生酮飲食（Ketogenic diet，KD）是一種高脂肪、低碳水化合物，適量蛋白質、維生素和礦物質的飲食。KD用于治療癲癇已有很長的歷史，其療效明確但作用機制尚不清楚。基于臨床觀察和研究，最初人們認為KD的作用機制與脫水、酸中毒相關。近幾年，基于越來越多的動物實驗和臨床研究，人們逐漸提出了更多假說。KD減少了葡萄糖的攝入，機體利用葡萄糖受限，而酮體、脂肪酸升高，這可能與其產生抗癲癇作用相關。此外研究發現，KD的抗癲癇機制可能與神經遞質、神經元興奮性及突觸傳遞有關。KD還有神經保護功能，如抗炎、氧化應激等，這與其抗癲癇作用也有關聯。但是上述機制并不明確，目前關于KD的抗癲癇機制仍在探索之中。
引用本文： 徐秦嵐, 朱飛, 郭安臣, 王群. 生酮飲食治療癲癇作用機制研究進展. 癲癇雜志, 2016, 2(4): 338-343. doi: 10.7507/2096-0247.20160060 復制
生酮飲食(Ketogenic diet，KD)是一個高脂肪、低碳水化合物、適量蛋白質、維生素和礦物質的飲食。早在19世紀20年代，人們就開始使用KD治療癲癇，但在30年代晚期，由于抗癲癇藥物(AEDs)苯妥英鈉的發現，KD療法迅速退出了臨床治療的舞臺。隨著時間的推移，越來越多的AEDs被發現并運用于臨床，但仍有近1/3的患者通過藥物治療后仍不能控制發作。上世紀90年代人們重新開始關注KD，并將其重新運用于臨床，尤其是兒童的耐藥性癲癇。多年來，KD的抗驚厥作用在大量急性和慢性癲癇動物模型中被證實。基于大量的臨床試驗，幾乎任何KD方案導致的酮癥以及血糖水平降低均可起到抗驚厥作用。在嚙齒類動物中，KD治療1～2周后控制發作的效果最佳。同樣在大部分患者中，KD治療的臨床療效在2周后達到最佳。但值得強調的是，如果在KD治療期間攝入碳水化合物含量較高的食物，可能會迅速導致突破發作(Breakthrough seizure)，酮癥消失。因此，為保證臨床療效，應嚴格執行KD方案。經典的KD方案中，脂肪和碳水化合物加蛋白質的比例為3：1～4：1，＞90%的熱量是由脂肪提供的。在臨床應用中，癲癇的飲食治療通常是在一段時間的禁食之后逐漸增加熱量的攝入，最后達到KD的3：1～4：1的比例。一般KD治療需要住院進行，期間需嚴密監測血糖、尿酮體和其他代謝指標。
KD治療的臨床功效已廣泛認可，但人們對它潛在的作用機制卻了解甚少。早期人們認為KD的作用機制與脫水、酸中毒相關，但目前尚無確切證據。部分學者認為KD引起的PH值變化可能直接影響離子通道和神經遞質受體以發揮作用[1]。目前，越來越多的因素被發現可能與KD的抗癲癇機制相關，包括膜電位、離子通道、脂肪酸、神經遞質和神經保護等。
1 酮體
在饑餓狀態下，肝臟代謝脂肪酸生成酮體供能。脂肪酸在肝內進行β-氧化產生大量乙酰輔酶A(Acetyle coenzyme A, CoA)進入三羧酸循環(Tricarboxylic acid cycle, TCA)，其余部分則轉變成酮體。正常情況下，丙酮生成的量很少，可經肺呼出，而乙酰乙酸(Acetoxyacetic acid, ACA)和β-羥丁酸(β-Hydroxybutyrate, β-HB)進入血液循環為肝外組織供能。酮體作為KD的主要代謝產物，在抗癲癇作用中發揮了重要的角色。酮體可能通過多種機制發揮作用，它可能影響神經元膜電位、神經遞質及其受體等。目前認為酮體可以對ATP敏感的鉀(KATP)通道發揮作用。KATP通道在胰島β細胞中調控胰島素分泌，細胞內的ATP抑制了KATP通道，當代謝抑制及ATP消耗時, KATP通道激活并產生超極化電位，攝入碳水化合物后，血糖升高，細胞內ATP升高促使該通道關閉，產生動作電位并促進胰島素分泌。KATP通道在大腦神經元中廣泛表達。在低糖培養基培養的神經元中，KATP在小鼠海馬CA3神經元超極化的過程中起了重要作用[2]。在進一步的研究中，體外培養的小鼠海馬齒狀回神經元，加入β-HB后，內向整流KATP通道開放的基礎水平升高，刺激誘發KATP通道開放的數目增加[3]。而在活體實驗中，KD喂養的大鼠，其海馬齒狀回處的長時程增強減弱，與神經元抑制相一致[4]。KATP可能是負反饋機制中的一部分，有內在的癲癇保護作用。它的調定點由糖酵解的水平決定，能被酮體代謝操控。也有人認為ACA及其代謝產物丙酮可能激活一種K+泄露通道，K2P通道，一個非排他性的、可選擇的KD靶點，它與KATP分屬不同的K+通道[5]。它能使細胞膜處于超極化狀態以調控突觸前及突觸后的膜興奮性。PH值、滲透性、溫度變化及特定脂肪酸均能調控該離子通道[6]。但是，酮體的升高與K2P通道之間的聯系仍需進一步探索[7]。
靜脈注入丙酮和ACA能阻止急性誘發的癲癇發作。在活體實驗中，早期研究發現ACA和丙酮確實具有抗癲癇作用，但并沒有證據證明其直接調控突觸傳遞或神經興奮性。在海馬CA1區體細胞的電生理實驗中也沒有發現其影響主要的離子通道來調控神經元興奮和抑制的證據。在大鼠海馬和皮質中，也未發現β-HB或ACA調控γ-氨基丁酸A(GABAA)受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid, AMPA)受體或N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受體。Bough等[8]也發現KD并不改變皮層、海馬或小腦的谷氨酸轉運蛋白EAAC1。在離體膜片鉗實驗中，在細胞外給予大鼠海馬神經元2mM β-HB或1mM ACA，突觸后膜GABAA受體活動沒有明顯的變化[9]。但在爪蟾卵母細胞中，經過10mM β-HB或50mM ACA孵化5min后，GABAA受體活動顯著增加[10]。因此，酮體是否引起神經遞質受體變化仍有待驗證。
2 脂肪酸
KD中的高脂肪部分可能發揮了抗癲癇作用，其中已有多個實驗發現多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)存在抗驚厥作用。PUFA可能通過多種機制來體現其抗驚厥作用，比如調整中樞神經系統細胞膜成分，刺激細胞核內的受體蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferatoractivated receptors, PPARs)的產生，減少炎癥作用等。
廣泛認可的是，紅細胞細胞膜的組成成分能精確反應PUFA的攝入量。在其他組織中也能觀察到這種現象，但在大腦中這種調整的機率可能低于其他器官[11]。卵磷脂(Docosahexaenoic acid，DHA)通過血漿從肝臟和脂肪組織轉移到大腦可能提高癲癇的發作閾[12]。但是，在大腦細胞膜磷脂中，DHA濃度并沒有顯著升高，這可能是由于脂質分析在發作后完成，這會導致DHA從細胞膜中釋放而引起丟失，也有可能是技術上的誤差所導致的[13]。
PPARs是一組神經核受體蛋白，其作用是作為轉錄因子調控基因的表達。它在細胞的分化、生長和代謝調節中起重要作用。PPARs調節脂質代謝的多個方面，包括脂肪酸氧化、脂肪細胞發育、脂蛋白代謝和保持葡萄糖穩態。PPARs在多種疾病的病理生理過程中表達和調節，包括動脈粥樣硬化、炎癥、肥胖、糖尿病和免疫反應，被認為是控制癲癇的潛在藥物靶點。PPARs通過結合配體改變其配體結合區的形態從而修整PPARs的功能[14]。有意思的是，PPAR-α和PPAR-γ都能被PUFA及其類二十烷酸衍生物和合成的配體如貝他類藥物激活。PPRAs的激活刺激涉及脂肪酸氧化的基因轉錄，通過異二聚體轉錄因子與維甲酸-X-受體復合物完成[15]。PPRAs有三種亞型：α，β，γ。丙氨酸(Alanine, ALA)和亞麻酸(Linolenic acid, LA)相較于二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)或DHA與PPAR-α有更好的親合力[16]。動物研究表明選擇性興奮PPAR-α或PPAR-γ可提高發作閾[17]。非諾貝特，一種PPAR-α的強誘導物，對于尾部注射戊四唑和匹魯卡因的大鼠可增加其驚厥閾值[18]。
N-3 PUFA, 特別是EPA和DHA，還具有抗炎作用，主要通過其羥基化的代謝產物，如脂質調節劑resolvins和protectin D1(PD1)。EPA和DHA與中性粒細胞結合，通過劑量依賴的方式減少了促炎性的前列腺素E2(Prostaglandins, PGE2)的生成。癲癇發作和炎癥因子有一定聯系，化學刺激或電刺激引起癲癇發作或持續狀態，炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達增加，而減少這些炎癥因子的藥物也能終止癲癇發作[19]。在大鼠中，一些抗炎藥物也發揮了一定抗驚厥作用，如環氧化酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)抑制劑和IL-1受體拮抗劑[20]。炎癥可以引起不成熟的大腦的癲癇發作易感性改變，但這種變化只有在炎癥伴隨體溫升高時出現[21]。在給予COX抑制劑(阿司匹林、萘普生、尼美舒利、羅非考昔)預處理的實驗中也顯示了上述抑制劑對戊四唑誘發的癲癇發作具有劑量依賴性的抑制作用，選擇性的COX-2抑制劑比非選擇性的更有效[22]。PD1是由DHA派生的具有共軛三烯結構的生物活性物質，而resolvins又根據其前體不同分為resolvins E(RvEs)，和resolvins D(RvDs)，二者均具有很強的抗炎和炎癥修復活性。PDs、RvEs和RvDs分別由DHA和EPA經過COX-2和不同脂氧酶(Lipoxidase，LOX)共同作用而合成的，目前對resolvins和PD1的抗炎機制進行的研究發現，RvE1通過作用ChemR23或BTL1受體發揮抗炎活性，RvD1通過脂氧素A4受體(ALX受體)發揮抗炎作用，而PD1抗炎活性可能與細胞凋亡有關。N-3 PUFA作為resolvins和PD1的內源性前體，在膳食中提高N-3 PUFA的含量，會促進resolvins和PD1的生成，減輕炎癥反應[23]。但目前這兩者的抗炎機制仍在探索之中，而其是否具抗癲癇作用亟待發掘。
3 神經遞質和神經興奮性
神經元在興奮和抑制之間維持平衡，過度興奮或過低的抑制可導致癲癇發作。谷氨酸和GABA是主要的興奮性和抑制性神經遞質，它們被認為是KD抗癲癇作用產生的可能的機制。在動物模型中，谷氨酸受體激動劑、GABA受體拮抗劑可誘發該動物癇性發作[24]。因此，有學者認為KD可能通過改變神經元的中間代謝產物來建立興奮-抑制平衡。相關研究發現，在谷氨酸能神經元中，天冬氨酸與谷氨酸平衡受β-HB及葡萄糖影響。
葡萄糖和β-HB均能代謝生成CoA，但是葡萄糖主要通過糖酵解在胞漿代謝生成丙酮酸，丙酮酸進入線粒體代謝生成CoA，而β-HB則直接進入線粒體內代謝。當β-HB代謝時，糖酵解過程中的蘋果酸-天冬氨酸穿梭(Malate-aspartate shuttle，MAS)活動減少，這一變化可影響細胞內神經興奮性的氨基酸平衡，尤其是天冬氨酸與谷氨酸之間的平衡。Thrine等[25]的實驗顯示，在培養的谷氨酸能神經元中，β-HB作為代謝基質較葡萄糖相比，其天冬氨酸水平升高，而谷氨酸水平下降。胞質中的NADH在蘋果酸脫氫酶催化下，使草酰乙酸還原成蘋果酸，后者借助內膜上的蘋果酸-α-酮戊二酸反向轉運體進入線粒體并將α-酮戊二酸從線粒體基質中導出到胞漿中。蘋果酸又在線粒體內蘋果酸脫氫酶的催化下重新生成草酰乙酸和NADH。草酰乙酸經天冬氨酸氨基轉移酶催化生成天冬氨酸，而生成天冬氨酸的氨基由谷氨酸提供，因此谷氨酸同時轉變成了α-酮戊二酸。在β-HB存在時，蘋果酸通過蘋果酸-α-酮戊二酸反向轉運體介導的穿梭活動減少，這使得更多的α-酮戊二酸進入TCA生成草酰乙酸，β-HB代謝時在ACA轉變成CoA這一步時消耗了琥珀酰輔酶A，也進一步加速了TCA，加快的TCA使得合成谷氨酸的游離α-酮戊二酸減少，進而減少了谷氨酸合成(圖 1)。有實驗顯示，當有糖轉變為無糖條件時，胞質內的NADH活動減少、MAS受限，大鼠的大腦神經元突觸小體及小腦顆粒細胞內的谷氨酸、天冬氨酸有類似的變化[26]。
圖1
細胞質中的蘋果酸脫氫酶減少及蘋果酸與α-酮戊二酸交換的載體可能減少，更多的α-酮戊二酸進入三羧酸循環，草酰乙酸生成增多，并隨之增加了天冬氨酸的生成。
注：βHB：β-羥丁酸；AcAc:乙酰乙酸；AcAc-CoA：乙酰化乙酰輔酶A；Ac-CoA：乙酰輔酶A
此外，ACA和β-HB可抑制囊泡谷氨酸轉運體(Vesicular glutamate transporters, VGLUTs)，減少谷氨酸進入突觸囊泡[27]。而谷氨酸進入突觸囊泡的過程依賴于膜電位，現在認為該過程與囊泡外的氯離子有關。氯離子為其別構激活劑，通過改變氯離子依賴性的轉運蛋白的結構從而抑制了這個過程，使囊泡外與蛋白結合的氯離子減少，游離氯離子濃度增加，最終減少谷氨酸進入囊泡。而酮體可競爭性抑制該別構激活劑，ACA的抑制作用比β-HB更強[27]。
GABA由谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸脫羧基形成，其在腦內濃度很高，作用是抑制突觸傳遞。在過去的實驗研究中發現，喂食KD的動物的前腦和小腦的中有較高水平的β-HB，其突觸小體中GABA水平也相應升高。在臨床研究中，使用KD的患者其腦脊液中的GABA水平增高，在MR波譜分析上也有相應的體現[28]。Suzuki等[29]發現在星形膠質細胞中，β-HB顯著抑制了GABA轉氨酶(GABA-transaminase，GABA-T)的活性，并抑制了mRNA的表達。GABA的降解主要由GABA-T催化, 脫氨基生成琥珀酸半醛, 再經琥珀酸半醛脫氫酶催化生成琥珀酸, 進入TCA[30]。因此較高的β-HB水平可能通過抑制其降解的過程最終使GABA水平升高。此外，GABA水平升高可刺激氯離子通道受體，增加氯離子內流，誘導細胞膜超極化，抑制了引起細胞興奮的鈉離子和鈣離子通道。
去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)是一個內源性的，強有力的抗驚厥物質。腦內的藍斑是腎上腺素能神經元的主要來源，刺激藍斑或給予腎上腺素受體激動劑可抑制癲癇樣活動；而藍斑處如有病灶，NE耗損，或給予腎上腺素受體拮抗劑，可加劇細胞過度興奮并引發癲癇發生。實驗中發現，喂養KD的大鼠與正常飲食的大鼠相比，細胞外NE水平高出2倍。在進一步實驗中，將敲除與NE合成有關的多巴胺β-HB(Dbh-/-)的小鼠及未敲除(Dbh+/-)的小鼠用KD及正常飲食分別喂養2周后，使其暴露于六氟二乙酯(flurothyl)中誘發癲癇發作，發現喂養KD的Dbh+/-小鼠的發作潛伏期延長。因此，可以推測KD可增加細胞外NE濃度。但目前該機制尚不清楚。David等[31]認為這種細胞外NE水平的調控可能與細胞膜上的NE轉運蛋白(NET)相關。但在后來的實驗中，敲除NET并喂食KD的小鼠給予最大電休克刺激時，并未觀察到預期的抗驚厥效果。
近期研究發現，KD的抗癲癇機制可能與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)有關。mTOR是一個絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是一個重要的、特征性的細胞內代謝信號的整合蛋白。這一途徑對于代謝的變化能直接作出反應，如饑餓、ATP/AMP比值下降和低血糖癥，也可調節蛋白翻譯，脂質合成，自體吞噬，線粒體生物合成等過程。mTOR蛋白位于突觸，當其與雷帕霉素的結合受抑制時，會直接損害晚期的長時程增強和長時程抑制[32]。其過度活動具有病理性，會導致一些疾病，如結節性硬化、Cowden綜合征以及某些癌癥。在基因突變致該蛋白改變的小鼠模型中，抑制與雷帕霉素結合的靶蛋白可減少小鼠的自發性癲癇發作。在其他癲癇動物模型中，雷帕霉素也能減少它們的發作，如紅藻氨酸(Kainicacid，KA)誘發大鼠自發性癲癇發作，普魯卡品誘發的大鼠癲癇持續狀態，低氧誘導的大鼠驚厥等，而這些模型中，mTOR蛋白較為活躍。另外，一個臨床實驗表明，依維莫司(everolimus)，一種雷帕霉素類似物，可以抑制結節性硬化患者的癲癇發作。因此，這為mTOR蛋白抑制劑用于臨床治療癲癇創造了一定的可能性[33]。mTOR蛋白作用機制可能與其改變神經元的興奮性有關，可能通過改變樹突棘的結構來改變突觸功能，或改變神經遞質釋放, 離子通道表達, 或突觸蛋白的表達等途徑來發揮其作用[34-36]。目前發現，KD可抑制mTOR蛋白的激活，這可能是KD的抗癲癇機制之一[37]。但是，雷帕霉素和KD在急性動物模型中并沒有表現出一致的效果。雷帕霉素對于6Hz電休克模型無效，而KD對其卻有較好的療效[38, 39]。因此，KD是否通過抑制mTOR蛋白來發揮其作用仍有待探究。
4 神經保護
癲癇的發生率隨年齡增加而升高，而氧化應激是衰老及退行性病變的主要機制，提示氧化應激與癲癇發生相關。在KA所致的小鼠癲癇持續狀態模型中，在注射KA 16 h后，TCA中的順烏頭酸酶明顯滅活[40]。順烏頭酸酶是一個氧化還原敏感的酶，可作為細胞內O2-產生的標記物。此外，海馬CA3區DNA氧化損傷及廣泛的神經元死亡也在該模型中被觀察到。而大量表達錳超氧化物岐化酶(MnSOD)的小鼠中，其神經元存活率提高。這提示O2-產生可能是癲癇持續狀態中導致大量神經元死亡的原因[40]。也有研究也證明KA引起的癲癇持續狀態中，線粒體氧化還原量發生了改變。在該研究中，大鼠海馬的還原性谷胱甘肽水平下降而氧化性谷胱甘肽水平升高。此外，KA模型中的脂質過氧化反應產物增多，其主要產物異前列腺素的產生與線粒體氧化應激有關[41]。
KD可減少氧化損傷，起到抗癲癇作用。線粒體是ROS/RNS的主要來源，其呼吸鏈中的復合體Ⅰ/Ⅲ對于氧化調節較為敏感。有研究發現，創傷性腦損傷(TBI)可導致線粒體功能障礙，使復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活動受到抑制。而KD可改善復合體Ⅱ/Ⅲ的抑制，并顯著改善了細胞質、線粒體中的氧化應激。Haces等[42]發現離體實驗中，β-HB和ACA能直接清除OH-，ACA能直接清除次氯酸(HOCL)，ONOO-及單態氧。將β-HB、ACA分別加入含谷氨酸的神經元以及含鈣離子的線粒體中，兩者均抑制了O2-的聚積。在急性大鼠腦皮質切片中，這兩種酮體也能減少H2O2引起的細胞死亡[43]。Greco等[44]發現超生理量濃度的酮體可直接清除自由基。在更進一步的研究中，給予低糖動物模型500 mg/kg的β-HB，檢測到血漿β-HB濃度為0.371 mM，可顯著減少腦內的氧化應激。除了直接清除自由基，KD也誘發了抗氧化蛋白的表達[42]。超氧歧化酶(SOD1/2)和萘醌(NQO1)均能清除O2-，并受Nrf2信號調控，而Nrf2已被發現能被酮體及KD激活。此外，喂養KD 4周以上的大鼠其海馬中的線粒體明顯高于對照組，因此，KD可能刺激了線粒體的生物合成[45]。在喂養KD 10～12 d后，小鼠海馬內解偶聯蛋白水平也被觀察到升高，而這些小鼠的線粒體產生的ROS減少[46]。由此可推測KD可上調線粒體解偶聯蛋白(Uncoupling proteins，UCPs)[47]。脂肪酸也可引起UCP表達增加，其機制可能是通過PPAR和FOX家族等轉錄因子的活化所致[48]。
最近研究發現，ACA和β-HB可通過線粒體滲透性轉變(mitochondrial permeability transition，mPT)激活劑介導的氧化應激來阻止神經元死亡。ACA和β-HB有著與mPT阻滯劑環孢素A類似的作用——能提高鈣離子誘導的mPT開放的閾值[43]。持續的癲癇樣的活動可導致膠質細胞中的Mg2+降低，導致細胞膜去極化和mPT開放，致使細胞死亡，而環孢素A能抑制該過程，增加細胞的成活率[49]。有學者Kcna1基因突變的小鼠作為癲癇模型，觀察KD和酮體(Ketone bodies, KB)對線粒體通透性轉換孔和海馬長時程增加的作用，數據表明KB具有抗癲癇發作及促智作用，其抗癲癇作用直接與mPT有關[50]。
5 結語
盡管KD應用于臨床已有近百年的歷史，但其抗癲癇機制仍不清楚。由于KD限制了葡萄糖的攝入，導致大腦中酮體和游離脂肪酸的含量增高。這種特殊的代謝狀態如果長時間維持，可以轉換能量產生的來源。酮體、脂肪酸成為主要的能量代謝來源，它們可能通過多種機制來發揮抗癲癇作用。神經遞質、細胞膜電位變化、離子通道等多種因素最終導致細胞興奮性的改變。線粒體通過氧化還原、滲透性轉變等起到了神經保護作用。而最近發現的mTOR蛋白可作為藥物靶點，為新藥的研發提供了新方向。
生酮飲食(Ketogenic diet，KD)是一個高脂肪、低碳水化合物、適量蛋白質、維生素和礦物質的飲食。早在19世紀20年代，人們就開始使用KD治療癲癇，但在30年代晚期，由于抗癲癇藥物(AEDs)苯妥英鈉的發現，KD療法迅速退出了臨床治療的舞臺。隨著時間的推移，越來越多的AEDs被發現并運用于臨床，但仍有近1/3的患者通過藥物治療后仍不能控制發作。上世紀90年代人們重新開始關注KD，并將其重新運用于臨床，尤其是兒童的耐藥性癲癇。多年來，KD的抗驚厥作用在大量急性和慢性癲癇動物模型中被證實。基于大量的臨床試驗，幾乎任何KD方案導致的酮癥以及血糖水平降低均可起到抗驚厥作用。在嚙齒類動物中，KD治療1～2周后控制發作的效果最佳。同樣在大部分患者中，KD治療的臨床療效在2周后達到最佳。但值得強調的是，如果在KD治療期間攝入碳水化合物含量較高的食物，可能會迅速導致突破發作(Breakthrough seizure)，酮癥消失。因此，為保證臨床療效，應嚴格執行KD方案。經典的KD方案中，脂肪和碳水化合物加蛋白質的比例為3：1～4：1，＞90%的熱量是由脂肪提供的。在臨床應用中，癲癇的飲食治療通常是在一段時間的禁食之后逐漸增加熱量的攝入，最后達到KD的3：1～4：1的比例。一般KD治療需要住院進行，期間需嚴密監測血糖、尿酮體和其他代謝指標。
KD治療的臨床功效已廣泛認可，但人們對它潛在的作用機制卻了解甚少。早期人們認為KD的作用機制與脫水、酸中毒相關，但目前尚無確切證據。部分學者認為KD引起的PH值變化可能直接影響離子通道和神經遞質受體以發揮作用[1]。目前，越來越多的因素被發現可能與KD的抗癲癇機制相關，包括膜電位、離子通道、脂肪酸、神經遞質和神經保護等。
1 酮體
在饑餓狀態下，肝臟代謝脂肪酸生成酮體供能。脂肪酸在肝內進行β-氧化產生大量乙酰輔酶A(Acetyle coenzyme A, CoA)進入三羧酸循環(Tricarboxylic acid cycle, TCA)，其余部分則轉變成酮體。正常情況下，丙酮生成的量很少，可經肺呼出，而乙酰乙酸(Acetoxyacetic acid, ACA)和β-羥丁酸(β-Hydroxybutyrate, β-HB)進入血液循環為肝外組織供能。酮體作為KD的主要代謝產物，在抗癲癇作用中發揮了重要的角色。酮體可能通過多種機制發揮作用，它可能影響神經元膜電位、神經遞質及其受體等。目前認為酮體可以對ATP敏感的鉀(KATP)通道發揮作用。KATP通道在胰島β細胞中調控胰島素分泌，細胞內的ATP抑制了KATP通道，當代謝抑制及ATP消耗時, KATP通道激活并產生超極化電位，攝入碳水化合物后，血糖升高，細胞內ATP升高促使該通道關閉，產生動作電位并促進胰島素分泌。KATP通道在大腦神經元中廣泛表達。在低糖培養基培養的神經元中，KATP在小鼠海馬CA3神經元超極化的過程中起了重要作用[2]。在進一步的研究中，體外培養的小鼠海馬齒狀回神經元，加入β-HB后，內向整流KATP通道開放的基礎水平升高，刺激誘發KATP通道開放的數目增加[3]。而在活體實驗中，KD喂養的大鼠，其海馬齒狀回處的長時程增強減弱，與神經元抑制相一致[4]。KATP可能是負反饋機制中的一部分，有內在的癲癇保護作用。它的調定點由糖酵解的水平決定，能被酮體代謝操控。也有人認為ACA及其代謝產物丙酮可能激活一種K+泄露通道，K2P通道，一個非排他性的、可選擇的KD靶點，它與KATP分屬不同的K+通道[5]。它能使細胞膜處于超極化狀態以調控突觸前及突觸后的膜興奮性。PH值、滲透性、溫度變化及特定脂肪酸均能調控該離子通道[6]。但是，酮體的升高與K2P通道之間的聯系仍需進一步探索[7]。
靜脈注入丙酮和ACA能阻止急性誘發的癲癇發作。在活體實驗中，早期研究發現ACA和丙酮確實具有抗癲癇作用，但并沒有證據證明其直接調控突觸傳遞或神經興奮性。在海馬CA1區體細胞的電生理實驗中也沒有發現其影響主要的離子通道來調控神經元興奮和抑制的證據。在大鼠海馬和皮質中，也未發現β-HB或ACA調控γ-氨基丁酸A(GABAA)受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid, AMPA)受體或N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受體。Bough等[8]也發現KD并不改變皮層、海馬或小腦的谷氨酸轉運蛋白EAAC1。在離體膜片鉗實驗中，在細胞外給予大鼠海馬神經元2mM β-HB或1mM ACA，突觸后膜GABAA受體活動沒有明顯的變化[9]。但在爪蟾卵母細胞中，經過10mM β-HB或50mM ACA孵化5min后，GABAA受體活動顯著增加[10]。因此，酮體是否引起神經遞質受體變化仍有待驗證。
2 脂肪酸
KD中的高脂肪部分可能發揮了抗癲癇作用，其中已有多個實驗發現多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)存在抗驚厥作用。PUFA可能通過多種機制來體現其抗驚厥作用，比如調整中樞神經系統細胞膜成分，刺激細胞核內的受體蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferatoractivated receptors, PPARs)的產生，減少炎癥作用等。
廣泛認可的是，紅細胞細胞膜的組成成分能精確反應PUFA的攝入量。在其他組織中也能觀察到這種現象，但在大腦中這種調整的機率可能低于其他器官[11]。卵磷脂(Docosahexaenoic acid，DHA)通過血漿從肝臟和脂肪組織轉移到大腦可能提高癲癇的發作閾[12]。但是，在大腦細胞膜磷脂中，DHA濃度并沒有顯著升高，這可能是由于脂質分析在發作后完成，這會導致DHA從細胞膜中釋放而引起丟失，也有可能是技術上的誤差所導致的[13]。
PPARs是一組神經核受體蛋白，其作用是作為轉錄因子調控基因的表達。它在細胞的分化、生長和代謝調節中起重要作用。PPARs調節脂質代謝的多個方面，包括脂肪酸氧化、脂肪細胞發育、脂蛋白代謝和保持葡萄糖穩態。PPARs在多種疾病的病理生理過程中表達和調節，包括動脈粥樣硬化、炎癥、肥胖、糖尿病和免疫反應，被認為是控制癲癇的潛在藥物靶點。PPARs通過結合配體改變其配體結合區的形態從而修整PPARs的功能[14]。有意思的是，PPAR-α和PPAR-γ都能被PUFA及其類二十烷酸衍生物和合成的配體如貝他類藥物激活。PPRAs的激活刺激涉及脂肪酸氧化的基因轉錄，通過異二聚體轉錄因子與維甲酸-X-受體復合物完成[15]。PPRAs有三種亞型：α，β，γ。丙氨酸(Alanine, ALA)和亞麻酸(Linolenic acid, LA)相較于二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)或DHA與PPAR-α有更好的親合力[16]。動物研究表明選擇性興奮PPAR-α或PPAR-γ可提高發作閾[17]。非諾貝特，一種PPAR-α的強誘導物，對于尾部注射戊四唑和匹魯卡因的大鼠可增加其驚厥閾值[18]。
N-3 PUFA, 特別是EPA和DHA，還具有抗炎作用，主要通過其羥基化的代謝產物，如脂質調節劑resolvins和protectin D1(PD1)。EPA和DHA與中性粒細胞結合，通過劑量依賴的方式減少了促炎性的前列腺素E2(Prostaglandins, PGE2)的生成。癲癇發作和炎癥因子有一定聯系，化學刺激或電刺激引起癲癇發作或持續狀態，炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達增加，而減少這些炎癥因子的藥物也能終止癲癇發作[19]。在大鼠中，一些抗炎藥物也發揮了一定抗驚厥作用，如環氧化酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)抑制劑和IL-1受體拮抗劑[20]。炎癥可以引起不成熟的大腦的癲癇發作易感性改變，但這種變化只有在炎癥伴隨體溫升高時出現[21]。在給予COX抑制劑(阿司匹林、萘普生、尼美舒利、羅非考昔)預處理的實驗中也顯示了上述抑制劑對戊四唑誘發的癲癇發作具有劑量依賴性的抑制作用，選擇性的COX-2抑制劑比非選擇性的更有效[22]。PD1是由DHA派生的具有共軛三烯結構的生物活性物質，而resolvins又根據其前體不同分為resolvins E(RvEs)，和resolvins D(RvDs)，二者均具有很強的抗炎和炎癥修復活性。PDs、RvEs和RvDs分別由DHA和EPA經過COX-2和不同脂氧酶(Lipoxidase，LOX)共同作用而合成的，目前對resolvins和PD1的抗炎機制進行的研究發現，RvE1通過作用ChemR23或BTL1受體發揮抗炎活性，RvD1通過脂氧素A4受體(ALX受體)發揮抗炎作用，而PD1抗炎活性可能與細胞凋亡有關。N-3 PUFA作為resolvins和PD1的內源性前體，在膳食中提高N-3 PUFA的含量，會促進resolvins和PD1的生成，減輕炎癥反應[23]。但目前這兩者的抗炎機制仍在探索之中，而其是否具抗癲癇作用亟待發掘。
3 神經遞質和神經興奮性
神經元在興奮和抑制之間維持平衡，過度興奮或過低的抑制可導致癲癇發作。谷氨酸和GABA是主要的興奮性和抑制性神經遞質，它們被認為是KD抗癲癇作用產生的可能的機制。在動物模型中，谷氨酸受體激動劑、GABA受體拮抗劑可誘發該動物癇性發作[24]。因此，有學者認為KD可能通過改變神經元的中間代謝產物來建立興奮-抑制平衡。相關研究發現，在谷氨酸能神經元中，天冬氨酸與谷氨酸平衡受β-HB及葡萄糖影響。
葡萄糖和β-HB均能代謝生成CoA，但是葡萄糖主要通過糖酵解在胞漿代謝生成丙酮酸，丙酮酸進入線粒體代謝生成CoA，而β-HB則直接進入線粒體內代謝。當β-HB代謝時，糖酵解過程中的蘋果酸-天冬氨酸穿梭(Malate-aspartate shuttle，MAS)活動減少，這一變化可影響細胞內神經興奮性的氨基酸平衡，尤其是天冬氨酸與谷氨酸之間的平衡。Thrine等[25]的實驗顯示，在培養的谷氨酸能神經元中，β-HB作為代謝基質較葡萄糖相比，其天冬氨酸水平升高，而谷氨酸水平下降。胞質中的NADH在蘋果酸脫氫酶催化下，使草酰乙酸還原成蘋果酸，后者借助內膜上的蘋果酸-α-酮戊二酸反向轉運體進入線粒體并將α-酮戊二酸從線粒體基質中導出到胞漿中。蘋果酸又在線粒體內蘋果酸脫氫酶的催化下重新生成草酰乙酸和NADH。草酰乙酸經天冬氨酸氨基轉移酶催化生成天冬氨酸，而生成天冬氨酸的氨基由谷氨酸提供，因此谷氨酸同時轉變成了α-酮戊二酸。在β-HB存在時，蘋果酸通過蘋果酸-α-酮戊二酸反向轉運體介導的穿梭活動減少，這使得更多的α-酮戊二酸進入TCA生成草酰乙酸，β-HB代謝時在ACA轉變成CoA這一步時消耗了琥珀酰輔酶A，也進一步加速了TCA，加快的TCA使得合成谷氨酸的游離α-酮戊二酸減少，進而減少了谷氨酸合成(圖 1)。有實驗顯示，當有糖轉變為無糖條件時，胞質內的NADH活動減少、MAS受限，大鼠的大腦神經元突觸小體及小腦顆粒細胞內的谷氨酸、天冬氨酸有類似的變化[26]。
圖1
細胞質中的蘋果酸脫氫酶減少及蘋果酸與α-酮戊二酸交換的載體可能減少，更多的α-酮戊二酸進入三羧酸循環，草酰乙酸生成增多，并隨之增加了天冬氨酸的生成。
注：βHB：β-羥丁酸；AcAc:乙酰乙酸；AcAc-CoA：乙酰化乙酰輔酶A；Ac-CoA：乙酰輔酶A
此外，ACA和β-HB可抑制囊泡谷氨酸轉運體(Vesicular glutamate transporters, VGLUTs)，減少谷氨酸進入突觸囊泡[27]。而谷氨酸進入突觸囊泡的過程依賴于膜電位，現在認為該過程與囊泡外的氯離子有關。氯離子為其別構激活劑，通過改變氯離子依賴性的轉運蛋白的結構從而抑制了這個過程，使囊泡外與蛋白結合的氯離子減少，游離氯離子濃度增加，最終減少谷氨酸進入囊泡。而酮體可競爭性抑制該別構激活劑，ACA的抑制作用比β-HB更強[27]。
GABA由谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸脫羧基形成，其在腦內濃度很高，作用是抑制突觸傳遞。在過去的實驗研究中發現，喂食KD的動物的前腦和小腦的中有較高水平的β-HB，其突觸小體中GABA水平也相應升高。在臨床研究中，使用KD的患者其腦脊液中的GABA水平增高，在MR波譜分析上也有相應的體現[28]。Suzuki等[29]發現在星形膠質細胞中，β-HB顯著抑制了GABA轉氨酶(GABA-transaminase，GABA-T)的活性，并抑制了mRNA的表達。GABA的降解主要由GABA-T催化, 脫氨基生成琥珀酸半醛, 再經琥珀酸半醛脫氫酶催化生成琥珀酸, 進入TCA[30]。因此較高的β-HB水平可能通過抑制其降解的過程最終使GABA水平升高。此外，GABA水平升高可刺激氯離子通道受體，增加氯離子內流，誘導細胞膜超極化，抑制了引起細胞興奮的鈉離子和鈣離子通道。
去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)是一個內源性的，強有力的抗驚厥物質。腦內的藍斑是腎上腺素能神經元的主要來源，刺激藍斑或給予腎上腺素受體激動劑可抑制癲癇樣活動；而藍斑處如有病灶，NE耗損，或給予腎上腺素受體拮抗劑，可加劇細胞過度興奮并引發癲癇發生。實驗中發現，喂養KD的大鼠與正常飲食的大鼠相比，細胞外NE水平高出2倍。在進一步實驗中，將敲除與NE合成有關的多巴胺β-HB(Dbh-/-)的小鼠及未敲除(Dbh+/-)的小鼠用KD及正常飲食分別喂養2周后，使其暴露于六氟二乙酯(flurothyl)中誘發癲癇發作，發現喂養KD的Dbh+/-小鼠的發作潛伏期延長。因此，可以推測KD可增加細胞外NE濃度。但目前該機制尚不清楚。David等[31]認為這種細胞外NE水平的調控可能與細胞膜上的NE轉運蛋白(NET)相關。但在后來的實驗中，敲除NET并喂食KD的小鼠給予最大電休克刺激時，并未觀察到預期的抗驚厥效果。
近期研究發現，KD的抗癲癇機制可能與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)有關。mTOR是一個絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是一個重要的、特征性的細胞內代謝信號的整合蛋白。這一途徑對于代謝的變化能直接作出反應，如饑餓、ATP/AMP比值下降和低血糖癥，也可調節蛋白翻譯，脂質合成，自體吞噬，線粒體生物合成等過程。mTOR蛋白位于突觸，當其與雷帕霉素的結合受抑制時，會直接損害晚期的長時程增強和長時程抑制[32]。其過度活動具有病理性，會導致一些疾病，如結節性硬化、Cowden綜合征以及某些癌癥。在基因突變致該蛋白改變的小鼠模型中，抑制與雷帕霉素結合的靶蛋白可減少小鼠的自發性癲癇發作。在其他癲癇動物模型中，雷帕霉素也能減少它們的發作，如紅藻氨酸(Kainicacid，KA)誘發大鼠自發性癲癇發作，普魯卡品誘發的大鼠癲癇持續狀態，低氧誘導的大鼠驚厥等，而這些模型中，mTOR蛋白較為活躍。另外，一個臨床實驗表明，依維莫司(everolimus)，一種雷帕霉素類似物，可以抑制結節性硬化患者的癲癇發作。因此，這為mTOR蛋白抑制劑用于臨床治療癲癇創造了一定的可能性[33]。mTOR蛋白作用機制可能與其改變神經元的興奮性有關，可能通過改變樹突棘的結構來改變突觸功能，或改變神經遞質釋放, 離子通道表達, 或突觸蛋白的表達等途徑來發揮其作用[34-36]。目前發現，KD可抑制mTOR蛋白的激活，這可能是KD的抗癲癇機制之一[37]。但是，雷帕霉素和KD在急性動物模型中并沒有表現出一致的效果。雷帕霉素對于6Hz電休克模型無效，而KD對其卻有較好的療效[38, 39]。因此，KD是否通過抑制mTOR蛋白來發揮其作用仍有待探究。
4 神經保護
癲癇的發生率隨年齡增加而升高，而氧化應激是衰老及退行性病變的主要機制，提示氧化應激與癲癇發生相關。在KA所致的小鼠癲癇持續狀態模型中，在注射KA 16 h后，TCA中的順烏頭酸酶明顯滅活[40]。順烏頭酸酶是一個氧化還原敏感的酶，可作為細胞內O2-產生的標記物。此外，海馬CA3區DNA氧化損傷及廣泛的神經元死亡也在該模型中被觀察到。而大量表達錳超氧化物岐化酶(MnSOD)的小鼠中，其神經元存活率提高。這提示O2-產生可能是癲癇持續狀態中導致大量神經元死亡的原因[40]。也有研究也證明KA引起的癲癇持續狀態中，線粒體氧化還原量發生了改變。在該研究中，大鼠海馬的還原性谷胱甘肽水平下降而氧化性谷胱甘肽水平升高。此外，KA模型中的脂質過氧化反應產物增多，其主要產物異前列腺素的產生與線粒體氧化應激有關[41]。
KD可減少氧化損傷，起到抗癲癇作用。線粒體是ROS/RNS的主要來源，其呼吸鏈中的復合體Ⅰ/Ⅲ對于氧化調節較為敏感。有研究發現，創傷性腦損傷(TBI)可導致線粒體功能障礙，使復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活動受到抑制。而KD可改善復合體Ⅱ/Ⅲ的抑制，并顯著改善了細胞質、線粒體中的氧化應激。Haces等[42]發現離體實驗中，β-HB和ACA能直接清除OH-，ACA能直接清除次氯酸(HOCL)，ONOO-及單態氧。將β-HB、ACA分別加入含谷氨酸的神經元以及含鈣離子的線粒體中，兩者均抑制了O2-的聚積。在急性大鼠腦皮質切片中，這兩種酮體也能減少H2O2引起的細胞死亡[43]。Greco等[44]發現超生理量濃度的酮體可直接清除自由基。在更進一步的研究中，給予低糖動物模型500 mg/kg的β-HB，檢測到血漿β-HB濃度為0.371 mM，可顯著減少腦內的氧化應激。除了直接清除自由基，KD也誘發了抗氧化蛋白的表達[42]。超氧歧化酶(SOD1/2)和萘醌(NQO1)均能清除O2-，并受Nrf2信號調控，而Nrf2已被發現能被酮體及KD激活。此外，喂養KD 4周以上的大鼠其海馬中的線粒體明顯高于對照組，因此，KD可能刺激了線粒體的生物合成[45]。在喂養KD 10～12 d后，小鼠海馬內解偶聯蛋白水平也被觀察到升高，而這些小鼠的線粒體產生的ROS減少[46]。由此可推測KD可上調線粒體解偶聯蛋白(Uncoupling proteins，UCPs)[47]。脂肪酸也可引起UCP表達增加，其機制可能是通過PPAR和FOX家族等轉錄因子的活化所致[48]。
最近研究發現，ACA和β-HB可通過線粒體滲透性轉變(mitochondrial permeability transition，mPT)激活劑介導的氧化應激來阻止神經元死亡。ACA和β-HB有著與mPT阻滯劑環孢素A類似的作用——能提高鈣離子誘導的mPT開放的閾值[43]。持續的癲癇樣的活動可導致膠質細胞中的Mg2+降低，導致細胞膜去極化和mPT開放，致使細胞死亡，而環孢素A能抑制該過程，增加細胞的成活率[49]。有學者Kcna1基因突變的小鼠作為癲癇模型，觀察KD和酮體(Ketone bodies, KB)對線粒體通透性轉換孔和海馬長時程增加的作用，數據表明KB具有抗癲癇發作及促智作用，其抗癲癇作用直接與mPT有關[50]。
5 結語
盡管KD應用于臨床已有近百年的歷史，但其抗癲癇機制仍不清楚。由于KD限制了葡萄糖的攝入，導致大腦中酮體和游離脂肪酸的含量增高。這種特殊的代謝狀態如果長時間維持，可以轉換能量產生的來源。酮體、脂肪酸成為主要的能量代謝來源，它們可能通過多種機制來發揮抗癲癇作用。神經遞質、細胞膜電位變化、離子通道等多種因素最終導致細胞興奮性的改變。線粒體通過氧化還原、滲透性轉變等起到了神經保護作用。而最近發現的mTOR蛋白可作為藥物靶點，為新藥的研發提供了新方向。
