引用本文： 郭韜, 陳堯, 武江. Wistar乳鼠局灶性皮質發育不良模型的腦電圖及核磁共振實驗研究. 癲癇雜志, 2016, 2(6): 504-508. doi: 10.7507/2096-0247.20160089 復制
癲癇是神經系統疾病中僅次于腦血管病以外的第二大疾病，經手術治療的癲癇患者中約有75%的兒童癲癇和約25%的成人癲癇由局灶性皮質發育不良(Focal cortical dysplasia，FCD)引起[1]。2011年國際抗癲癇聯盟(ILAE)對FCD做出最新分類[2]，認為胚胎期、嬰兒早期任何后天獲得性損害，包括外傷、炎癥及缺血性損害等均可造成FCD。
本研究應用液氮冷凍方法建立FCD的Wistar乳鼠模型，并分析腦電圖(EEG )及頭顱核磁共振(MRI)特點，從而為進一步探討人類FCD的診斷、治療提供理論及實驗依據。
材料與方法
1 實驗動物及來源
實驗動物為Wistar孕鼠，300~350 g；由河北醫科大學動物實驗中心提供，許可證：SCXK(冀) 2008-1-003，合格證編號：909106。在清潔條件下飼養，飼喂大鼠顆粒飼料，自由采食飲水，待其生產。以新生1 d Wistar乳鼠70只，體重5.014 ~ 6.102 g為實驗對象；整個實驗過程對動物的處置均符合動物倫理學標準。
2 方法
2.1 模型建立
取產后1 d Wistar乳鼠70只隨機分為兩組，實驗組60只和對照組10只。實驗組采用液氮冷凍造模：碘伏消毒頭皮，低溫麻醉下頭部矢狀面正中切口長約1 cm，以直徑2 mm液氮探針冷凍乳鼠顱骨，冷凍部位為前囟后4 mm，中線左側旁開2 mm，依冷凍時間分為3個亞組(30、60、90 s)每組各20只，操作完成后迅速縫合，復溫后回籠飼養。對照組同實驗組步驟。切開頭皮后，室溫探針同部位、同時間接觸，但不冷凍，縫合復溫后回籠飼養。
2.2 腦電圖記錄
實驗觀察時間定為Wistar乳鼠造模后3周開始，至第8周實驗終止，實驗第8周行Wistar乳鼠硬膜外接觸電極EEG檢查，每只至少30 min。
具體方法：10%水合氯醛0.3 mL/100 g Wistar乳鼠腹腔注射麻醉，俯臥位固定。頭部碘伏消毒，于正中線切開頭皮長約1.5 cm，于前囟后6 mm左側中線旁開4 mm牙科電鉆顱骨打孔，放置硬腦膜外接觸電極，左側乳突皮下處插入參考電極，MS 4000 U生物信號定量分析系統上描記EEG活動。各參數如下設定：單位：mv，時間常數：0.1 s，高頻濾波：100 Hz，平滑濾波：5點，增益1 000倍，掃描速率：8 div/s，采樣速率：5 ms，橫向壓縮：1∶1，縱向壓縮：100%，自動基線。檢查結束后縫合頭皮，回籠飼養。
2.3 核磁共振
Wistar乳鼠造模第8周行頭顱MRI檢查，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉。采用GE公司1.5T超導核磁，以膝關節線圈掃描Wistar鼠頭部T1及T2像。掃描參數如下：O-AX T1 SE序列：TR=400 ms、TE=minimum、Frex=256×224、Nex=2、Fov=12、thickness=3、spacly=0，O-AX T2 FSE序列：TR=5152 ms、TE=85 ms、Frex=256×224、Nex=2、 Fov=12、thickness=3、spacly=0。
2.4 病理驗證
Wistar乳鼠造模滿8周，完成其他檢查后，實驗組與對照組Wistar乳鼠均行水合氯醛腹腔注射麻醉，主動脈以4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌流，斷頭取腦。石蠟包埋，切片蘇木素-伊紅染色，40倍和100倍光鏡觀察照像。
2.5 統計學方法
全部數據使用SPSS 13.0統計學軟件處理。計量資料滿足正態性及方差齊性時使用方差分析S-N-K檢驗，不滿足正態性或方差齊性時使用非參數檢驗，計數資料采用R×C表χ2檢驗。P值＜0.05為差異具有統計學意義。
結果
實驗組乳鼠造模后于哺乳期間共死亡12只，存活48只。分別為實驗亞組30 s死亡2只，60 s死亡2只，90 s死亡8只。對照組大鼠10只，無死亡。
1 病理學表現
光鏡下觀察對照組10只Wistar乳鼠腦組織切片，皮質6層結構分界清晰，細胞形態正常，無明顯異常(圖 1)。34只實驗組Wistar乳鼠腦組織切片可見皮層神經元層狀結構紊亂，各層之間界限不清、層數減少；柱狀結構紊亂，呈串珠樣排列，極向紊亂。氣球樣細胞形態多樣，胞體直徑常＞500 μm，見圖 2a~c；另14只僅表現為神經元及膠質細胞細胞間隙擴大，見圖 3。
圖1
對照組皮質神經元層狀結構正常(HE×40)
Figure1.
Control group: normal radial cortical lamination (HE ×40)
圖2
實驗組 a.皮質神經元層狀結構異常(HE ×40);b.神經元畸形(HE ×100);c.氣球樣細胞(HE ×100)
Figure2.
Experimental group a.abnormal radial cortical lamination (HE ×40);b.dysmorphic neurons (HE ×100);c.balloon cells (HE ×100)
圖3
實驗組 神經元及膠質細胞細胞間隙擴大(HE×40)
Figure3.
Experimental group: the space of neurons and glial cells expand (HE ×40)
以ILAE提出FCD的分類定義為判定依據[2]，各實驗亞組典型病理學改變符合FCD Ⅲd型表現。
2 腦電圖結果
對照組Wistar乳鼠EEG檢查未見異常放電。實驗組Wistar乳鼠發作間歇期EEG可見α波數量減少，頻率加快，波形不整，調幅調節變差，慢波出現較少或無；棘波、棘慢波頻繁發放，甚至出現陣發性或節律性的棘波活動，見圖 4、5。
30 s亞組異常放電陽性率約33.3%，60 s亞組異常放電陽性率約44.4%，90 s亞組異常放電陽性率約50%，實驗組大鼠異常放電陽性率平均為41.6%。各實驗亞組與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，但各實驗亞組組間無統計學差異。見表 1。
圖4
60 s亞組腦電圖(壓縮10倍時間軸)
Figure4.
The 60s experimental groups EEG(The time axis 10 times compression)
圖5
90 s亞組腦電圖:單棘波
Figure5.
The 90s experimental groups EEG: single spike wave
表1
各實驗亞組癇性放電比較
Table1.
Comparison of epileptic discharge in each experimental groups
3 核磁共振表現
對照組10只Wistar乳鼠MRI均未見明顯變化。實驗組14只病理改變不明顯，MRI未見明顯異常；34只具有典型FCD Ⅲd型病理表現的Wistar乳鼠中有16只可見MRI陽性表現，其中30 s亞組MRI陽性表現者2只，60 s亞組7只，MRI表現為T1加權像顯示稍可見皮質局灶性低信號，局部腦溝增寬伴灰白質交界不清，T2加權像顯示皮質點狀高信號；90 s亞組7只鼠可見T1加權像顯示腦皮層結構紊亂、塌陷，皮質局部低信號，灰白質交接模糊、皮層增厚；T2加權像顯示皮質局灶性高信號，斑片灶異常信號區向腦室方向延伸，腦實質局部液化、萎縮。見圖 6、7。
圖6
對照組和90 s實驗組MRI T2加權結果 左：對照組；中、右：90 s亞組
Figure6.
MRI findings in contral group and the 90 s experimental groups MRI T2 Left: contral group,Middle and Right: The 90s experimental groups
圖7
對照組和90 s實驗組MRI T1加權結果 左：對照組；中、右：90 s亞組
Figure7.
MRI findings in contral group and the 90s experimental groups MRI T1 Left: contral group,Middle and Right: The 90s experimental groups
MRI陰性率：實驗組中30 s亞組77.8%，60 s亞組53.3%，90 s 30%，實驗組鼠MRI平均陰性率52.9%。各實驗亞組與對照組比較有統計學差異(P＜0.05)，但各實驗亞組組間無統計學差異(表 2)。
表2
各實驗亞組MRI結果比較
Table2.
Comparison of MRI results in each experimental groups
討論
癲癇的病因學復雜，近年隨著醫學影像學技術的長足進步，尤其是高清晰度頭顱核磁共振儀的使用，臨床發現的FCD越來越多，但FCD發病原因及其致癇機制尚不明了，臨床診斷、治療困難較多。FCD已成為國內外學者的研究熱點。
根據2011年ILAE的 FCD最新分類[2]，組織病理學表現為皮質分層障礙伴隨出生早期任何后天獲得性損害，如外傷、炎癥及缺血性損害等，均可歸類為FCD Ⅲd型。我們的模型采用新生1 d乳鼠液氮冷凍腦皮層，符合出生后早期外傷條件；組織病理學可見大腦皮層的層狀、柱狀結構不良、異形細胞及氣球樣細胞表現。綜上所述，可認為該動物模型符合FCD Ⅲd型。
研究認為FCD本身就是致癇灶，其EEG表現具有特征性，與以下因素有關[3-6]：① FCD內巨大神經元為尚未成熟的神經錐體細胞，氣球樣細胞為異常膠質細胞，這些細胞存在大量異常的軸突及、突及異常的突觸連接，細胞膜阻抗降低，鈣離子內流異常增多，具有易興奮的特點，異常放電多發；本實驗EEG證實FCD區域棘波、棘慢波頻繁發放，甚至出現陣發性或節律性的棘波活動；② FCD與周圍的腦組織可形成異常的放電環路參與癇性放電擴布;人類FCD手術證實，術中切除FCD后仍可在FCD周圍組織監測到癇性放電；③ FCD內神經遞質紊亂，主要表現為興奮性和抑制性的失調，從而引起癲癇發作。本實驗EEG顯示α波數量減少，頻率加快，波形不整，調幅調節變差，慢波出現較少或無，這些表現考慮由此引起。
本組實驗顯示，范圍較小的FCD病灶MRI經常可見在某一腦溝出現局灶性皮質增厚、微小的皮質或皮質下高密度影，灰白質邊界不清；范圍較大的FCD病灶常伴有腦回增寬及腦溝形態不規則，在T2上多表現為病變相對應的白質中出現局灶性皮質增厚，并向側腦室方向逐漸變細并延伸，在T2 FLAIR成像上尤為清楚。這充分說明FCD是大腦皮層形成過程中，神經元的增殖、移行、皮層組建等正常程序受到干擾所致[7-9]。
文獻報道在人類約50%的局灶性癲癇患者，術后組織病理學診斷為FCD，但是術前頭顱MRI檢查未發現任何異常[10、11]。本研究顯示各實驗亞組乳鼠模型中病理學結果均存在FCD Ⅲd型，平均52.9%(30% ~ 77.8%)MRI無異常發現。我們認為，其原因在于FCD主要是神經元遷移障礙性疾病，FCD細胞成分與正常腦組織基本一致，尤其是FCD內含水比例無改變，氫原子核數多少也相似，導致FCD與正常腦組織的氫原子核共振信號強度差異不明顯[12, 13]。因此，MRI無法把FCD與正常腦組織分開，呈陰性表現。如何提高FCD的影像學診斷陽性率，目前已成為FCD研究的主要方向。
綜上所述，我們的研究成功建立FCD Ⅲd型乳鼠模型，其呈特異性的EEG及MRI表現，對進一步診斷與治療人類FCD具有重要參考價值。
癲癇是神經系統疾病中僅次于腦血管病以外的第二大疾病，經手術治療的癲癇患者中約有75%的兒童癲癇和約25%的成人癲癇由局灶性皮質發育不良(Focal cortical dysplasia，FCD)引起[1]。2011年國際抗癲癇聯盟(ILAE)對FCD做出最新分類[2]，認為胚胎期、嬰兒早期任何后天獲得性損害，包括外傷、炎癥及缺血性損害等均可造成FCD。
本研究應用液氮冷凍方法建立FCD的Wistar乳鼠模型，并分析腦電圖(EEG )及頭顱核磁共振(MRI)特點，從而為進一步探討人類FCD的診斷、治療提供理論及實驗依據。
材料與方法
1 實驗動物及來源
實驗動物為Wistar孕鼠，300~350 g；由河北醫科大學動物實驗中心提供，許可證：SCXK(冀) 2008-1-003，合格證編號：909106。在清潔條件下飼養，飼喂大鼠顆粒飼料，自由采食飲水，待其生產。以新生1 d Wistar乳鼠70只，體重5.014 ~ 6.102 g為實驗對象；整個實驗過程對動物的處置均符合動物倫理學標準。
2 方法
2.1 模型建立
取產后1 d Wistar乳鼠70只隨機分為兩組，實驗組60只和對照組10只。實驗組采用液氮冷凍造模：碘伏消毒頭皮，低溫麻醉下頭部矢狀面正中切口長約1 cm，以直徑2 mm液氮探針冷凍乳鼠顱骨，冷凍部位為前囟后4 mm，中線左側旁開2 mm，依冷凍時間分為3個亞組(30、60、90 s)每組各20只，操作完成后迅速縫合，復溫后回籠飼養。對照組同實驗組步驟。切開頭皮后，室溫探針同部位、同時間接觸，但不冷凍，縫合復溫后回籠飼養。
2.2 腦電圖記錄
實驗觀察時間定為Wistar乳鼠造模后3周開始，至第8周實驗終止，實驗第8周行Wistar乳鼠硬膜外接觸電極EEG檢查，每只至少30 min。
具體方法：10%水合氯醛0.3 mL/100 g Wistar乳鼠腹腔注射麻醉，俯臥位固定。頭部碘伏消毒，于正中線切開頭皮長約1.5 cm，于前囟后6 mm左側中線旁開4 mm牙科電鉆顱骨打孔，放置硬腦膜外接觸電極，左側乳突皮下處插入參考電極，MS 4000 U生物信號定量分析系統上描記EEG活動。各參數如下設定：單位：mv，時間常數：0.1 s，高頻濾波：100 Hz，平滑濾波：5點，增益1 000倍，掃描速率：8 div/s，采樣速率：5 ms，橫向壓縮：1∶1，縱向壓縮：100%，自動基線。檢查結束后縫合頭皮，回籠飼養。
2.3 核磁共振
Wistar乳鼠造模第8周行頭顱MRI檢查，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉。采用GE公司1.5T超導核磁，以膝關節線圈掃描Wistar鼠頭部T1及T2像。掃描參數如下：O-AX T1 SE序列：TR=400 ms、TE=minimum、Frex=256×224、Nex=2、Fov=12、thickness=3、spacly=0，O-AX T2 FSE序列：TR=5152 ms、TE=85 ms、Frex=256×224、Nex=2、 Fov=12、thickness=3、spacly=0。
2.4 病理驗證
Wistar乳鼠造模滿8周，完成其他檢查后，實驗組與對照組Wistar乳鼠均行水合氯醛腹腔注射麻醉，主動脈以4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌流，斷頭取腦。石蠟包埋，切片蘇木素-伊紅染色，40倍和100倍光鏡觀察照像。
2.5 統計學方法
全部數據使用SPSS 13.0統計學軟件處理。計量資料滿足正態性及方差齊性時使用方差分析S-N-K檢驗，不滿足正態性或方差齊性時使用非參數檢驗，計數資料采用R×C表χ2檢驗。P值＜0.05為差異具有統計學意義。
結果
實驗組乳鼠造模后于哺乳期間共死亡12只，存活48只。分別為實驗亞組30 s死亡2只，60 s死亡2只，90 s死亡8只。對照組大鼠10只，無死亡。
1 病理學表現
光鏡下觀察對照組10只Wistar乳鼠腦組織切片，皮質6層結構分界清晰，細胞形態正常，無明顯異常(圖 1)。34只實驗組Wistar乳鼠腦組織切片可見皮層神經元層狀結構紊亂，各層之間界限不清、層數減少；柱狀結構紊亂，呈串珠樣排列，極向紊亂。氣球樣細胞形態多樣，胞體直徑常＞500 μm，見圖 2a~c；另14只僅表現為神經元及膠質細胞細胞間隙擴大，見圖 3。
圖1
對照組皮質神經元層狀結構正常(HE×40)
Figure1.
Control group: normal radial cortical lamination (HE ×40)
圖2
實驗組 a.皮質神經元層狀結構異常(HE ×40);b.神經元畸形(HE ×100);c.氣球樣細胞(HE ×100)
Figure2.
Experimental group a.abnormal radial cortical lamination (HE ×40);b.dysmorphic neurons (HE ×100);c.balloon cells (HE ×100)
圖3
實驗組 神經元及膠質細胞細胞間隙擴大(HE×40)
Figure3.
Experimental group: the space of neurons and glial cells expand (HE ×40)
以ILAE提出FCD的分類定義為判定依據[2]，各實驗亞組典型病理學改變符合FCD Ⅲd型表現。
2 腦電圖結果
對照組Wistar乳鼠EEG檢查未見異常放電。實驗組Wistar乳鼠發作間歇期EEG可見α波數量減少，頻率加快，波形不整，調幅調節變差，慢波出現較少或無；棘波、棘慢波頻繁發放，甚至出現陣發性或節律性的棘波活動，見圖 4、5。
30 s亞組異常放電陽性率約33.3%，60 s亞組異常放電陽性率約44.4%，90 s亞組異常放電陽性率約50%，實驗組大鼠異常放電陽性率平均為41.6%。各實驗亞組與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，但各實驗亞組組間無統計學差異。見表 1。
圖4
60 s亞組腦電圖(壓縮10倍時間軸)
Figure4.
The 60s experimental groups EEG(The time axis 10 times compression)
圖5
90 s亞組腦電圖:單棘波
Figure5.
The 90s experimental groups EEG: single spike wave
表1
各實驗亞組癇性放電比較
Table1.
Comparison of epileptic discharge in each experimental groups
3 核磁共振表現
對照組10只Wistar乳鼠MRI均未見明顯變化。實驗組14只病理改變不明顯，MRI未見明顯異常；34只具有典型FCD Ⅲd型病理表現的Wistar乳鼠中有16只可見MRI陽性表現，其中30 s亞組MRI陽性表現者2只，60 s亞組7只，MRI表現為T1加權像顯示稍可見皮質局灶性低信號，局部腦溝增寬伴灰白質交界不清，T2加權像顯示皮質點狀高信號；90 s亞組7只鼠可見T1加權像顯示腦皮層結構紊亂、塌陷，皮質局部低信號，灰白質交接模糊、皮層增厚；T2加權像顯示皮質局灶性高信號，斑片灶異常信號區向腦室方向延伸，腦實質局部液化、萎縮。見圖 6、7。
圖6
對照組和90 s實驗組MRI T2加權結果 左：對照組；中、右：90 s亞組
Figure6.
MRI findings in contral group and the 90 s experimental groups MRI T2 Left: contral group,Middle and Right: The 90s experimental groups
圖7
對照組和90 s實驗組MRI T1加權結果 左：對照組；中、右：90 s亞組
Figure7.
MRI findings in contral group and the 90s experimental groups MRI T1 Left: contral group,Middle and Right: The 90s experimental groups
MRI陰性率：實驗組中30 s亞組77.8%，60 s亞組53.3%，90 s 30%，實驗組鼠MRI平均陰性率52.9%。各實驗亞組與對照組比較有統計學差異(P＜0.05)，但各實驗亞組組間無統計學差異(表 2)。
表2
各實驗亞組MRI結果比較
Table2.
Comparison of MRI results in each experimental groups
討論
癲癇的病因學復雜，近年隨著醫學影像學技術的長足進步，尤其是高清晰度頭顱核磁共振儀的使用，臨床發現的FCD越來越多，但FCD發病原因及其致癇機制尚不明了，臨床診斷、治療困難較多。FCD已成為國內外學者的研究熱點。
根據2011年ILAE的 FCD最新分類[2]，組織病理學表現為皮質分層障礙伴隨出生早期任何后天獲得性損害，如外傷、炎癥及缺血性損害等，均可歸類為FCD Ⅲd型。我們的模型采用新生1 d乳鼠液氮冷凍腦皮層，符合出生后早期外傷條件；組織病理學可見大腦皮層的層狀、柱狀結構不良、異形細胞及氣球樣細胞表現。綜上所述，可認為該動物模型符合FCD Ⅲd型。
研究認為FCD本身就是致癇灶，其EEG表現具有特征性，與以下因素有關[3-6]：① FCD內巨大神經元為尚未成熟的神經錐體細胞，氣球樣細胞為異常膠質細胞，這些細胞存在大量異常的軸突及、突及異常的突觸連接，細胞膜阻抗降低，鈣離子內流異常增多，具有易興奮的特點，異常放電多發；本實驗EEG證實FCD區域棘波、棘慢波頻繁發放，甚至出現陣發性或節律性的棘波活動；② FCD與周圍的腦組織可形成異常的放電環路參與癇性放電擴布;人類FCD手術證實，術中切除FCD后仍可在FCD周圍組織監測到癇性放電；③ FCD內神經遞質紊亂，主要表現為興奮性和抑制性的失調，從而引起癲癇發作。本實驗EEG顯示α波數量減少，頻率加快，波形不整，調幅調節變差，慢波出現較少或無，這些表現考慮由此引起。
本組實驗顯示，范圍較小的FCD病灶MRI經常可見在某一腦溝出現局灶性皮質增厚、微小的皮質或皮質下高密度影，灰白質邊界不清；范圍較大的FCD病灶常伴有腦回增寬及腦溝形態不規則，在T2上多表現為病變相對應的白質中出現局灶性皮質增厚，并向側腦室方向逐漸變細并延伸，在T2 FLAIR成像上尤為清楚。這充分說明FCD是大腦皮層形成過程中，神經元的增殖、移行、皮層組建等正常程序受到干擾所致[7-9]。
文獻報道在人類約50%的局灶性癲癇患者，術后組織病理學診斷為FCD，但是術前頭顱MRI檢查未發現任何異常[10、11]。本研究顯示各實驗亞組乳鼠模型中病理學結果均存在FCD Ⅲd型，平均52.9%(30% ~ 77.8%)MRI無異常發現。我們認為，其原因在于FCD主要是神經元遷移障礙性疾病，FCD細胞成分與正常腦組織基本一致，尤其是FCD內含水比例無改變，氫原子核數多少也相似，導致FCD與正常腦組織的氫原子核共振信號強度差異不明顯[12, 13]。因此，MRI無法把FCD與正常腦組織分開，呈陰性表現。如何提高FCD的影像學診斷陽性率，目前已成為FCD研究的主要方向。
綜上所述，我們的研究成功建立FCD Ⅲd型乳鼠模型，其呈特異性的EEG及MRI表現，對進一步診斷與治療人類FCD具有重要參考價值。
