引用本文： 楊小林, 張曉青, 陳兵, 李維, 楊梅花, 陳欣, 張偉, 楊輝, 鄒麗萍, 劉仕勇. 促腎上腺皮質激素釋放激素及受體在嬰兒痙攣癥致癇組織中的表達. 癲癇雜志, 2017, 3(1): 3-14. doi: 10.7507/2096-0247.20170001 復制
嬰兒痙攣癥(Infantile spasm, IS)是以年齡依賴性為特征的一種癲癇綜合征, 主要臨床特征為點頭樣痙攣發作、腦電圖(EEG)呈高峰節律紊亂，且常伴精神發育遲滯，其發病機制尚不清楚。1958年Sorel和Dusaucy-Bayloye發現用促腎上腺皮質激素(Adrenocorticotropic hormone, ACTH)治療IS有效[1]，至今仍是IS治療的首選藥物，但其作用機理尚未闡明。已發現IS患者腦脊液中ACTH和皮質醇都低于正常對照[2]，進一步研究提示ACTH是通過抑制促腎上腺皮質激素釋放激素(Corticotropin releasing hormone, CRH)在杏仁核中的表達發揮其抗癲癇作用[3]。已有較多動物實驗結果顯示CRH具有促癲癇作用，增加未成熟腦的興奮性。因此，有學者認為IS是腦內CRH過多引起，但至今仍缺乏對IS患者腦組織的直接研究依據[4]。
CRH在大腦主要有兩個受體--促腎上腺皮質激素釋放激素1型受體(Corticotropin releasing hormone receptor 1, CRHR1)和2型受體CRHR2，CRH對CRHR1的親和性較強，CRHR1被認為是CRH發揮效應的重要受體[5]。CRHR1和CRHR2屬于G蛋白偶聯受體家族，與CRH結合后啟動環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)及三磷酸肌醇(Inositol 1，4，5-triphosphate，IP3)，進一步激活細胞內蛋白激酶A (Protein kinase A, PKA)和蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC)等信號途徑發揮生物學效應[6]。PKC與癲癇發作關系密切，激活大鼠海馬神經元PKC的電生理研究發現PKC與癲癇易感性有著重要的關系，參與癲癇的發生與維持機制[7]。CRH、CRHR1及其下游信號在人IS致癇灶中的作用尚不清楚，本研究檢測CRH、CRHR1在IS患者致癇灶中的表達，進一步分析下游PKC信號分子的變化，有助于了解其在IS癲癇發作中的作用。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取第三軍醫大學新橋醫院腦標本庫中的IS患者手術標本(2011年6月-2014年6月)。所有標本的采集都在第三軍醫大學倫理委員會的指導下進行，腦標本的使用都符合赫爾辛基宣言，無任何為了試驗目的而進行的標本采集與使用。入選標準：①符合IS的診斷標準, 即嬰兒期起病且具有IS的3個特征：點頭樣痙攣發作、EEG高峰節律紊亂和精神發育遲滯；②包括ACTH及強的松在內的多種抗癲癇藥物(AEDs)治療無效，是手術介入的適應證[8]；③術前臨床癥狀學、EEG及頭顱核磁共振(MRI)和正電子發射斷層顯像(PET)檢查等術前評估能夠確定致癇灶。本組入選標本17例(表 1)。正常對照來自6例尸檢，平均年齡2.8(1~5)歲，尸檢時間＜24 h，均無癲癇相關病史，應激史及神經系統疾病，死亡前無瀕死期(表 2)。
表1
IS患者的臨床和神經病理學資料
Table1.
The clinical and neuropathological data in patients with IS
表2
對照組臨床資料
Table2.
Clinical data of control group
1.2 組織準備
所有組織標本在獲得時立即分成兩份，一份浸泡于10%福爾馬林緩沖液固定24 h后石蠟包埋, 石蠟包埋組織被切割成5 μm片用于HE染色及免疫組織化學染色，其他樣本放于液氮冷凍。冷凍樣本保持在-80℃冰箱用于Real-time PCR和Western Blot分析。
1.3 研究方法
1.3.1 Real-time PCR
用Real-time PCR檢測IS致癇灶和尸檢正常組織總RNA樣本。用Trizol試劑(Invitrogen, La Jolla, CA)分離每個樣本總RNA。NanoDropspectrophotometer (Ocean Optics, Dunedin, FL, USA)分光光度計在260/280 nm光下進行濃度和純度鑒定。按反轉錄試劑盒(TakaRa, Otsu, Japan)說明，用1 μg RNA反轉錄得到cDNA。Real-time PCR反應所用引物由TAKARA生物技術有限公司合成(大連, 中國)，如下：CRH (forward：tccgagg agcctcccatc，reverse：aatctccatgagtttcctgttgc)，CRHR1(forward：gcctctgactcaccacgatg，reverse：tctgatgatgacac ctgacttctg)，β-actin (forward：gcaccacaccttctacaatgagc，reverse：tagcacagcctggatagcaacg)，CRHR2(forward: tcagccgtgaggaagaggtg, reverse: ggccgtctgcttgatgctgt)。Real-time PCR反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，CRH引物53.9℃延伸30 s (CRHR1引物53.9℃)，65℃溶解曲線，40個循環。mRNA表達水平的相對定量用2-△△CT法計算。所有樣本都作3個復孔，每個基因重復2次。
1.3.2 Western blot
用Western Blot分析IS致癇灶與正常對照勻漿液。取100 mg冰凍標本按1：5 mL加裂解液勻漿機勻漿10 s，4℃下離心15 min，吸取上清置新EP管，用Bradford protein assay (Beyotime, China)測量總蛋白濃度及品質。將10%SDS膠置于電泳緩沖液中每孔點樣50 μg蛋白量電泳分離。在甘氨酸轉移緩沖液中恒流300 mA、80 min轉膜，后置于用TBST液配置的5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加CRH單克隆兔抗人(1：2 000; Abcam, UK)，CRHR1多克隆羊抗人(1：500; Abcam, UK), PKC多克隆鼠抗人(1：600，Boster，China)，PKA多克隆兔抗人(1：400，Boster，China)，GAPDH單克隆兔抗人(1：1 000, CST, Beverly, USA)；4℃孵育過夜，TBST漂洗后加辣根過氧化物酶標記二抗37℃孵育1 h。GAPDH的表達水平作內參，化學發光法顯影。
1.3.3 免疫組織化學及雙標熒光染色
將石蠟包埋標本切5 μm片，貼片于防脫載玻片置60°烤箱1~2 h，取出脫蠟至水，常規HE染色，其余切片在0.3%雙氧水甲醇稀釋液中常溫孵育30 min去除內源性過氧化物酶。置800 ml PBS (0.01 μmol/L, pH 7.3)中微波抗原修復(中高火20 min，室溫冷卻)，分別加CRH單克隆兔抗人(1：400; Abcam, UK)，CRHR1多克隆羊抗人(1：100; Abcam, UK), PKC多克隆鼠抗人(1：100，Boster，China)一抗4℃過夜，0.01 mmol/L PBS漂洗，加二抗37℃孵育1 h，用DAB顯色，蘇木素復染，陰性對照不加一抗，中性樹膠封片顯微鏡下觀察照相。熒光雙標染色，加CRH單克隆兔抗人(1：250; Abcam, UK)，CRHR1多克隆羊抗人(1：50; Abcam, UK), PKC多克隆鼠抗人(1：50，Boster，China)，分別混合NF200單克隆鼠抗人(1：100，Boster，China), NF200多克隆兔抗人(1：200，Abcam，UK)，GFAP單克隆鼠抗人(1：400，Sigma), GFAP單克隆兔抗人(1：400，Abcam)，HLA單克隆鼠抗人(1：200, Dako, Denmark)，HLA單克隆兔抗人(1：200, Abcam)一抗4℃過夜，0.01 mmol/LPBS漂洗后加混合FITC結合二抗和AlexaFluor 594結合二抗(1：200; Boster, China)37℃孵育1 h，DAPI (10 μg/mL, Beyotime, China)染細胞核，熒光淬滅劑封片在激光共聚焦顯微鏡(TCS-TIV; Leica, Nussloch, Germany)下觀察照相。
1.3.4 免疫組織化學染色評估分析方法
免疫組織化學染色IPP (Image Pro Plus)軟件評估，每個標本隨機選取3張切片，在×400視野下，于皮質逐層分別隨機選取10個非重復區域，通過顯微鏡在1360×1024分辨率下拍攝圖片；用IPP測量每張圖片平均光密度值(Density mean, DM)，即我們首先校正光密度，設置感興趣區色調為0~39，色彩飽和度0~255，強度0~255，然后把圖片轉換為灰度圖片并計算其DM。
1.4 統計學方法
運用SPSS軟件分析。數據均以均數±標準差表示，組間差異行單因素方差分析，用Spearman等級相關性分析法分析CRH、CRHR1和PKC之間的相關性，以及和臨床特征的相關性。P值＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 病例資料
研究入組17例IS患者標本，男12例，女5例。手術時平均月齡為29.4(9~58)個月，首次癲癇發作平均月齡為6.3(1~30)個月，病程19.2(8~46)個月。所有患兒都主要表現為頻繁的痙攣性發作，部分患兒尚具有部分性發作和強直性發作，術前每月平均發作頻率304(120~900)次。所有患兒均進行充分的術前評估，可以確定致癇灶位置并進行手術切除。所有患兒均行磁共振(MRI)和正電子斷層掃描成像(PET)檢查，MRI顯示15例病灶，包括皮質發育障礙8例，萎縮或軟化病灶7例；PET掃描17例均顯示局灶性(11例)或半球性(6例)代謝減低，其中15例與MRI吻合，另其余2例與EEG吻合。EEG均表現為間歇期高度節律失常(8例)或變異型高度節律失常(9例，既往曾EEG顯示典型高度節律失常)，發作期均顯示為局灶起源(13例)或一側半球起源(4例)。手術均采用局灶(7例)、灶中為中等至強的CRH (圖 2c)表達于神經元。弱至中等CRHR1表達于神經元及膠質細胞(圖 3b)，一側半球多腦葉(6例)或半球切除(4例)。手術預后采用Engel分級：Ⅰ級12例，Ⅱ級3例，Ⅲ級2例。
圖1
促腎上腺皮質激素釋放激素和Ⅰ型受體激素在IS組和對照組表達水平的比較
a、b. CRH和CRHR1在IS致癇組織(
a、b. the mRNA expression of CRH and CRHR1 in IS group are higher than control group*
圖2
促腎上腺皮質激素釋放激素免疫組織化學檢測結果
a. IS中FCDIa標本病理學特征; b-l. CRH在對照和IS致癇組織中免疫組化結果，CRH弱表達于對照神經元(b中箭頭)，中等和強表達于IS致癇組織中神經元(c中箭頭), 在IS致癇組織中CRH (綠色)與NF200(紅色)共表達于神經元(d-f箭頭)；GFAP陽性(紅色)星形膠質細胞CRH表達陰性(g-i箭頭)；HLA陽性(紅色)小膠質細胞CRH表達陰性(j-l箭頭).標尺: A-C, 50 μm；D-L 25 μm
Figure2. Immunohistochemical detection results of CRHa. Histopathologic characteristics of FCDIa in IS; b-l. Immunoreactivity (IR) detection results of CRH in control group and IS group. Weak CRHIR in the controls (b arrow), moderate to strong IR in IS (c arrow), CRH (green) and NF200 (red) both expressed in IS (d-f arrows); CRH is negative in GFAP positive astrocyte (g-i arrows); CRH is negative in HLA positive (red) microglial cell (j-l arrows). Scale: a-c, 50 μm; d-l 25 μm
圖3
CRHR1免疫組織化學檢測結果
a. IS中正常標本病理學特征; b-l：CRHR1在對照和IS致癇組織中免疫組化結果; b, c. CRHR1弱度及中度表達于對照神經元(b中箭頭)，中等和強度表達于IS致癇組織中神經元(c中箭頭)，IS致癇組織中CRHR1(綠色)與NF200(紅色)共表達于神經元(d-f箭頭)；CRHR1(綠色)與GFAP (紅色)共表達于星型膠質細胞(g-i箭頭)；CRHR1(綠色)與HLA (紅色)共表達于小膠質細胞(j-l箭頭).標尺: a-c, 50 μm; d-i 25 μm; j-l 10 μm
Figure3. Immunohistochemical detection results of CRHr1a. Histopathologic characteristics of IS; b-l. Immunohistochemical detection results of CRHR1 in control group and IS group. CRHR1 are weak to moderate in the controls (b arrow), moderate to strong in neurons (c arrow), CRHR1 (green) and NF200 (red) both expressed in IS (d-f arrows); CRHR1 (green) and GFAP (red) are both positive in astrocyte (g-i arrows); CRHR1 (green) and HLA (red) are both positive in microglial cell (j-l arrows). Scale: a-c, 50μm; d-i 25 μm; j-l 10 μm
2.2 促腎上腺皮質激素釋放激素和Ⅰ型受體激素的Real-time PCR和Western Blot分析
用Real-time PCR檢測CRH及CRHR1mRNA在IS致癇灶和正常對照中的表達，β-actin mRNA作為內參，結果顯示IS致癇灶中CRH mRNA相對表達量顯著高于對照組(圖 1a)，CRHR1 mRNA在IS致癇灶中的表達較對照組升高(圖 1b)。Western Blot結果顯示CRH (圖 1c)和CRHR1(圖 1e)的蛋白條帶分子量大約為25KDa和50KDa，用GAPDH (37KDa)作為內參作相對OD值分析，結果顯示在IS致癇灶中CRH和CRHR1的蛋白表達水平均明顯高于正常對照(圖 1d、f)。
2.3 促腎上腺皮質激素釋放激素和Ⅰ型受體激素的免疫組織化學分析
用免疫組織化學技術檢測IS致癇灶和正常對照標本中的CRH和CRHR1的表達，結果顯示，正常對照組中弱CRH表達于神經元(圖 2b)，在IS致癇正常中等至強的CRHR1(圖 3c)表達于神經元和膠質細胞。平均光密度也顯示IS致癇灶標本CRH和CRHR1的表達明顯高于對照組(表 3)，用Spearman等級相關性分析發現CRH和CRHR1表達強度與癲癇發作頻率相關(CRH，R=0.671，P＜0.05；CRHR1，R=0.689，P＜0.05)，與其他臨床特征未見明顯相關性。熒光雙標染色顯示CRH與NF200共標于神經元(圖 2d-f)。CRH未與GFAP和HLA共標于星形膠質細胞及小膠質細胞(圖 2g-l)。CRHR1與NF200在神經元共標(圖 3d-f)，與GFAP共標于星型膠質細胞(圖 3g-i)，與HLA共標于小膠質細胞(圖 3j-l)。
表3
對照組和嬰兒痙攣癥標本免疫組織化平均光密度值
Table3.
Density mean of control group and IS group
2.4 PKC的表達及細胞分布
用Western Blot檢測PKC在IS致癇灶和正常對照中的表達，結果顯示PKC的蛋白分子量約為80 KD (圖 4a)，用GAPDH (37 KD)作為內參作相對OD值分析，PKC在IS致癇灶中的蛋白表達水平明顯高于正常對照(圖 4b)。HE染色檢查示IS中膠質細胞非典型增生標本病理學特征(圖 4c)。免疫組織化學分析PKC在IS致癇灶和正常對照中的表達，結果顯示在正常對照為弱至中等的PKC表達于神經元和膠質細胞(圖 4d)，IS致癇灶中為中等至強的PKC表達于神經元和膠質細胞(圖 4e)。平均光密度值也顯示IS在致癇灶標本中PKC的表達較正常對照升高(表 3)。熒光雙標顯示PKC與NF200在神經元共標(圖 4f-h)。與GFAP共標與星形膠質細胞(圖 4i-k)，與HLA共標于小膠質細胞(圖 4l-n)。我們進一步評估了PKC的表達與CRHR1表達強度的相關性，用Spearman等級相關性分析發現PKC的表達強度與CRHR1的表達強度有相關性(R=0.855，P＜0.01)，與癲癇發作頻率相關(R=0.72，P＜0.05)，與其他臨床特征未見明顯相關性。見圖 5。
圖4
PKC的表達及細胞分布
a, b. PKC在IS致癇組織中的表達較對照組明顯增高(**
a, b. The expression of PKC is higher in IS group than control group (**
圖5
嬰兒痙攣癥癲癇性痙攣與促腎上腺皮質激素釋放激素和Ⅰ型受體, PKC表達相關性分析
a, b, c.散點圖顯示CRH，CRHR1和PKC的表達與IS癲癇性痙攣之間成正相關關系，Spearman等級相關系數：CRH: R=0.671,
a, b, c. Scatter diagram showed positive correlation between the expression of CRH, CRHR1, PKC with epileptic spasm in IS patients, Spearman coefficient: CRH: R=0.671,
3 討論
本研究發現在IS患者致癇灶標本中，CRH和CRHR1在mRNA水平及蛋白水平的表達較對照組明顯升高。CRH主要在神經元表達，其受體CRHR1則分布于神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞。CRH和CRHR1的表達水平與IS癲癇性痙攣發作頻率有相關性。免疫組織化學和Western blot檢測發現PKC高表達于IS致癇灶，且與CRHR1的表達水平及癲癇發作頻率存在相關性。結果提示：CRH-CRHR1-PKC信號通路可能參與IS的發病機制。
目前的研究表明在人IS患者腦脊液，ACTH和皮質醇都低于正常對照，而在IS動物模型中ACTH可抑制新生鼠海馬CRH的表達發揮抗驚厥作用，據此推測腦組織中CRH表達過多誘導了IS發病[2, 3]。在動物實驗中發現CRH能誘導不成熟大鼠驚厥，CRH注入大鼠側腦室引起癲癇發作的劑量具有年齡依賴性，如在出生兩周的大鼠比成年鼠小200多倍[9, 10]。在大鼠海馬培養腦片實驗顯示海馬多個亞區的興奮性受到CRH的調節[9, 11]。對全身性癲癇發作患者尸檢的結果也顯示：大腦皮層CRH mRNA較對照組表達升高[12]。因此，Kristen等推測CRH可作用于大腦特異性皮質區而誘導IS癲癇發作，并提出IS的CRH發病假說[13]。但CRH發病學說尚未在IS患者致癇灶標本中獲得直接支持依據。我們研究首次發現IS患者腦致癇灶中CRH明顯升高，其受體CRHR1和下游信號PKC激活，且與癲癇發作頻率相關，提示局部腦組織CRH過多有可能參與了IS癲癇發作機制。
在CRH的受體中，由于CRHR1的高親和性和在腦內的分布特異性使其發揮主要作用。CRH與CRHR1結合后調節下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能，與應激、神經再生、神經免疫、肥胖及一些精神性疾病有關。CRH誘導的不成熟大鼠腦邊緣性癲癇發作可以被CRHR1受體阻斷劑阻斷，提示CRH誘導不成熟腦驚厥作用可能由CRHR1介導[14]。該研究對人IS致癇灶標本的結果進一步支持這一觀點，即CRHR1可能是IS中CRH發揮作用的重要受體。已經證實，在未成熟大腦，CRH可誘導CRHR1在細胞膜表達，而在較大年齡或成熟大鼠腦，這種CRH誘導CRHR1的作用減弱[15, 16]。本組對低齡(＜5歲)兒童腦組織標本的研究中發現CRH與CRHR1同時高表達現象，且與癲癇發作的頻率相關，這也提示CRH可能誘導未成熟腦CRHR1的表達，從而在特定的未成熟腦發育階段參與IS的特殊發病機制。IS具有起病于低齡嬰兒，在腦發育成熟后痙攣發作消失的年齡依賴性臨床特點，與CRH在未成熟腦特定發育階段誘發癲癇和誘導CRHR1表達的現象相吻合，支持IS的CRH發病學說。
CRHR1的激活可以啟動下游多個信號通路，如PKA、PKC等發揮其生物學效應。在小鼠海馬神經元已經證實CRH通過CRH受體偶聯Gs和Gq蛋白影響PKA和PKC信號通路[17]。進一步對海馬錐體神經元的電生理研究發現PKC與癲癇易感性有著重要的關系，涉及到癲癇的發生與維持機制，可引起興奮性突觸傳遞的增強和增加突觸后神經元的興奮性[7]。在癲癇持續狀態動物模型，PKC的激活可增強N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)受體的表達，減少神經肽Y對谷氨酸釋放的抑制，從而具有癲癇促進作用和潛在的癲癇誘導作用[18]。在培養的海馬神經元PKC的抑制可拮抗CRH誘導的NMDA電流[19]。電點燃大鼠癲癇模型海馬中PKC膜相關性活性大大增加，PKC注入海馬腦片錐體神經元，增強了興奮性突觸后電位和點燃率[20]。我們研究在IS人體標本中發現PKC增高，并與上游CRHR1的表達和IS癲癇發作相關，提示PKC細胞內信號轉導途徑可能是CRH參與IS癲癇發病的重要機制，具體的作用靶標尚需進一步研究。
CRH可能通過PKC的作用促使星形膠質細胞增殖以及細胞胞質內Ga2+濃度升高[21, 22]，引起膠質細胞鈣依賴性谷氨酸以及其他膠質遞質的釋放，從而增強局部腦組織興奮性。并且CRH可誘導小鼠前腦原代小膠質細胞凋亡來調節神經炎癥反應[23]。CRH與CRHR1結合通過ROI信號通路調節小鼠小膠質細胞分泌IL-18，也可促進腫瘤死因子-α和Fas-L的表達[24, 25]。本研究中發現，CRH主要表達于神經元，而其受體CRHR1和下游信號PKC高表達于神經元和膠質細胞，提示CRH可能由神經元分泌，作用于神經膠質細胞而誘導IS癲癇發作；同時我們發現CRHR1和PKC表達于小膠質細胞，提示CRH誘導的炎癥反應也可能參與IS的發病過程，炎癥與癲癇發病的關系已被大量研究所證實。
綜上，我們首次在人體腦標本發現CRH、CRHR1及其下游信號PKC高表達于IS致癇灶，且與癲癇痙攣發作有相關性，提示CRH信號途徑可能參與了IS的發病機制。這些結果可為解釋ACTH治療IS有效提供依據，并為進一步篩選IS的治療靶點提供線索。
嬰兒痙攣癥(Infantile spasm, IS)是以年齡依賴性為特征的一種癲癇綜合征, 主要臨床特征為點頭樣痙攣發作、腦電圖(EEG)呈高峰節律紊亂，且常伴精神發育遲滯，其發病機制尚不清楚。1958年Sorel和Dusaucy-Bayloye發現用促腎上腺皮質激素(Adrenocorticotropic hormone, ACTH)治療IS有效[1]，至今仍是IS治療的首選藥物，但其作用機理尚未闡明。已發現IS患者腦脊液中ACTH和皮質醇都低于正常對照[2]，進一步研究提示ACTH是通過抑制促腎上腺皮質激素釋放激素(Corticotropin releasing hormone, CRH)在杏仁核中的表達發揮其抗癲癇作用[3]。已有較多動物實驗結果顯示CRH具有促癲癇作用，增加未成熟腦的興奮性。因此，有學者認為IS是腦內CRH過多引起，但至今仍缺乏對IS患者腦組織的直接研究依據[4]。
CRH在大腦主要有兩個受體--促腎上腺皮質激素釋放激素1型受體(Corticotropin releasing hormone receptor 1, CRHR1)和2型受體CRHR2，CRH對CRHR1的親和性較強，CRHR1被認為是CRH發揮效應的重要受體[5]。CRHR1和CRHR2屬于G蛋白偶聯受體家族，與CRH結合后啟動環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)及三磷酸肌醇(Inositol 1，4，5-triphosphate，IP3)，進一步激活細胞內蛋白激酶A (Protein kinase A, PKA)和蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC)等信號途徑發揮生物學效應[6]。PKC與癲癇發作關系密切，激活大鼠海馬神經元PKC的電生理研究發現PKC與癲癇易感性有著重要的關系，參與癲癇的發生與維持機制[7]。CRH、CRHR1及其下游信號在人IS致癇灶中的作用尚不清楚，本研究檢測CRH、CRHR1在IS患者致癇灶中的表達，進一步分析下游PKC信號分子的變化，有助于了解其在IS癲癇發作中的作用。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取第三軍醫大學新橋醫院腦標本庫中的IS患者手術標本(2011年6月-2014年6月)。所有標本的采集都在第三軍醫大學倫理委員會的指導下進行，腦標本的使用都符合赫爾辛基宣言，無任何為了試驗目的而進行的標本采集與使用。入選標準：①符合IS的診斷標準, 即嬰兒期起病且具有IS的3個特征：點頭樣痙攣發作、EEG高峰節律紊亂和精神發育遲滯；②包括ACTH及強的松在內的多種抗癲癇藥物(AEDs)治療無效，是手術介入的適應證[8]；③術前臨床癥狀學、EEG及頭顱核磁共振(MRI)和正電子發射斷層顯像(PET)檢查等術前評估能夠確定致癇灶。本組入選標本17例(表 1)。正常對照來自6例尸檢，平均年齡2.8(1~5)歲，尸檢時間＜24 h，均無癲癇相關病史，應激史及神經系統疾病，死亡前無瀕死期(表 2)。
表1
IS患者的臨床和神經病理學資料
Table1.
The clinical and neuropathological data in patients with IS
表2
對照組臨床資料
Table2.
Clinical data of control group
1.2 組織準備
所有組織標本在獲得時立即分成兩份，一份浸泡于10%福爾馬林緩沖液固定24 h后石蠟包埋, 石蠟包埋組織被切割成5 μm片用于HE染色及免疫組織化學染色，其他樣本放于液氮冷凍。冷凍樣本保持在-80℃冰箱用于Real-time PCR和Western Blot分析。
1.3 研究方法
1.3.1 Real-time PCR
用Real-time PCR檢測IS致癇灶和尸檢正常組織總RNA樣本。用Trizol試劑(Invitrogen, La Jolla, CA)分離每個樣本總RNA。NanoDropspectrophotometer (Ocean Optics, Dunedin, FL, USA)分光光度計在260/280 nm光下進行濃度和純度鑒定。按反轉錄試劑盒(TakaRa, Otsu, Japan)說明，用1 μg RNA反轉錄得到cDNA。Real-time PCR反應所用引物由TAKARA生物技術有限公司合成(大連, 中國)，如下：CRH (forward：tccgagg agcctcccatc，reverse：aatctccatgagtttcctgttgc)，CRHR1(forward：gcctctgactcaccacgatg，reverse：tctgatgatgacac ctgacttctg)，β-actin (forward：gcaccacaccttctacaatgagc，reverse：tagcacagcctggatagcaacg)，CRHR2(forward: tcagccgtgaggaagaggtg, reverse: ggccgtctgcttgatgctgt)。Real-time PCR反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，CRH引物53.9℃延伸30 s (CRHR1引物53.9℃)，65℃溶解曲線，40個循環。mRNA表達水平的相對定量用2-△△CT法計算。所有樣本都作3個復孔，每個基因重復2次。
1.3.2 Western blot
用Western Blot分析IS致癇灶與正常對照勻漿液。取100 mg冰凍標本按1：5 mL加裂解液勻漿機勻漿10 s，4℃下離心15 min，吸取上清置新EP管，用Bradford protein assay (Beyotime, China)測量總蛋白濃度及品質。將10%SDS膠置于電泳緩沖液中每孔點樣50 μg蛋白量電泳分離。在甘氨酸轉移緩沖液中恒流300 mA、80 min轉膜，后置于用TBST液配置的5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加CRH單克隆兔抗人(1：2 000; Abcam, UK)，CRHR1多克隆羊抗人(1：500; Abcam, UK), PKC多克隆鼠抗人(1：600，Boster，China)，PKA多克隆兔抗人(1：400，Boster，China)，GAPDH單克隆兔抗人(1：1 000, CST, Beverly, USA)；4℃孵育過夜，TBST漂洗后加辣根過氧化物酶標記二抗37℃孵育1 h。GAPDH的表達水平作內參，化學發光法顯影。
1.3.3 免疫組織化學及雙標熒光染色
將石蠟包埋標本切5 μm片，貼片于防脫載玻片置60°烤箱1~2 h，取出脫蠟至水，常規HE染色，其余切片在0.3%雙氧水甲醇稀釋液中常溫孵育30 min去除內源性過氧化物酶。置800 ml PBS (0.01 μmol/L, pH 7.3)中微波抗原修復(中高火20 min，室溫冷卻)，分別加CRH單克隆兔抗人(1：400; Abcam, UK)，CRHR1多克隆羊抗人(1：100; Abcam, UK), PKC多克隆鼠抗人(1：100，Boster，China)一抗4℃過夜，0.01 mmol/L PBS漂洗，加二抗37℃孵育1 h，用DAB顯色，蘇木素復染，陰性對照不加一抗，中性樹膠封片顯微鏡下觀察照相。熒光雙標染色，加CRH單克隆兔抗人(1：250; Abcam, UK)，CRHR1多克隆羊抗人(1：50; Abcam, UK), PKC多克隆鼠抗人(1：50，Boster，China)，分別混合NF200單克隆鼠抗人(1：100，Boster，China), NF200多克隆兔抗人(1：200，Abcam，UK)，GFAP單克隆鼠抗人(1：400，Sigma), GFAP單克隆兔抗人(1：400，Abcam)，HLA單克隆鼠抗人(1：200, Dako, Denmark)，HLA單克隆兔抗人(1：200, Abcam)一抗4℃過夜，0.01 mmol/LPBS漂洗后加混合FITC結合二抗和AlexaFluor 594結合二抗(1：200; Boster, China)37℃孵育1 h，DAPI (10 μg/mL, Beyotime, China)染細胞核，熒光淬滅劑封片在激光共聚焦顯微鏡(TCS-TIV; Leica, Nussloch, Germany)下觀察照相。
1.3.4 免疫組織化學染色評估分析方法
免疫組織化學染色IPP (Image Pro Plus)軟件評估，每個標本隨機選取3張切片，在×400視野下，于皮質逐層分別隨機選取10個非重復區域，通過顯微鏡在1360×1024分辨率下拍攝圖片；用IPP測量每張圖片平均光密度值(Density mean, DM)，即我們首先校正光密度，設置感興趣區色調為0~39，色彩飽和度0~255，強度0~255，然后把圖片轉換為灰度圖片并計算其DM。
1.4 統計學方法
運用SPSS軟件分析。數據均以均數±標準差表示，組間差異行單因素方差分析，用Spearman等級相關性分析法分析CRH、CRHR1和PKC之間的相關性，以及和臨床特征的相關性。P值＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 病例資料
研究入組17例IS患者標本，男12例，女5例。手術時平均月齡為29.4(9~58)個月，首次癲癇發作平均月齡為6.3(1~30)個月，病程19.2(8~46)個月。所有患兒都主要表現為頻繁的痙攣性發作，部分患兒尚具有部分性發作和強直性發作，術前每月平均發作頻率304(120~900)次。所有患兒均進行充分的術前評估，可以確定致癇灶位置并進行手術切除。所有患兒均行磁共振(MRI)和正電子斷層掃描成像(PET)檢查，MRI顯示15例病灶，包括皮質發育障礙8例，萎縮或軟化病灶7例；PET掃描17例均顯示局灶性(11例)或半球性(6例)代謝減低，其中15例與MRI吻合，另其余2例與EEG吻合。EEG均表現為間歇期高度節律失常(8例)或變異型高度節律失常(9例，既往曾EEG顯示典型高度節律失常)，發作期均顯示為局灶起源(13例)或一側半球起源(4例)。手術均采用局灶(7例)、灶中為中等至強的CRH (圖 2c)表達于神經元。弱至中等CRHR1表達于神經元及膠質細胞(圖 3b)，一側半球多腦葉(6例)或半球切除(4例)。手術預后采用Engel分級：Ⅰ級12例，Ⅱ級3例，Ⅲ級2例。
圖1
促腎上腺皮質激素釋放激素和Ⅰ型受體激素在IS組和對照組表達水平的比較
a、b. CRH和CRHR1在IS致癇組織(
a、b. the mRNA expression of CRH and CRHR1 in IS group are higher than control group*
圖2
促腎上腺皮質激素釋放激素免疫組織化學檢測結果
a. IS中FCDIa標本病理學特征; b-l. CRH在對照和IS致癇組織中免疫組化結果，CRH弱表達于對照神經元(b中箭頭)，中等和強表達于IS致癇組織中神經元(c中箭頭), 在IS致癇組織中CRH (綠色)與NF200(紅色)共表達于神經元(d-f箭頭)；GFAP陽性(紅色)星形膠質細胞CRH表達陰性(g-i箭頭)；HLA陽性(紅色)小膠質細胞CRH表達陰性(j-l箭頭).標尺: A-C, 50 μm；D-L 25 μm
Figure2. Immunohistochemical detection results of CRHa. Histopathologic characteristics of FCDIa in IS; b-l. Immunoreactivity (IR) detection results of CRH in control group and IS group. Weak CRHIR in the controls (b arrow), moderate to strong IR in IS (c arrow), CRH (green) and NF200 (red) both expressed in IS (d-f arrows); CRH is negative in GFAP positive astrocyte (g-i arrows); CRH is negative in HLA positive (red) microglial cell (j-l arrows). Scale: a-c, 50 μm; d-l 25 μm
圖3
CRHR1免疫組織化學檢測結果
a. IS中正常標本病理學特征; b-l：CRHR1在對照和IS致癇組織中免疫組化結果; b, c. CRHR1弱度及中度表達于對照神經元(b中箭頭)，中等和強度表達于IS致癇組織中神經元(c中箭頭)，IS致癇組織中CRHR1(綠色)與NF200(紅色)共表達于神經元(d-f箭頭)；CRHR1(綠色)與GFAP (紅色)共表達于星型膠質細胞(g-i箭頭)；CRHR1(綠色)與HLA (紅色)共表達于小膠質細胞(j-l箭頭).標尺: a-c, 50 μm; d-i 25 μm; j-l 10 μm
Figure3. Immunohistochemical detection results of CRHr1a. Histopathologic characteristics of IS; b-l. Immunohistochemical detection results of CRHR1 in control group and IS group. CRHR1 are weak to moderate in the controls (b arrow), moderate to strong in neurons (c arrow), CRHR1 (green) and NF200 (red) both expressed in IS (d-f arrows); CRHR1 (green) and GFAP (red) are both positive in astrocyte (g-i arrows); CRHR1 (green) and HLA (red) are both positive in microglial cell (j-l arrows). Scale: a-c, 50μm; d-i 25 μm; j-l 10 μm
2.2 促腎上腺皮質激素釋放激素和Ⅰ型受體激素的Real-time PCR和Western Blot分析
用Real-time PCR檢測CRH及CRHR1mRNA在IS致癇灶和正常對照中的表達，β-actin mRNA作為內參，結果顯示IS致癇灶中CRH mRNA相對表達量顯著高于對照組(圖 1a)，CRHR1 mRNA在IS致癇灶中的表達較對照組升高(圖 1b)。Western Blot結果顯示CRH (圖 1c)和CRHR1(圖 1e)的蛋白條帶分子量大約為25KDa和50KDa，用GAPDH (37KDa)作為內參作相對OD值分析，結果顯示在IS致癇灶中CRH和CRHR1的蛋白表達水平均明顯高于正常對照(圖 1d、f)。
2.3 促腎上腺皮質激素釋放激素和Ⅰ型受體激素的免疫組織化學分析
用免疫組織化學技術檢測IS致癇灶和正常對照標本中的CRH和CRHR1的表達，結果顯示，正常對照組中弱CRH表達于神經元(圖 2b)，在IS致癇正常中等至強的CRHR1(圖 3c)表達于神經元和膠質細胞。平均光密度也顯示IS致癇灶標本CRH和CRHR1的表達明顯高于對照組(表 3)，用Spearman等級相關性分析發現CRH和CRHR1表達強度與癲癇發作頻率相關(CRH，R=0.671，P＜0.05；CRHR1，R=0.689，P＜0.05)，與其他臨床特征未見明顯相關性。熒光雙標染色顯示CRH與NF200共標于神經元(圖 2d-f)。CRH未與GFAP和HLA共標于星形膠質細胞及小膠質細胞(圖 2g-l)。CRHR1與NF200在神經元共標(圖 3d-f)，與GFAP共標于星型膠質細胞(圖 3g-i)，與HLA共標于小膠質細胞(圖 3j-l)。
表3
對照組和嬰兒痙攣癥標本免疫組織化平均光密度值
Table3.
Density mean of control group and IS group
2.4 PKC的表達及細胞分布
用Western Blot檢測PKC在IS致癇灶和正常對照中的表達，結果顯示PKC的蛋白分子量約為80 KD (圖 4a)，用GAPDH (37 KD)作為內參作相對OD值分析，PKC在IS致癇灶中的蛋白表達水平明顯高于正常對照(圖 4b)。HE染色檢查示IS中膠質細胞非典型增生標本病理學特征(圖 4c)。免疫組織化學分析PKC在IS致癇灶和正常對照中的表達，結果顯示在正常對照為弱至中等的PKC表達于神經元和膠質細胞(圖 4d)，IS致癇灶中為中等至強的PKC表達于神經元和膠質細胞(圖 4e)。平均光密度值也顯示IS在致癇灶標本中PKC的表達較正常對照升高(表 3)。熒光雙標顯示PKC與NF200在神經元共標(圖 4f-h)。與GFAP共標與星形膠質細胞(圖 4i-k)，與HLA共標于小膠質細胞(圖 4l-n)。我們進一步評估了PKC的表達與CRHR1表達強度的相關性，用Spearman等級相關性分析發現PKC的表達強度與CRHR1的表達強度有相關性(R=0.855，P＜0.01)，與癲癇發作頻率相關(R=0.72，P＜0.05)，與其他臨床特征未見明顯相關性。見圖 5。
圖4
PKC的表達及細胞分布
a, b. PKC在IS致癇組織中的表達較對照組明顯增高(**
a, b. The expression of PKC is higher in IS group than control group (**
圖5
嬰兒痙攣癥癲癇性痙攣與促腎上腺皮質激素釋放激素和Ⅰ型受體, PKC表達相關性分析
a, b, c.散點圖顯示CRH，CRHR1和PKC的表達與IS癲癇性痙攣之間成正相關關系，Spearman等級相關系數：CRH: R=0.671,
a, b, c. Scatter diagram showed positive correlation between the expression of CRH, CRHR1, PKC with epileptic spasm in IS patients, Spearman coefficient: CRH: R=0.671,
3 討論
本研究發現在IS患者致癇灶標本中，CRH和CRHR1在mRNA水平及蛋白水平的表達較對照組明顯升高。CRH主要在神經元表達，其受體CRHR1則分布于神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞。CRH和CRHR1的表達水平與IS癲癇性痙攣發作頻率有相關性。免疫組織化學和Western blot檢測發現PKC高表達于IS致癇灶，且與CRHR1的表達水平及癲癇發作頻率存在相關性。結果提示：CRH-CRHR1-PKC信號通路可能參與IS的發病機制。
目前的研究表明在人IS患者腦脊液，ACTH和皮質醇都低于正常對照，而在IS動物模型中ACTH可抑制新生鼠海馬CRH的表達發揮抗驚厥作用，據此推測腦組織中CRH表達過多誘導了IS發病[2, 3]。在動物實驗中發現CRH能誘導不成熟大鼠驚厥，CRH注入大鼠側腦室引起癲癇發作的劑量具有年齡依賴性，如在出生兩周的大鼠比成年鼠小200多倍[9, 10]。在大鼠海馬培養腦片實驗顯示海馬多個亞區的興奮性受到CRH的調節[9, 11]。對全身性癲癇發作患者尸檢的結果也顯示：大腦皮層CRH mRNA較對照組表達升高[12]。因此，Kristen等推測CRH可作用于大腦特異性皮質區而誘導IS癲癇發作，并提出IS的CRH發病假說[13]。但CRH發病學說尚未在IS患者致癇灶標本中獲得直接支持依據。我們研究首次發現IS患者腦致癇灶中CRH明顯升高，其受體CRHR1和下游信號PKC激活，且與癲癇發作頻率相關，提示局部腦組織CRH過多有可能參與了IS癲癇發作機制。
在CRH的受體中，由于CRHR1的高親和性和在腦內的分布特異性使其發揮主要作用。CRH與CRHR1結合后調節下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能，與應激、神經再生、神經免疫、肥胖及一些精神性疾病有關。CRH誘導的不成熟大鼠腦邊緣性癲癇發作可以被CRHR1受體阻斷劑阻斷，提示CRH誘導不成熟腦驚厥作用可能由CRHR1介導[14]。該研究對人IS致癇灶標本的結果進一步支持這一觀點，即CRHR1可能是IS中CRH發揮作用的重要受體。已經證實，在未成熟大腦，CRH可誘導CRHR1在細胞膜表達，而在較大年齡或成熟大鼠腦，這種CRH誘導CRHR1的作用減弱[15, 16]。本組對低齡(＜5歲)兒童腦組織標本的研究中發現CRH與CRHR1同時高表達現象，且與癲癇發作的頻率相關，這也提示CRH可能誘導未成熟腦CRHR1的表達，從而在特定的未成熟腦發育階段參與IS的特殊發病機制。IS具有起病于低齡嬰兒，在腦發育成熟后痙攣發作消失的年齡依賴性臨床特點，與CRH在未成熟腦特定發育階段誘發癲癇和誘導CRHR1表達的現象相吻合，支持IS的CRH發病學說。
CRHR1的激活可以啟動下游多個信號通路，如PKA、PKC等發揮其生物學效應。在小鼠海馬神經元已經證實CRH通過CRH受體偶聯Gs和Gq蛋白影響PKA和PKC信號通路[17]。進一步對海馬錐體神經元的電生理研究發現PKC與癲癇易感性有著重要的關系，涉及到癲癇的發生與維持機制，可引起興奮性突觸傳遞的增強和增加突觸后神經元的興奮性[7]。在癲癇持續狀態動物模型，PKC的激活可增強N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)受體的表達，減少神經肽Y對谷氨酸釋放的抑制，從而具有癲癇促進作用和潛在的癲癇誘導作用[18]。在培養的海馬神經元PKC的抑制可拮抗CRH誘導的NMDA電流[19]。電點燃大鼠癲癇模型海馬中PKC膜相關性活性大大增加，PKC注入海馬腦片錐體神經元，增強了興奮性突觸后電位和點燃率[20]。我們研究在IS人體標本中發現PKC增高，并與上游CRHR1的表達和IS癲癇發作相關，提示PKC細胞內信號轉導途徑可能是CRH參與IS癲癇發病的重要機制，具體的作用靶標尚需進一步研究。
CRH可能通過PKC的作用促使星形膠質細胞增殖以及細胞胞質內Ga2+濃度升高[21, 22]，引起膠質細胞鈣依賴性谷氨酸以及其他膠質遞質的釋放，從而增強局部腦組織興奮性。并且CRH可誘導小鼠前腦原代小膠質細胞凋亡來調節神經炎癥反應[23]。CRH與CRHR1結合通過ROI信號通路調節小鼠小膠質細胞分泌IL-18，也可促進腫瘤死因子-α和Fas-L的表達[24, 25]。本研究中發現，CRH主要表達于神經元，而其受體CRHR1和下游信號PKC高表達于神經元和膠質細胞，提示CRH可能由神經元分泌，作用于神經膠質細胞而誘導IS癲癇發作；同時我們發現CRHR1和PKC表達于小膠質細胞，提示CRH誘導的炎癥反應也可能參與IS的發病過程，炎癥與癲癇發病的關系已被大量研究所證實。
綜上，我們首次在人體腦標本發現CRH、CRHR1及其下游信號PKC高表達于IS致癇灶，且與癲癇痙攣發作有相關性，提示CRH信號途徑可能參與了IS的發病機制。這些結果可為解釋ACTH治療IS有效提供依據，并為進一步篩選IS的治療靶點提供線索。
