引用本文： 解媛媛, 舒怡, 龍泓羽, 肖波. 顳葉癲癇小鼠海馬CA3區微血管變化的探討. 癲癇雜志, 2016, 2(4): 329-332. doi: 10.7507/2096-0247.20160058 復制
癲癇是一種大腦神經元異常高度同步化放電活動所引發的發作性疾病，臨床以顳葉癲癇(Temporal lobe epilepsy，TLE)最為常見。癲癇持續狀態(Status epilepticus，SE)和癇性發作在損害神經元的同時，可刺激神經元新生和膠質增生等組織重塑[1]，此時機體需要大量氧氣和營養物質到受損區域，隨即可出現腦血流量增加，血腦屏障通透性改變以及微血管密度增加和微血管重構。目前已經證實在癲癇發生后人和動物腦內可出現血管形態以及與調節血管再生相關基因的明顯變化[2-4]。體外實驗進一步發現在此過程中海馬神經元可迅速釋放血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，誘導VEGF受體-2表達升高，而給予抗VEGF抗體后血管重構過程被抑制[5]。以上結果提示血管的重塑過程存在于癲癇大腦內。免疫組織化學染色是目前較為常用的顯示海馬微血管構筑的方法之一。利用不同類型標記物分別標記內皮細胞或基底膜，均可以清楚地顯示海馬微血管形態和走行。本實驗將首次采用血小板內皮細胞黏附分子-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)標記內皮細胞，研究TLE后小鼠海馬微血管的分布和形態變化。
材料與方法
1 動物與分組
選5～6周齡健康雄性SPF C57BL/6小鼠18只，體重18～21g；由中南大學動物部提供。該動物實驗通過中南大學湘雅醫院倫理委員會的審批。將小鼠隨機分為正常對照組(n=9)與實驗組(n=9)。兩組動物分別在模型成功建立后7、28和56 d行多聚甲醛灌注取腦，行PECAM-1免疫組織化學染色(每個時間點每組各3只)。
2 顳葉癲癇模型建立
向小鼠腹腔注射氫溴酸東莨菪堿(1 mg/kg)，30 min后腹腔注射匹羅卡品320～340 mg/kg (美國Sigma公司)，待小鼠進入SE 2 h后腹腔注射地西泮7.5 mg/kg終止發作。發作程度按Racine標準分級，2 h內3～5級發作發生3次以上的小鼠進入SE，并歸于致癇成功組。正常對照組除注射與匹羅卡品等劑量的生理鹽水外，余處理均同模型組。在其后的實驗時間內觀察小鼠的行為學。
3 冰凍切片標本制備
腹腔注射10%水合氯醛(5 mL/kg)，麻醉各時間點小鼠。沿小鼠胸骨旁線剪開胸腹腔，暴露心臟和肝臟，取灌注針自心尖向右上45°進針至主動脈起始端，固定針頭，剪開右心耳，快速灌注4℃生理鹽水50 mL至肝臟變白，自右心耳流出的液體清亮后接著灌注4℃ 4%多聚甲醛，先快后慢，約50 mL至小鼠四肢強直僵硬后停止灌注。沿枕骨剪下頭部，仔細剪開頭皮及顱骨，充分暴露并完整剝離腦組織，置于4℃ 4%多聚甲醛后固定12～16 h，0.1 mol/L PBS充分泡洗后移入4℃ 30%蔗糖溶液沉底。冰凍切片機溫度調至-18～-20℃，將蔗糖溶液中的腦組織取出，修塊、包埋后，行腦組織冠狀位連續切片(德國Leica公司)，切片厚30 μm。切片按順序放入低溫防護液0.1 mol/L PBS中含25%甘油和30%乙二醇)中，-20℃保存備用。
4 免疫組織化學檢測
切片從低溫防護液中取出后，0.1 mol/L PBS(PH7.5)漂洗30 min；1% H2O2室溫孵育30 min以滅活內源性過氧化物酶；檸檬酸微波修復抗原20 min；含10%正常兔血清、抗生物素蛋白溶液(200 μL/mL，美國Vector Lab公司)和0.3% Triton混合液中室溫孵育2 h；含生物素(200 μL /mL，美國Vector Lab公司)和一抗大鼠源PECAM-1多克隆抗體(1：25，美國BD公司)的0.1 mol/L PBS(PH7.5)溶液中室溫孵育48 h；生物素化山羊抗大鼠二抗(1：200，美國KPL公司)的0.1 mol/L PBS(PH7.5)溶液中室溫孵育1 h；VECTASTAIN? ABC kit(美國Vector Lab公司)，室溫下孵育1 h；DAB室溫顯色10～15 min；每步驟間用0.1 M(mol/L) PBS漂洗3次，每次15 min；將切片輕柔鋪片于載玻片上，自然風干30 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明和封片。陰性對照采用PBS代替一抗，余同上述操作。所有步驟均在搖床上進行。
5 圖像分析和統計學方法
萊卡DM 5000 B顯微鏡拍攝免疫組化圖片。采用盲法使用Imaging-Pro Plus 6.0軟件(IPP 6.0，Media Cybernetics，USA)對圖片進行分析，計算小鼠海馬CA3區微血管密度。微血管平均密度(Numbers/Area)=微血管數目/已知總面積(根據IPP 6.0計算)。所有縱向的微血管均納入計算。血管的分支被認為是獨立的血管。在腦片上顯示橫截面的血管不納入計算。每組每只小鼠分析3張距前囟不同距離的腦片。
采用Graph Pad Prism 5.01軟件分析實驗數據。實驗數據用均數±標準差表示，對照組與實驗組組間比較采用兩因素χ2分析，組間比較采用Bonferroni post test檢驗，P值＜0.05為差異有統計學意義。
結果
在實驗期間，所有小鼠毛發光潔，自由攝食飲水，無死亡。
1 正常對照組小鼠海馬CA3區微血管形態
采用PECAM-1標記對照組小鼠海馬微血管的內皮細胞，可清楚顯示微血管呈淺褐色-深褐色，血管分支少；組織中細胞核被蘇木素復染為藍色，海馬微血管呈層狀分布，與神經細胞構筑表現一致；海馬CA3區微血管以始層分布最為密集，輻射層次之，錐體細胞層最為稀疏。各時間點小鼠海馬CA3區微血管的形態和分布基本一致(圖 1)。
圖1
對照組小鼠海馬CA3區PECAM-1免疫組化染色(×100) a~c.分別為7、28和56d，淺褐色-深褐色為PECAM-1標記的微血管，藍色為蘇木素復染的細胞核
Figure1.
Immunohistochemistry staining of PECAM-1 in hippocampal CA3 region in normal control mice (×100) a~c. represents 7 d, 28dand 56drespectively (light brown-dark brown showed PECAM-1 labeled capillaries, blue showed hematoxylin labeled nucleus)
2 實驗組小鼠海馬CA3區微血管形態
匹羅卡品致癇后7d海馬CA3區微血管排列方向紊亂，平行神經元頂樹突排列的血管減少，片段狀血管開始出現；28 d微血管排列明顯紊亂，血管呈片段狀散亂分布在海馬CA3區；56 d微血管數目較前下降，血管排列分散，仍可見片段狀微血管(圖 2)。
圖2
實驗組小鼠海馬CA3區PECAM-1免疫組化染色(×100) a~c.分別為致癇后7、28和56d，淺褐色-深褐色為PECAM-1標記的微血管，藍色為蘇木素復染的細胞核
Figure2.
Immunohistochemistry staining of PECAM-1 in hippocampal CA3 region in experimental mice (×100) a~c. represents 7 d, 28dand 56drespectively (light brown-dark brown showed PECAM-1 labeled capillaries, blue showed hematoxylin labeled nucleus)
3 顳葉癲癇后微血管密度變化
對照組、實驗組小鼠致癇后7、28和56d海馬CA3區微血管密度(Microvessels density，MVD)如表 1所示。Bonferroni post test檢驗顯示致癇后28 d組MVD較對照組上升，差異有統計學意義(t=5.628，P＜0.001)。其它各實驗組與對照組之間均無統計學差異。
表1
兩組小鼠海馬CA3區微血管密度
Table1.
Microvessels density in hippocampal CA3 of normal control group and experimental group
討論
免疫組織化學染色作為目前常用的顯示海馬微血管的方法，通過不同類型的標記物分別標記內皮細胞或基底膜，清楚顯示海馬微血管形態和走行。內皮屏障抗原(Endothelial barrier antigen，EBA)表達于血管管腔面的內皮細胞，海馬各區均觀察到EBA標記的微血管，以齒狀回分子層最為密集。EBA標記的血管多呈管狀，直徑在6~12 μm之間[6]。EBA是一種屏障類型的內皮細胞標記物，可標記出非血管的內皮細胞；但其表達也不穩定，當組織受損后EBA表達立即下降，因此受損腦部采用EBA標記可能會導致結果出現誤差[7]。兔內皮細胞抗原-1(Rat endothelial cell antigen-1，RECA-1)可特異地標記實驗鼠所有類型的內皮細胞，較EBA更全面顯示海馬血管。RECA-1標記的微血管也大多呈管狀，直徑在6～12 μm之間[6]。但RECA-1主要標記大鼠內皮細胞，限制其應用范圍[8]。本實驗采用PECAM-1標記內皮細胞，發現小鼠海馬微血管分布與神經細胞分層具有相對應的層次性，海馬CA3區微血管以始層分布最為密集，輻射層次之，錐體細胞層最為稀疏；微血管走行多與神經元頂樹突方向平行，與海馬長軸垂直。該結果與上述研究較為一致，PECAM-1能夠較好顯示小鼠海馬微血管分布及形態。
目前對癲癇后海馬的微血管重塑進行研究已成為研究TLE發生發展機制的熱點之一。Rigau研究小組發現各種病因導致的TLE患者以及匹羅卡品誘導的癲癇大鼠海馬血管密度均有增加，而且以微血管為主，該小組還發現海馬微血管密度與癲癇發作頻率呈正相關[9]。Nicoletti等[10]進一步研究發現癲癇鼠腦海馬CA3區VEGF表達明顯升高。更有研究發現采用MRI研究癲癇鼠腦血容量(Cerebral blood volume，CBV)和腦血流量(Cerebral blood flow，CBF)，發現癲癇后雖CBF改變不明顯，但CBV明顯上升，SE后14dCBV較SE后2 d上升178%，較對照組上升124% [6]。本實驗結果首次發現匹羅卡品致癇小鼠海馬PECAM-1標記微血管形態隨著致癇后時間推移，微血管在海馬CA3區冠狀切面上碎片狀改變越發明顯，提示血管扭曲程度加重，分支增多；微血管走行方向發生變化，從平行走行逐漸演變成橫穿顆粒細胞層，提示海馬CA3區可能逐漸形成異常血管叢，與神經元增生、膠質增生和軸突生長等有關[6]。
然而，目前也有研究認為癲癇后微血管變化并不是真正的血管重塑過程。采用膠原蛋白IV標記TLE人腦海馬血管，發現在硬化的CA1區血管大多已萎縮，血管表面有許多小棘樣突起，較正常血管表面粗糙。進一步利用電鏡分析發現，這些突起來源于基底膜，是血管的異常出芽。并在縮小的血管管腔里發現活化的星形膠質細胞。研究者認為這些特點提示此類血管是由正常血管崩解形成[11, 12]，但沒有證據表明此類血管也存在于硬化海馬的其他區域以及癲癇后非硬化的海馬組織中，也未能分析該類血管與癲癇的關系。因此，這種血管變化是否具有普適性，目前尚無進一步證據支持。
匹羅卡品誘導的TLE小鼠海馬CA3區存在微血管分布和形態的損害，提示微血管重塑可能參與癲癇后異常神經網絡的形成，為進一步解釋TLE的發病機制提供實驗依據。
癲癇是一種大腦神經元異常高度同步化放電活動所引發的發作性疾病，臨床以顳葉癲癇(Temporal lobe epilepsy，TLE)最為常見。癲癇持續狀態(Status epilepticus，SE)和癇性發作在損害神經元的同時，可刺激神經元新生和膠質增生等組織重塑[1]，此時機體需要大量氧氣和營養物質到受損區域，隨即可出現腦血流量增加，血腦屏障通透性改變以及微血管密度增加和微血管重構。目前已經證實在癲癇發生后人和動物腦內可出現血管形態以及與調節血管再生相關基因的明顯變化[2-4]。體外實驗進一步發現在此過程中海馬神經元可迅速釋放血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，誘導VEGF受體-2表達升高，而給予抗VEGF抗體后血管重構過程被抑制[5]。以上結果提示血管的重塑過程存在于癲癇大腦內。免疫組織化學染色是目前較為常用的顯示海馬微血管構筑的方法之一。利用不同類型標記物分別標記內皮細胞或基底膜，均可以清楚地顯示海馬微血管形態和走行。本實驗將首次采用血小板內皮細胞黏附分子-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)標記內皮細胞，研究TLE后小鼠海馬微血管的分布和形態變化。
材料與方法
1 動物與分組
選5～6周齡健康雄性SPF C57BL/6小鼠18只，體重18～21g；由中南大學動物部提供。該動物實驗通過中南大學湘雅醫院倫理委員會的審批。將小鼠隨機分為正常對照組(n=9)與實驗組(n=9)。兩組動物分別在模型成功建立后7、28和56 d行多聚甲醛灌注取腦，行PECAM-1免疫組織化學染色(每個時間點每組各3只)。
2 顳葉癲癇模型建立
向小鼠腹腔注射氫溴酸東莨菪堿(1 mg/kg)，30 min后腹腔注射匹羅卡品320～340 mg/kg (美國Sigma公司)，待小鼠進入SE 2 h后腹腔注射地西泮7.5 mg/kg終止發作。發作程度按Racine標準分級，2 h內3～5級發作發生3次以上的小鼠進入SE，并歸于致癇成功組。正常對照組除注射與匹羅卡品等劑量的生理鹽水外，余處理均同模型組。在其后的實驗時間內觀察小鼠的行為學。
3 冰凍切片標本制備
腹腔注射10%水合氯醛(5 mL/kg)，麻醉各時間點小鼠。沿小鼠胸骨旁線剪開胸腹腔，暴露心臟和肝臟，取灌注針自心尖向右上45°進針至主動脈起始端，固定針頭，剪開右心耳，快速灌注4℃生理鹽水50 mL至肝臟變白，自右心耳流出的液體清亮后接著灌注4℃ 4%多聚甲醛，先快后慢，約50 mL至小鼠四肢強直僵硬后停止灌注。沿枕骨剪下頭部，仔細剪開頭皮及顱骨，充分暴露并完整剝離腦組織，置于4℃ 4%多聚甲醛后固定12～16 h，0.1 mol/L PBS充分泡洗后移入4℃ 30%蔗糖溶液沉底。冰凍切片機溫度調至-18～-20℃，將蔗糖溶液中的腦組織取出，修塊、包埋后，行腦組織冠狀位連續切片(德國Leica公司)，切片厚30 μm。切片按順序放入低溫防護液0.1 mol/L PBS中含25%甘油和30%乙二醇)中，-20℃保存備用。
4 免疫組織化學檢測
切片從低溫防護液中取出后，0.1 mol/L PBS(PH7.5)漂洗30 min；1% H2O2室溫孵育30 min以滅活內源性過氧化物酶；檸檬酸微波修復抗原20 min；含10%正常兔血清、抗生物素蛋白溶液(200 μL/mL，美國Vector Lab公司)和0.3% Triton混合液中室溫孵育2 h；含生物素(200 μL /mL，美國Vector Lab公司)和一抗大鼠源PECAM-1多克隆抗體(1：25，美國BD公司)的0.1 mol/L PBS(PH7.5)溶液中室溫孵育48 h；生物素化山羊抗大鼠二抗(1：200，美國KPL公司)的0.1 mol/L PBS(PH7.5)溶液中室溫孵育1 h；VECTASTAIN? ABC kit(美國Vector Lab公司)，室溫下孵育1 h；DAB室溫顯色10～15 min；每步驟間用0.1 M(mol/L) PBS漂洗3次，每次15 min；將切片輕柔鋪片于載玻片上，自然風干30 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明和封片。陰性對照采用PBS代替一抗，余同上述操作。所有步驟均在搖床上進行。
5 圖像分析和統計學方法
萊卡DM 5000 B顯微鏡拍攝免疫組化圖片。采用盲法使用Imaging-Pro Plus 6.0軟件(IPP 6.0，Media Cybernetics，USA)對圖片進行分析，計算小鼠海馬CA3區微血管密度。微血管平均密度(Numbers/Area)=微血管數目/已知總面積(根據IPP 6.0計算)。所有縱向的微血管均納入計算。血管的分支被認為是獨立的血管。在腦片上顯示橫截面的血管不納入計算。每組每只小鼠分析3張距前囟不同距離的腦片。
采用Graph Pad Prism 5.01軟件分析實驗數據。實驗數據用均數±標準差表示，對照組與實驗組組間比較采用兩因素χ2分析，組間比較采用Bonferroni post test檢驗，P值＜0.05為差異有統計學意義。
結果
在實驗期間，所有小鼠毛發光潔，自由攝食飲水，無死亡。
1 正常對照組小鼠海馬CA3區微血管形態
采用PECAM-1標記對照組小鼠海馬微血管的內皮細胞，可清楚顯示微血管呈淺褐色-深褐色，血管分支少；組織中細胞核被蘇木素復染為藍色，海馬微血管呈層狀分布，與神經細胞構筑表現一致；海馬CA3區微血管以始層分布最為密集，輻射層次之，錐體細胞層最為稀疏。各時間點小鼠海馬CA3區微血管的形態和分布基本一致(圖 1)。
圖1
對照組小鼠海馬CA3區PECAM-1免疫組化染色(×100) a~c.分別為7、28和56d，淺褐色-深褐色為PECAM-1標記的微血管，藍色為蘇木素復染的細胞核
Figure1.
Immunohistochemistry staining of PECAM-1 in hippocampal CA3 region in normal control mice (×100) a~c. represents 7 d, 28dand 56drespectively (light brown-dark brown showed PECAM-1 labeled capillaries, blue showed hematoxylin labeled nucleus)
2 實驗組小鼠海馬CA3區微血管形態
匹羅卡品致癇后7d海馬CA3區微血管排列方向紊亂，平行神經元頂樹突排列的血管減少，片段狀血管開始出現；28 d微血管排列明顯紊亂，血管呈片段狀散亂分布在海馬CA3區；56 d微血管數目較前下降，血管排列分散，仍可見片段狀微血管(圖 2)。
圖2
實驗組小鼠海馬CA3區PECAM-1免疫組化染色(×100) a~c.分別為致癇后7、28和56d，淺褐色-深褐色為PECAM-1標記的微血管，藍色為蘇木素復染的細胞核
Figure2.
Immunohistochemistry staining of PECAM-1 in hippocampal CA3 region in experimental mice (×100) a~c. represents 7 d, 28dand 56drespectively (light brown-dark brown showed PECAM-1 labeled capillaries, blue showed hematoxylin labeled nucleus)
3 顳葉癲癇后微血管密度變化
對照組、實驗組小鼠致癇后7、28和56d海馬CA3區微血管密度(Microvessels density，MVD)如表 1所示。Bonferroni post test檢驗顯示致癇后28 d組MVD較對照組上升，差異有統計學意義(t=5.628，P＜0.001)。其它各實驗組與對照組之間均無統計學差異。
表1
兩組小鼠海馬CA3區微血管密度
Table1.
Microvessels density in hippocampal CA3 of normal control group and experimental group
討論
免疫組織化學染色作為目前常用的顯示海馬微血管的方法，通過不同類型的標記物分別標記內皮細胞或基底膜，清楚顯示海馬微血管形態和走行。內皮屏障抗原(Endothelial barrier antigen，EBA)表達于血管管腔面的內皮細胞，海馬各區均觀察到EBA標記的微血管，以齒狀回分子層最為密集。EBA標記的血管多呈管狀，直徑在6~12 μm之間[6]。EBA是一種屏障類型的內皮細胞標記物，可標記出非血管的內皮細胞；但其表達也不穩定，當組織受損后EBA表達立即下降，因此受損腦部采用EBA標記可能會導致結果出現誤差[7]。兔內皮細胞抗原-1(Rat endothelial cell antigen-1，RECA-1)可特異地標記實驗鼠所有類型的內皮細胞，較EBA更全面顯示海馬血管。RECA-1標記的微血管也大多呈管狀，直徑在6～12 μm之間[6]。但RECA-1主要標記大鼠內皮細胞，限制其應用范圍[8]。本實驗采用PECAM-1標記內皮細胞，發現小鼠海馬微血管分布與神經細胞分層具有相對應的層次性，海馬CA3區微血管以始層分布最為密集，輻射層次之，錐體細胞層最為稀疏；微血管走行多與神經元頂樹突方向平行，與海馬長軸垂直。該結果與上述研究較為一致，PECAM-1能夠較好顯示小鼠海馬微血管分布及形態。
目前對癲癇后海馬的微血管重塑進行研究已成為研究TLE發生發展機制的熱點之一。Rigau研究小組發現各種病因導致的TLE患者以及匹羅卡品誘導的癲癇大鼠海馬血管密度均有增加，而且以微血管為主，該小組還發現海馬微血管密度與癲癇發作頻率呈正相關[9]。Nicoletti等[10]進一步研究發現癲癇鼠腦海馬CA3區VEGF表達明顯升高。更有研究發現采用MRI研究癲癇鼠腦血容量(Cerebral blood volume，CBV)和腦血流量(Cerebral blood flow，CBF)，發現癲癇后雖CBF改變不明顯，但CBV明顯上升，SE后14dCBV較SE后2 d上升178%，較對照組上升124% [6]。本實驗結果首次發現匹羅卡品致癇小鼠海馬PECAM-1標記微血管形態隨著致癇后時間推移，微血管在海馬CA3區冠狀切面上碎片狀改變越發明顯，提示血管扭曲程度加重，分支增多；微血管走行方向發生變化，從平行走行逐漸演變成橫穿顆粒細胞層，提示海馬CA3區可能逐漸形成異常血管叢，與神經元增生、膠質增生和軸突生長等有關[6]。
然而，目前也有研究認為癲癇后微血管變化并不是真正的血管重塑過程。采用膠原蛋白IV標記TLE人腦海馬血管，發現在硬化的CA1區血管大多已萎縮，血管表面有許多小棘樣突起，較正常血管表面粗糙。進一步利用電鏡分析發現，這些突起來源于基底膜，是血管的異常出芽。并在縮小的血管管腔里發現活化的星形膠質細胞。研究者認為這些特點提示此類血管是由正常血管崩解形成[11, 12]，但沒有證據表明此類血管也存在于硬化海馬的其他區域以及癲癇后非硬化的海馬組織中，也未能分析該類血管與癲癇的關系。因此，這種血管變化是否具有普適性，目前尚無進一步證據支持。
匹羅卡品誘導的TLE小鼠海馬CA3區存在微血管分布和形態的損害，提示微血管重塑可能參與癲癇后異常神經網絡的形成，為進一步解釋TLE的發病機制提供實驗依據。
