KTNF、1例OTC、1例ANKR。
2.5.4 未檢測到突變基因
共28例(29.5%)。
2.6 抗癲癇藥物及療效
單藥治療38例，其中丙戊酸鈉(Valproate，VPA)18例(18.9%)，左乙拉西坦(Levetiracetam LEV)14例(14.7%)，奧卡西平(Oxcarbazepine, OXC)6例(6.3%)；兩種藥物治療41例(43.2%)，其中LEV+VPA 34例(35.8%)，LEV+托吡酯(Topiramate, TPM)7例(7.4%)；三聯治療LEV+VPA+硝基西泮(Clonazepam, CZP)15例(15.8%)，其中1例(1.1%)對OXC過敏；四聯治療LEV+VPA+NVP+苯巴比妥(Phenobarbitone, PB)1例(1.1%)對OXC過敏。
大多數患兒治療效果一般，其中27例(28.4%)為控制，單藥18例，兩種藥物9例；有效：20例(21.1%)有效，其中單藥15例，兩種藥物4例，三種藥物1例；顯效：32例(33.7%)，其中單藥7例，兩種藥物21例，三種藥物4例；無效：12例(12.6%)，三種藥物12例。由于電話停機，4例(4.2%)患兒失訪；18例(18.9%)預后較差，合并有運動、智力發育落后。見圖 2。
圖2
95例癲癇患兒治療療效分布
Figure2.
The distribution of therapeutic effect in 95 children with epilepsy
3 討論
隨著分子遺傳學的發展，多個系統疾病的遺傳學病因被越發關注。神經系統也不例外，尤其是癲癇，越來越多的致病基因被發現。癲癇的致病基因很多，大致可以分為4類，第一類是癲癇基因，是指導致癲癇或以癲癇為核心癥狀的綜合征的基因，目前報道的約有84種；第二類是神經發育相關的癲癇基因，一般是指導致腦發育畸形和癲癇的基因，目前發現約73個；第三類是癲癇關聯基因，主要引起軀體或其他系統異常，合并癲癇或癇性發作的基因，目前大約發現有536個；第四類是可能與癲癇相關的基因，是指與癲癇有關，需要進一步證實的基因，目前發現約284個。不同的癲癇類型，其致病基因也不盡相同。
16例有明確致病基因的癲癇患兒中，1例患兒為嬰兒痙攣癥，該患兒面容特殊合并運動發育遲緩、智力低下。發作表現為屈曲抱團、點頭樣發作，頭顱影像學特點為腦白質發育不良、小腦出血灶可能，缺血缺氧性腦病。心臟超聲示卵圓孔未閉。目前聯合使用兩種AEDs，未控制發作。致病基因是BRAF，為新生突變，c.1391G>T(exon11)，p.G464V，父母c.1391G>T野生型，該基因可導致心面皮膚綜合征(CFC)的發生。CFC是一種常染色體顯性遺傳疾病，臨床上極為罕見。1991年由Reynolds、Baraitser、Patton首次報道，可致腦、胃腸、血管多臟器損害，以面部畸形、先天性心臟、皮膚異常、生長發育遲緩、胃腸道功能障礙、智力障礙及癲癇為主要特征。BRAF基因主要作用于RAS-MAPK傳導通路，該通路是信號轉導級聯反應，主要調節細胞分化，增殖，存活和凋亡[1]；CFC屬心肌細胞群相關疾病，嬰兒痙攣患兒的基因是否與一些心肌細胞發育相關基因有關，這為我們打開一個更廣闊的視角，為癲癇基因的研究提供了更多方向，同時也為癲癇的治療提供了依據。許多研究證明，嬰兒痙攣與另外一些基因，比如神經發育相關的基因有關。目前發現較多的基因如SCN1A、TSC2、TSC1、POXG1等，這些基因突變可引其早發性嬰兒癲癇性腦病。另外還有一些有遺傳基因包括：同源基因(Homologous gene，ARX)[2, 3]、細胞周期蛋白依賴激酶樣5基因(Cyclin-dependent kinase-like 5 gene，CDKL5)[4, 5]、離子通道基因[6, 7]、促黑激素皮質素受體-4基因(Melanocortin receptor-4 gene，MC4R)[8]等。6例臨床診斷為Dravet綜合征患兒均有明確致病基因，突變基因均為SCN1A基因。其中3例患兒出現強直陣攣發作，2例表現為肌陣攣發作，1例表現為局灶性發作，1例表現為不典型失神。4例患兒合并有不同程度的智力運動的發育倒退。1例患兒口服一種AEDs，5例患兒口服兩種以上的AEDs，其中3例患兒在二線添加使用LTG時加重，調換其他藥物后發作次數明顯減少，有1例患兒得到控制，另外5例患兒仍有較頻繁的發作，臨床治療效果差。基因檢測結果示6例患兒均為鈉離子通道SCN1A基因的新生突變，其中4例為新生剪切突變，2例為錯義突變，新生突變。新生突變即父母無此基因的變異以及臨床表現，一般少利多害。Dravet綜合征患兒多1歲起病，首次發作均表現為熱性驚厥，之后發作多不伴發熱，且發作形式多樣。有研究報告，Dravet綜合征的大部分患兒有SCNlA基因突變，大約占60%~80%左右[9-11]。不同種族的研究報告表明，SCN1A基因突變率約占1/3[12]。SCN1A基因主要編碼神經元鈉離子通道，Dravet綜合征患兒在治療時應盡量不選用奧卡西平等鈉離子通道阻滯劑，但有項研究表明，奧卡西平等并不能使癲癇的發作次數增多[13]，LTG可能會加重SCN1A基因突變的癲癇患兒癥狀，應避免使用，但本研究例數少，需要擴大樣本量進一步分析。另外9例有明確致病基因的癲癇患兒中，2例患兒的致病基因為SCN1A基因，2例為FLNA基因突變，其余患兒的致病基因分別為TSC1，TSC2，CASK、STS、KCNQ2。2例癲癇患兒的SCN1A基因均為新生突變，一個為錯義突變，一個為剪切突變，臨床均合并有不同程度的智力低下，發作形式均為肌陣攣，均口服兩種以上的AEDs，療效為顯效。SCN1A基因目前報道較多，由于鈉離子通道亞單位的編碼基因突變導致癲癇的發生，同時也是多種疾病的致病基因，包括Dravet綜合征、FS+、GEFS+、家族性偏癱性偏頭疼等，一般為常染色體顯性遺傳。2例癲癇患兒合并有TSC，面部及軀干均可見多個大小不一的牛奶斑，頭顱影像學可見多個鈣化點。1例患兒應用VPA單藥治療，控制3月未發作，未出現智力或行為能力倒退。另外1例患兒三種AEDs聯合應用，控制不佳，已影響生活學習。突變基因分別為為TSC1，TSC2，均為新生突變，致病性顯著。結節性硬化是嬰兒痙攣癥常見的合并癥。有報道超過80%的癲癇患兒＜1歲時即有癲癇發作[14]大約一半的患兒為嬰兒痙攣[15]，其明確的致病基因是TSC1，TSC2，兩基因突變率比約為3.4 :1[16]，有學者研究表明，TSC1基因突變的類型很多，包括無義突變、錯義突變，微小片段的插入或大片段的缺失等，且TSC1突變所致的臨床表型要輕于TSC2，TSC2突變的患兒往往合并有不同程度的智力低下，另外TSC2突變也可見于肝血管肌脂瘤等疾病中。本研究中TSC1基因突變所致的癲癇合并結節性硬化的患兒臨床癥狀輕，治療效果優于TSC2基因突變的患兒，與既往報道相符。1例癲癇患兒合并有小頭畸形、小腦及腦橋發育不良，智力障礙等，頭顱影像學提示雙側大腦半球腦回寬平，腦溝變淺，腦白質發育不良，小頭畸形，小腦萎縮，患兒面容特殊，生長發育落后，該患兒與其母親臨床特征相似，突變基因相同，為母源突變。癲癇發作表現形式為肌陣攣，目前兩種AEDs聯合使用，治療效果差，未控制。其致病基因為CASK，c.1837C>T，p.R613X, 309，屬于無義突變，突變來自其母親。該基因突變可引起的嚴重神經發育異常，主要使神經細胞遷移紊亂，導致無腦回畸形以及嚴重小腦和海馬發育不全等[17]，有報道稱該基因在女性中突變致使病理特征表現更明顯[18]。該基因是神經發育相關的基因，目前報道甚少，為最新發現，這為癲癇的致病基因的隊伍增添了新的一員。1例癲癇患兒突變基因為KCNQ2，為新生突變，同時合并有CPS1基因突變，KCNQ2基因突變可使鉀離子亞單位通道的編碼基因突變，影響腦和神經的發育，從而致使癲癇的發生，是一種常染色體顯性遺傳。另外，KCNQ2基因同時還是嬰兒早發性的癲癇性腦病及良性家族性新生兒驚厥的致病基因。既往有報道，母源遺傳的KCNQ2基因突變也很多。該例患兒合并有智力低下，臨床發作形式是陣攣發作，聯合兩種AEDs使用，療效為顯效，有學者研究，依佐加濱對KCNQ2基因突變引起的癲癇的治療效果好，由于該藥不常見，未廣泛應用于臨床，其作用機制及臨床療效還不是很明確。1例癲癇患兒為FLNA基因突變，發病機制為X染色體顯性遺傳，為新生突變，是半合子遺傳，臨床以強直形式起病，聯合兩種AEDs治療，控制發作，該基因是X-連鎖的腦室旁結節性異位的致病基因，主要影響大腦神經元的遷移，導致癲癇的發生。1例癲癇患兒突變基因為STS，屬于半合子新生突變，該患兒起病年齡為1歲2個月，目前發作形式為肌陣攣，口服使用兩種AEDs，未能控制發作，屬于難治性癲癇。有報道STS基因與智力障礙有關，多以肌陣攣形式起病，常常合并有智力低下和語言障礙，該基因目前報道的不多，其致病機制還待進一步研究，也有報道稱該基因與X-連鎖魚鱗病有關。本研究16例明確致病基因的患兒，13例患兒口服兩種以上的AEDs治療，效果較差。
突變基因可能致病的癲癇患兒有21例，臨床表現為強直發作的患兒6例，肌陣攣發作9例，失張力3例，痙攣發作3例，1例合并神經肌肉病變，2例合并智力障礙。其中3例臨床診斷為嬰兒痙攣癥，1例癲癇患兒為DIAPH3基因聯合RNF213基因突變，均為錯義突變，突變來自父親，突變位點報道有致病性，但該患兒父親無臨床表現，考慮可能與遺傳異質性有關。1例為ABCC8基因聯合RANBP2基因突變的癲癇患兒，為剪切突變，突變位點未見致病報道，為母源突變, ABCC8是家族性高胰島素低血糖癥1型，母親無相關臨床表現，但生物軟件功能預測可能致病。另外一例患兒突變基因是ASPM，該基因是原發性小頭畸形的突變基因，突變位點未見文獻報道，功能預測可能有害，突變來來自于母親，母親無相關臨床表現，考慮與遺傳異質體有關。3例患兒中，有1例患兒三種AEDs聯合應用, 未控制發作，2例患兒兩種AEDs聯合應用，療效為2例顯效，1例無效；2例患兒有DMD基因變異，均為雜合突變，母系來源，均為為移碼變異，該基因是杜氏/貝氏肌營養不良的致病基因，2例患兒臨床口服兩種AEDs治療，療效為有效。2例患兒有KCNT1基因變異，均為雜合突變，母系來源，母親無相關臨床表現，考慮遺傳異質體可能性大，該基因被報道是夜間額葉癲癇及早期嬰兒癲癇腦病的致病基因，該2例患兒臨床為強直陣攣發作，目前均口服1種AED單藥治療，療效為控制，1例患兒檢測有SMN1基因7，8號外顯子純合缺失變異，氨基酸變化為剪切突變，突變位點致病未見報道。4例患兒基因既往報道與癲癇相關，突變基因分別為GRIN3B、SV2A、KACNF1、KCNH8，該4例患兒均為雜合突變，父系、母系來源各2例，父母均無臨床特征，臨床均為單藥治療，療效為控制；1例患兒的突變基因為KANK1，純合突變，為移碼變異，考慮可能致病，該基因被報道是痙攣性腦性癱瘓的致病基因，患兒臨床為痙攣發作，口服三種藥物治療，療效無效，1例患兒的致病基因為SYNE1，為雜合突變，突變位點報道有致病性，父母無相關臨床表現，該基因被報道是Emer-Dreifuss肌營養不良4型的致病基因；5例患兒的致病基因是SCN9A，2例患兒檢測到的突變基因為CLCN2，該基因有1個雜合突變，為剪切突變，來自父親，父親考慮致病可能性大，無先關臨床特征，考慮遺傳異質體的可能。該基因是特發性全面性癲癇、青少年失神癲癇和青少年肌陣攣癲癇的易感基因，患兒目前應用兩種AEDs治療，療效為顯效。總結來說，變異基因可能致病，其原因可能有以下三點：①先證者基因變異的形式多為錯義變異，這種變異很大程度上會對蛋白質功能造成影響，父母該位點表現為一方或雙方為雜合子，該變異位點無致病性，或可能有致病性但尚未見文獻報道，人群中出現極少，發生率極低，不屬于多態性變化；②先證者基因被報導是非癲癇疾病的致病基因，遺傳方式未明，而先證者與父母均未有該疾病相關的臨床表現，但仍需要考慮先證者及父母臨床特征不完全外顯的可能；③基因檢測技術上存在的局限性，比如基因組DNA上檢測到的變異未必都能體現在該基因所有mRNA變體序列中。
不致病的突變基因有30例，其中臨床表現為強直-陣攣發作的患兒9例，肌陣攣發作7例，陣攣發作3例，失張力1例，痙攣發作1例，不能分類的發作9例。3例合并智力障礙。18例患兒口服2種AEDs治療，12例患兒AED單藥治療，控制3例，有效者14例，顯效9例，無效4例。突變基因不支持致病的原因主要是該些突變基因的遺傳方式為常染色體隱性遺傳(Autosomal recessive, AR)疾病，盡管臨床特征有一定的匹配度，蛋白結構經軟件預測可能有害，但查找正常人數據庫中未見收錄，而且患兒為雜合子，父母無攜帶有相同臨床特征，單一雜合變異不會導致發病，不符合AR疾病的發病機制。無致病基因的患兒臨床特征比較輕，治療效果可，本研究中的30例患兒預后較好，未發現智力發育落后的癲癇患兒。
近年來，基因在神經系統疾病中的研究越來越明確，比如嬰兒痙攣癥、Dravet等[19]，明確突變基因特點可幫助研制新型AEDs以及提供靶向治療途徑。
本研究中發現CASK、BRAF兩個新的致病基因，國內報道甚少，在一定意義上擴充了神經發育相關的癲癇基因和癲癇關聯基因的數目。SCN1A基因突變所致的Dravet綜合征的患兒的臨床特征更嚴重，包括起病更早、發作頻繁、治療效果差。有明確致病基因的患兒，多數需要兩種或以上AEDs聯合應用，治療上困難。
