<i>HCN</i>基因多態性與內側顳葉癲癇遺傳易感性研究_《癲癇雜志》

作者：

 秦家明 ¹ , 倪冠中 ¹ , 方子研 ¹ , 陳樹達 ² , 蔡曉東 ³ ,  周列民 ⁴

1. 中山大學附屬第一醫院神經內科（廣州，510000）;
2. 廣州市腦科醫院神經內科（廣州，510000）;
3. 廣州市第一人民醫院（廣州，510000）;
4. 中山大學附屬第六醫院（廣州，510000）;

關鍵詞：

內側顳葉癲癇基因多態性遺傳易感 HCN

DOI：

10.7507/2096-0247.20160057

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的應用Sequenom iPEX體系分析超極化激活環核苷酸門控通道（Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated channel，HCN）基因多態性位點與內側顳葉癲癇遺傳易感性相關性。方法研究對象為2013年12月-2016年4月就診于中山大學附屬第一醫院癲癇門診診斷為內側顳葉癲癇患者共143例，同期納入120名醫院體檢中心年度體檢的健康人群為對照組。入組標準為ILAE 2004年診斷依據：①患者年齡12~55歲；②部分性發作或者繼發強直-陣攣發作，有典型的顳葉起源的癥狀，如胃氣上升感、似曾相識感、口咽部和手部自動癥；③伴或不伴有中樞神經系統感染史和熱性驚厥病史；④腦電圖提示單側或雙側顳區尖波、尖慢、棘慢等癲癇樣波；⑤頭顱MRI提示海馬硬化。排除標準為：①腫瘤；②MRI提示局部皮質發育不良。對上述研究對象提取外周血基因組DNA，使用Sequenom iPEX體系進行HCN基因SNP位點檢測HCN1和HCN2共10個多態性位點。采用SPSS 16.0進行統計分析。結果所選HCN1和HCN2 10個SNP位點均滿足Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。HCN1多肽性位點rs17344896 C/T，rs6451973A/G和HCN2多態性位點rs12977194A/G差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 HCN1多態性位點rs17344896 C/T，rs6451973A/G和HCN2多態性位點rs12977194A/G與內側顳葉癲癇遺傳易感性相關。

引用本文： 秦家明, 倪冠中, 方子研, 陳樹達, 蔡曉東, 周列民. HCN基因多態性與內側顳葉癲癇遺傳易感性研究. 癲癇雜志, 2016, 2(4): 322-328. doi: 10.7507/2096-0247.20160057 復制

內側顳葉癲癇(Mesial temporal lobe epilepsy，MTLE)是最常見的癲癇綜合征，其臨床特點表現為：兒童晚期或青春早期起病，發作常由先兆開始，最常見上腹部胃氣上升感及似曾相識感；多伴有口-咽自動癥，常有意識模糊，后繼發全身強直-陣攣發作或止于先兆；發作時間常＞1 min；發作1月數次，多時1天數次^[1]。發作間期腦電圖(EEG)為單側或雙側顳區尖波、尖慢波、棘慢波發放，發作期表現為一側顳區5～9 Hz節律性活動。頭顱MRI顯示海馬硬化(Hippocampus sclrosis，HS)，病理特征為海馬神經元脫失和膠質增生^{[1, 2]}。此類患者多伴有早期觸發因素(Initial precipitating incidents，IPI)，如各種原因引起的癲癇持續狀態或者腦部創傷，熱性驚厥(Febrile seizure，FS)等^{[3, 4]}，在經過數年無癥狀期后出現上述典型發作。兒童早期長時間FS和MTLE的關系已有MRI和術后病理學證實^{[5, 6]}。但兒童FS患者中，僅有小部分發展為MTLE，絕大部分FS患兒在5歲之后并未出現癲癇發作。因此FS繼發海馬損傷導致MTLE可能與遺傳易感因素有關^[7-10]。

近年來，關注MTLE遺傳易感性的研究逐漸增多。多數集中在NFE2L2、PIGP、MVP、ABCB1、CALHM1、GABRA1、GABRA2、GABRA6、SCN1A、KCNJ10等相關離子通道蛋白中，研究結果也各不相同^[11-24]。有研究在105例MTLE-HS病人中發現，5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)轉運體基因SLC6A4單核苷酸多態性位點及在內含子2區存在一個17bp的連續擴增(VNRT)，在功能分析上，這個SNP位點使5-HT的mRNA水平表達增高30%，導致5-HT分泌增加，認為是導致癲癇起源和耐藥的原因之一，采用5-HT再攝取抑制劑如氟西丁對這類難治性癲癇也有一定效果，提示遺傳因素對MTLE的表型和對抗癲癇藥物(AEDs)的反應都有關^[25]。

超極化激活性環核苷酸門控通道(Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN)能產生Ih電流，在心臟和神經系統中表達最豐富^{[26, 27]}。在海馬其Ih電流主要參與維持靜息電位，學習與記憶，睡眠與覺醒^[28-30]。HCN通道包含4個亞型(HCN1~HCN4)，其中，HCN1和HCN2是在神經系統中表達最為豐富^{[31, 32]}。在慢性顳葉癲癇患者和動物模型中都證實海馬中存在HCN表達異常，推測可能是引起自發性癲癇的原因之一^[33-35]。目前，還沒有對HCN通道與MTLE易感性相關研究報道，因此本研究將收集MTLE患者血液標本，對其進行相關分析。

資料與方法

1 研究對象

本項研究已取得中山大學附屬第一醫院倫理委員會批準通過，并且對所有入組患者進行了知情告知。本項研究入組患者均來源于中山大學附屬第一醫院癲癇中心，2013年12月-2016年4月就診患者。入組標準為ILAE 2004年診斷依據：①患者年齡12～55歲；②部分性發作或者繼發強直-陣攣發作，有典型顳葉起源的癥狀：如胃氣上升感，似曾相識感、口咽部和手部自動癥；③伴或不伴有中樞神經系統感染史和熱性驚厥病史；④發作間期EEG提示單側或雙側顳區尖波、尖慢、棘慢等癲癇樣波；⑤頭顱MRI提示HS。排除標準為：①腫瘤；② MRI提示局部皮質發育不良。對照組為本院健康體檢中心120名健康人群。

2 方法

外周血基因組DNA提取后，采用Sequenom iPEX體系進行HCN1和HCN2多態性位點的檢測。根據hapmap計劃網站：(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.zh)篩選10個多態性SNP位點(表 1)： HCN1C/T(rs17344896)、A/G(rs6451793)、A/C(rs16902083)、A/G(rs1483307)、 C/G/T(rs13180087)、C/G(rs6875925)、HCN2 C/G(rs12977194)、C/T(rs2301778)、A/T(rs3829666)、A/G(rs7255568)。設計引物(表 2)，根據試劑盒操作

表1 SNP位點與序列 Table1. SNP sites and sequences

表選項

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基因	rs號	序列
HCN1	rs17344896	AGTAACAATGGACATCTGTTGTTCA[C/T]GTGATACTCATCCATGACAATCAAG
	rs6451793	AGCTTGACAGGATCATAAGTATTTG[A/G]TTAGGCATAGAGAATATTTCTCCAT
	rs16902083	AGCAAGCATCTACTTAGTTCCAGCT[A/C]CGTGCTTCATTCTGTGTTATGGGAA
	rs1483307	GCAGGGCCTCTATAAGAAGGTAAGG[A/G]AGTGGTGAAAGCTAGGCTGGGGTTC
	rs13180087	ATTTATCAATCTGAAGTCCTTACCT[C/G/T]TAATAAGAATGAAGCAGTTGAGGTA
	rs6875925	TTCCTGGTCCTTGCTCCAAGTATTA[C/G]TAAATGCCATTAATGTTTCTCTCAT
HCN2	rs12977194	TCTTTCACAGCCTTGCCAGTGTCTC[A/G]GCCTCACGTCTCACACTCTCTTCAC
	rs2301778	CCTCCATGCCGCTGTTCGCCAACGC[C/T]GACCCCAACTTCGTCACGGCCATGC
	rs3829666	ACTTGAAGCTGAGTGAAGGGCTGAG[A/T]CTGCCTCTCCCCTCAGACCCCGGGG
	rs7255568	CTTGGAACCTTTCAGGCCTGGGATC[A/G]TCCGTGGAGAGAAGCTGAGTGTGGT

表2 Sequenom檢測內側顳葉癲癇易感基因PCR和延伸引物 Table2. Sequenom MassARRAY PCR primer of SNPs associated with epilepsy

表選項

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表2 Sequenom檢測內側顳葉癲癇易感基因PCR和延伸引物 Table2. Sequenom MassARRAY PCR primer of SNPs associated with epilepsy

Gene	SNP	Primer(5′-3′)
HCN1	rs17344896	F:ACGTTGGATGGGCAGTTAGTAACAATGGAC
		R:ACGTTGGATGGCAGTCTGGGTTACTAAAGG
		E:GTGAGTGTCATGGATGAGTATCAC
	rs6451793	F:ACGTTGGATGTTGGAAGAGCAGCTTGACAG
		R:ACGTTGGATGCCAGGACTAACTTTCTTACC
		E:CCCCTGAGAAATATTCTCTATGCCTAA
	rs16902083	F:ACGTTGGATGTTCAGCAAGCATCTACTTAG
		R:ACGTTGGATGATTACTAGTTAGTCCTACGG
		E:CACAGAATGAAGCACG
	rs1483307	F:ACGTTGGATGTGCAGGGCCTCTATAAGAAG
		R:ACGTTGGATGATAGAGAACCCCAGCC
		E:TCCTAGCTTTCACCACT
	rs13180087	F:ACGTTGGATGGATGTGAATGTGAAGTGCAG
		R:ACGTTGGATGACAAGGAGGTACCTCAACTG
		E:TCAACTGCTTCATTCTTATTA
	rs6875925	F:ACGTTGGATGCTTCCTGGTCCTTGCTCCAA
		R:ACGTTGGATGCCACCTGCAGAATACTAGAC
		E:TCCTTGCTCCAAGTATTA
HCN2	rs12977194	F:ACGTTGGATGGGGATGGTATGAGGGAGAAG
		R:ACGTTGGATGAGGTGAAGAGAGTGTGAGAC
		E:GGATCCTTGCCAGTGTCTC
	rs2301778	F:ACGTTGGATGTGGCCTCCATGCCGCTGTT
		R:ACGTTGGATGTCGAACTTGAGCTTGGTCAG
		E:CCCAGGCCGCTGTTCGCCAACGC
	rs3829666	F:ACGTTGGATGGGCGGAGGTAGTCCTTGTC
		R:ACGTTGGATGCACTTGAAGCTGAGTGAAGG
		E:CCGGAGTGAAGGGCTGAG
	rs7255568	F:ACGTTGGATGTGGCCCCTTAATGTCCCTG
		R:ACGTTGGATGCTCATCATAACCACACTCAG
		E:GCTTCTCTCCACGGA

3 統計學方法

應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。使用Haploview 4.2檢測基因型是否偏離Hardy-Weinberg平衡(HWE)，參數資料多組間比較使用單因素方差分析和Bonferroni檢驗進行處理，兩組間比較使用獨立樣本t檢驗進行統計處理。非參數資料使用Kruskal-Wallis法和Mann-Whitney U檢驗進行統計處理，兩組間相關關系采用Spearman相關關系分析法。P值＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 一般情況

本研究共納入病例組患者143例，同期納入年齡和性別相匹配的健康對照人群120名，兩組間性別、年齡無統計學差異。

2 Hardy-Weinberg檢驗

10個SNP的分型數據均滿足Hardy-Weinberg遺傳定律。

3 HCN多態性位點與內側顳葉癲癇易感性比較

HCN1基因包含6個SNP位點： rs17344896 TC/TT在正常對照組和MTLE組分別為：4/95與8/121人，差異具有統計學意義(P＜0.000 1)，見圖 1a。rs6451793 AA/GG/GA在正常對照組和MTLE組中分別為：75/6/13與80/10/39人，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖 1b。rs16902083 AA/CC/CA在正常對照組和MTLE組中分別為40/5/17與69/7/38人，差別無統計學意義(圖 1c)；rs1483307 GA/GG/AA在正常對照組和MTLE組中分別為：49/9/41與56/19/67人，差異無統計學意義，見圖 1d；rs13180087 CC/TT/CT在正常對照組和MTLE組中分別為：21/18/59與40/25/60人，差異無統計學意義(圖 1e)；rs6875925 CC/GG(GC)在正常對照組和MTLE組中分別為：76/22與70/31人，差異無統計學意義(圖 1f)。

圖1 HCN1基因多態性位點與MTLE遺傳相關性

a正常對照組與MTLE組rs17344896 TC/TT對照；b正常對照組和MTLE組rs6451793 AA/GG/GA對照；c正常對照組和MTLE組rs16902083 AA/CC/CA對照；d正常對照組和MTLE組rs1483307 GA/GG/AA對照；e正常對照組和MTLE組rs13180087 CC/TT/CT對照；f正常對照組和MTLE組s6875925 CC/GG(GC)對照

Figure1. HCN1 gene single-nucleotide polymophisms and genetic relation

a. Comparison of rs17344896 TC/TT between control group and MTLE group; b. Comparison of rs6451793 AA/GG/GA between control group and MTLE group; c. Comparison of rs16902083 AA/CC/CA between control group and MTLE group; d. Comparison of rs1483307 GA/GG/AA between control group and MTLE group; e. Comparison of rs13180087 CC/TT/CT between control group and MTLE group; f. Comparison of s6875925 CC/GG(GC) between control group and MTLE group

圖選項

下載全尺寸圖像

下載幻燈片

HCN2包含4個SNP位點： rs12977194 AA/GG(GA)在正常對照組和MTLE組中分別為：23/86與3/121人，差異具有統計學意義(P＜0.000 1)，見圖 2a；rs2301778 CC/CT/TT在正常對照組和MTLE組中分別為：39/42/9與43/70/16人，差異無統計學意義(圖 2b)；rs3829666 TA/TT(AA)在正常對照和MTLE組中分別為26/78與31/98人，差異無統計學意義(圖 2c)。rs7255568 GA和GG/AA在正常對照和MTLE組中分別為33/68與32/97，差異無統計學意義(圖 2d)。總體χ²值和P值見表 3。

圖2 HCN2基因多態性位點與MTLE遺傳相關性

a正常對照組和MTLE組rs12977194 AA/GG(GA)對照；b正常對照組和MTLE組rs2301778 CC/CT/TT對照；c正常對照組和MTLE組rs3829666 TA/TT(AA)對照；d正常對照組和MTLE組rs7255568 GA和GG/AA對照

Figure2. HCN2 gene single-nucleotide polymophisms and genetic relation

a. Comparison of rs12977194 AA/GG(GA) between control group and MTLE group; b. Comparison of rs2301778 CC/CT/TT between control group and MTLE group; c. Comparison of rs3829666 TA/TT(AA) between control group and MTLE group; d. Comparison of rs7255568 GA and GG/AA between control group and MTLE group

圖選項

下載全尺寸圖像

下載幻燈片

表3 HCN多態性位點與內側顳葉癲癇易感性 Table3. HCN SNP and MTLE genetic relation

表選項

下載CSV

SNP位點	MAF率^a	χ²值	P值
rs17344896	5.67	0.102	0.000
rs6451793	26.48	0.196	0.012
rs16902083	14.22	0.458	0.769
rs1483307	27.82	0.105	0.258
rs13180087	17.93	0.331	0.146
rs6875925	9.01	0.779	0.203
rs12977194	27.70	0.284	0.000
rs2301778	28.51	0.056	0.319
rs3829666	9.23	0.011	0.864
rs7255568	29.39	0.086	0.189
注：^aMAF指等位基因頻率(Minor allele frequency)

討論

1 HCN遺傳因素與內側顳葉癲癇相關性

MTLE遺傳易感性研究一直以來陸續有報道，既往研究較多的有CALHM1基因^{[12, 36]}、 CAMSAP1L1基因^[37]、 GABRA1、GABRA6、GABRB2、GABRG2基因^{[24, 38]}、 GABRB3基因、GABRB1基因^[18]、 TLR4基因^[16]、 KCNMB4基因^[20]、 5HT1AR基因^[19]、 5HTR2A基因^[11]、 5HTT基因^[39]、 SCN1A基因^[13]、 HMGA2 ^[40]、 DDR2基因、ALDH5A1基因^[38]、 CPA6基因^[41]、 ASIC1基因^[17]、 C3基因^[23]、 MMP-9基因^[22]、 KCNJ10 ^[15]、 AQP4基因、ABCB1基因^[42]等。在上述基因易感性中，絕大部分為陰性結果。而且在上述報道中，還包括了AEDs療效的基因組學研究，MTLE大部分屬于藥物難治性癲癇，包括GABR多個亞型上的位點基因型及對GABA降解酶GABA-T編碼基因ABAT相關位點分析，但未發現基因多態性與藥物療效之間的相關性。研究發現GABRA1，GABRA2，GABRA3基因多態性位點與AEDs(VPA，CBZ，LTG及OXC等)療效有關聯。但Balan對上述基因多態性位點與多種AEDs療效結果無相關性^[24]。而目前對于顳葉癲癇中藥物療效與基因多態性主要集中在SCN1A rs3812718位點錯義突變上，有研究表明，中國香港地區和馬來西亞癲癇患者中未見該多態性位點與藥物療效相關，且發現該位點與MTLE遺傳易感性也無相關^[43]，這是迄今為止最大樣本的研究。在上述位點的研究中，無論是對MTLE遺傳易感性研究，還是藥物難治性患者療效與SNP的研究中，均無HCN基因相關報道。

在本研究中，對HCN1基因6個SNP位點進行統計顯示，rs17344896與rs6451793兩個SNP位點在正常對照組和MTLE組中差異有統計學意義，其余4個未見統計學差異；對HCN2基因4個SNP位點的統計顯示，rs12977194在正常對照組和MTLE組中差異有統計學意義，其余3個SNP位點無統計學意義。從該研究結果中得出，HCN基因多態性與MTLE綜合征相關。rs17344896、rs6451793和rs12977194的3個SNP位點分別位于HCN1和HCN2內含子區NM_021072.3和NM_001194.3，均為內含子的多態性位點。一般認為，內含子在基因轉錄時被剪切掉，因此，內含子區域的突變或者多態性位點不影響基因的轉錄。但近年，對內含子突變的研究越來越多，也證實某些內含子區的突變能夠影響基因的轉錄及蛋白質的構象。Escayg于2001年在兩個GEFS家族中發現了SCN1A基因3號外顯子剪切位點上游18bp的內含子區一個SNP位點，可能與SCN1A突變有關^[44]。Takahashi于2013年在29例Rassmussen腦炎中，發現CTLA4基因內含子SNP位點231779與Rassmussen腦炎的發生有關^[45]。因此我們推測，HCN1和HCN2內含子的突變在某些程度上與MTLE的發生有關。對于HCN的多態性研究，Andrew等于2012年報道了HCN基因多態性和神經癥，認知功能下降和抑郁風險的相關研究，但對HCN1-HCN4基因共計43個多態性位點的研究中，并未得出陽性結果^[46]。在癲癇患者中，本研究小組是首次對HCN基因多態性與MTLE遺傳易感性進行相關研究。

綜上，HCN1多肽性位點rs17344896 C/T，rs6451973A/G和HCN2多態性位點rs12977194A/G與MTLE遺傳易感性相關。