引用本文： 江軍, 羅小青, 李承, 匡光濤, 王曉璐, 梁菊芳, 劉明洋, 劉智勝. 長時程增強在幼年癲癇大鼠慢性認知功能障礙中的作用. 癲癇雜志, 2016, 2(3): 220-223. doi: 10.7507/2096-0247.20160041 復制
癲癇是腦神經元異常放電引起反復癇性發作，數千萬患兒遭受其折磨[1, 2]。癲癇的起病與年齡密切相關，嬰幼兒期是癲癇發病的第一個高峰期[3]。近期研究發現約30%發育期癲癇患者遠期會出現認知功能障礙、抑郁或焦慮等神經精神并發癥[4-6]，但目前發病機制尚不明確。
臨床及動物研究發現多數發育期癲癇患者后期會合并學習困難、記憶減退等認知功能障礙。近來研究發現海馬突觸可塑性在癲癇患者認知功能障礙中發揮主要作用。突觸是神經元之間的連接部位，是神經元之間傳遞信息的重要結構，其數量和功效發生改變都可引起突觸可塑性的改變[7, 8]，進而增強或減弱神經元之間的信息傳遞。突觸可塑性主要表現形式——長時程增強(Long term potentiation，LTP)和長時程抑制現象已被公認為是學習記憶活動的細胞水平的生物學基礎，其中LTP分為誘導期和維持期，是突觸可塑性的功能指標，也是研究學習與記憶的理想模型[9]。然而LTP是否參與幼年癲癇大鼠慢性認知功能障礙的形成，有待進一步探索。
本研究采用氯化鋰-匹羅卡品致幼年期癲癇大鼠模型，首先采用Morris水迷宮實驗、曠場實驗評估幼年癲癇大鼠成年后認知功能；其次應用離體腦片電生理方法記錄觀察癲癇大鼠及對照大鼠海馬基礎場電位，及觀察高頻刺激后癲癇大鼠海馬LTP與對照大鼠比較是否發生抑制。
材料與方法
1 材料
1.1 實驗動物
實驗采用清潔級新生SD大鼠22只，購自華中科技大學實驗動物中心。第21天斷奶后，每6只子鼠一籠，動物于自然光下飼養，自由飲食、飲水。大鼠正常飼養到第61～66天(P61～66)，分別進行各項實驗。
1.2 主要試劑及儀器
匹羅卡品、氯化鎂、氯化鈣(Sigma)；氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、葡萄糖(國產分析純)；95% O2和5% CO2混合氣體等。Morris水迷宮(RD 1101-MWM，上海移數信息科技有限公司)；RM6240多道生理記錄儀(成都儀器廠)；針形電極(成都儀器廠)；振動切片機(ZQP-86型，上海之信儀器有限公司)；微電極操縱儀(MX160L，成都儀器廠)；微電極放大器(SWF-2W，成都儀器廠)；Hum Bug電噪音消除儀(Manufactured in Canada)。
2 實驗方法
2.1 實驗大鼠分組方法及評估
22只新生SD大鼠隨機分為氯化鋰-匹羅卡品(Li-pilo)模型組、生理鹽水(對照)組，出生后第21天(P21)，模型組大鼠首先經腹腔注射氯化鋰(3 mg Eq/kg)，20 h后注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，30 min后再注射匹羅卡品(25 mg/kg)，對照組腹腔注射等量生理鹽水。抽搐行為評價采用經Becker等修改后的Racine分級標準[10]：①0級：無反應；②Ⅰ級：耳面部抽搐；③Ⅱ級：肌陣攣，但無直立位；④Ⅲ級：肌陣攣，伴直立位；⑤Ⅳ級：全身強直陣攣發作；⑥Ⅴ級：全身強直陣攣發作，并失去體位控制。制備癲癇模型時，出現反復強直－陣攣發作，即癲癇持續狀態(Status epilepsy, SE)，SE 1h后，給予10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射解除抽搐。選擇點燃出現RacineⅣ級以上并存活的大鼠進行實驗。
2.2 癲癇大鼠認知功能評估
2.2.1 Morris水迷宮實驗
實驗共歷時5 d，每天定于固定時間段，每個時間段訓練4次。每日以大鼠4次訓練潛伏期的平均值做為大鼠當日的學習成績。Li-pilo模型組和對照組大鼠，于P61-66進行Morris水迷宮實驗，比較大鼠平均潛伏期、運動總路程來評估癲癇大鼠的認知功能，明確癲癇大鼠是否會出現認知功能障礙。
2.2.2 曠場實驗
實驗在安靜環境下進行, 每次實驗時捏住大鼠尾巴距根部2/3處輕放入方箱底面中心，同時進行攝像和計時，顯示器中觀察其3 min內活動情況，5 min后停止攝像。每次測定結束將動物排泄物清除干凈，每只僅測定1次。實驗時間結束錄像分析，軟件統計。
2.3 離體腦片海馬場電位的記錄方法
2.3.1 離體海馬腦片的制備
兩組大鼠用水合氯醛麻醉后斷頭，迅速取出大腦，放置在＜4℃的冰人工腦脊液(ACSF)中并進行修塊。用502膠將組織塊固定在振動切片機的切片槽里，倒入適當的冰ACSF，用振動切片機把含有海馬的大腦部分切成腦片(橫切面)，厚度500μm。腦片實驗記錄前在持續充有95%O2和5%CO2混合氣體的常溫ACSF中孵育至少1.5 h。
2.3.2 離體腦片海馬CA1區場電位記錄
將腦片移至界面型記錄槽，通過尼龍網與槽內ACSF接觸，以1~2 mL/min持續灌流腦片，腦脊液溫度控制在(30±1)℃，持續充有95%O2和5%CO2混合氣體。在解剖顯微鏡下將雙極不銹鋼刺激電極置于海馬CA1的Schaffer側支通路上，記錄微電極置于海馬的CA1區，其尖端置于腦片表面下約200μm處。微電極內充灌3 mol/L NaCl溶液，阻抗為2~5 MΩ。場電位經微電極放大器放大后，輸出信號用數據采集系統RM6240進行信號的記錄、分析和處理。刺激方波的波寬為0.1 ms，頻率為0.1 Hz，并調整刺激強度使突觸反應等于最大突觸電位的一半。應用兩串頻率為100 Hz的高頻刺激(每串持續1 s，串間隔為10 s)引導LTP。
3 統計學方法
采用SPSS 16.0統計學軟件進行統計分析，實驗數據計算均以均數±標準誤表示。水迷宮及曠場實驗數據采用單因素方差分析分析。離體腦片海馬場電位實驗結果數據處理：以高頻刺激前場電位的波幅或斜率的均值作為基礎值，每一片離體腦片的數據以高頻刺激前后的波幅或斜率與該腦片基礎值的百分比表示，再每隔12個連續刺激提取一個數據做場電位時程圖；以高頻刺激后的波幅或斜率的均值與該腦片基礎值的百分比表示LTP，來做統計分析圖。海馬場電位LTP的結果采用單因素方差分析比較。P值＜0.05為差異具有統計學意義。
結果
1 兩組大鼠在學習記憶功能、自主探索行為的比較
通過Morris水迷宮觀察比較模型組與對照組大鼠的平均潛伏期及運動總路程，評估幼年癲癇大鼠成年后學習記憶功能；通過曠場實驗檢測5 min內大鼠運動總路程，評估幼年癲癇大鼠成年后自主探索能力。結果顯示：①水迷宮實驗第1～4天模型組大鼠平均潛伏期及運動總路程與對照組大鼠相比無明顯改變，第5天模型組大鼠平均潛伏期及運動總路程顯著高于對照組大鼠(n=8，t=10.86, P＜0.05；n=8，t=9.98, P＜0.05)，見圖 1a、b、表 1、2。②曠場實驗中，模型組大鼠5 min內探索的總路程顯著低于對照組大鼠(n=8，t=12.89, P＜0.05)，見圖 1c。
圖1
兩組大鼠成年后認知功能比較水迷宮實驗第1~5天大鼠平均潛伏期(a)；探索總路程(b)及5 min內總路程比較(c)
Figure1.
Comparison of cognitive function in adulthood between epilepsy rats and the controls Morris experiment showed the average incubation period (a), total distance (b) and total distance in 5 min (c) between the two groups after SE in 1 to 5 days
表1
兩組大鼠平均潛伏期比較(
表2
表 2兩組大鼠運動總路程比較(2 兩組大鼠海馬長時程增強的比較
離體腦片場電位記錄的方法顯示：①模型組與對照組相比，海馬基礎場電位斜率與幅值無顯著變化(斜率：n=8，t=1.59, P＞0.05；幅值：n=8，t=0.49，P＞0.05)，見圖 2。②高頻刺激后，模型組大鼠海馬場電位斜率與幅值變化率(LTP)顯著低于對照組大鼠(斜率：n=8，t=13.32, P＜0.05；幅值：n=8，t=20.02, P＜0.05)，見圖 2。
圖2
癲癇大鼠與對照大鼠海馬腦片場電位兩組大鼠海馬基礎場電位斜率(a)、幅值(b)及高頻刺激40 min后長時程增強(c)的比較
Figure2.
Comparison of field potential in hippocampus between epilepsy rats and the controls a.The fEPSP slope between the two groups; b. The fEPSE amplitucle between the two groups; c.The LTP after 40 min post-HFS between the two groups
討論
通過水迷宮及曠場實驗提示幼年癲癇大鼠成年后出現學習記憶功能減退，自主探索能力受損等認知功能障礙，同時離體場電位方法也顯示癲癇大鼠海馬LTP與對照組大鼠比較顯著抑制，結果顯示海馬LTP抑制可能參與癲癇大鼠認知功能障礙的形成。
近期研究發現發育期癲癇患者遠期會出現認知功能障礙、抑郁或焦慮等神經精神并發癥，且這些癥狀并不會隨著癲癇發作的控制而得到明顯改善[4, 5]。我們實驗中幼年癲癇大鼠成年后出現認知功能障礙共患病，與上述報道相一致。近來研究發現突觸可塑性在癲癇患者認知功能障礙中發揮主要作用，突觸可塑性包括結構與功能兩方面，前者主要包括神經元樹突分支的減少、樹突脊的丟失等[4-6]。LTP是突觸可塑性功能指標主要表現形式之一。動物體內(包括人在內)突觸可塑性的增強或減弱與外周信息的傳入、新信息的學習、重要信息的中樞儲存相適應[7-9]。我們實驗中，模型組大鼠海馬LTP顯著抑制，從功能上影響突觸可塑性，繼而可能導致模型組大鼠成年后出現認知功能障礙。LTP可分為誘導期及維持期，實驗中模型組大鼠海馬LTP誘導與對照大鼠相比無明顯改變，但維持期顯著抑制，表明模型組大鼠海馬LTP維持期與認知功能關系更為密切。越來越多證據表明蛋白激酶有誘導LTP形成和整合信息的作用[11]，那么是哪類或哪些蛋白激酶引起突觸可塑性改變，需要進一步實驗。
有報道稱癲癇患者神經精神并發癥對抗癲癇藥物的選擇及預后有較大影響，大大增加癲癇患者的疾病負擔，已成為癲癇死亡率增加的主要原因[4, 6]。因此，對于癲癇患兒治療來說，我們不僅要關注癲癇發作的控制，還需密切關注癲癇患者遠期合并的精神神經癥狀。
癲癇是腦神經元異常放電引起反復癇性發作，數千萬患兒遭受其折磨[1, 2]。癲癇的起病與年齡密切相關，嬰幼兒期是癲癇發病的第一個高峰期[3]。近期研究發現約30%發育期癲癇患者遠期會出現認知功能障礙、抑郁或焦慮等神經精神并發癥[4-6]，但目前發病機制尚不明確。
臨床及動物研究發現多數發育期癲癇患者后期會合并學習困難、記憶減退等認知功能障礙。近來研究發現海馬突觸可塑性在癲癇患者認知功能障礙中發揮主要作用。突觸是神經元之間的連接部位，是神經元之間傳遞信息的重要結構，其數量和功效發生改變都可引起突觸可塑性的改變[7, 8]，進而增強或減弱神經元之間的信息傳遞。突觸可塑性主要表現形式——長時程增強(Long term potentiation，LTP)和長時程抑制現象已被公認為是學習記憶活動的細胞水平的生物學基礎，其中LTP分為誘導期和維持期，是突觸可塑性的功能指標，也是研究學習與記憶的理想模型[9]。然而LTP是否參與幼年癲癇大鼠慢性認知功能障礙的形成，有待進一步探索。
本研究采用氯化鋰-匹羅卡品致幼年期癲癇大鼠模型，首先采用Morris水迷宮實驗、曠場實驗評估幼年癲癇大鼠成年后認知功能；其次應用離體腦片電生理方法記錄觀察癲癇大鼠及對照大鼠海馬基礎場電位，及觀察高頻刺激后癲癇大鼠海馬LTP與對照大鼠比較是否發生抑制。
材料與方法
1 材料
1.1 實驗動物
實驗采用清潔級新生SD大鼠22只，購自華中科技大學實驗動物中心。第21天斷奶后，每6只子鼠一籠，動物于自然光下飼養，自由飲食、飲水。大鼠正常飼養到第61～66天(P61～66)，分別進行各項實驗。
1.2 主要試劑及儀器
匹羅卡品、氯化鎂、氯化鈣(Sigma)；氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、葡萄糖(國產分析純)；95% O2和5% CO2混合氣體等。Morris水迷宮(RD 1101-MWM，上海移數信息科技有限公司)；RM6240多道生理記錄儀(成都儀器廠)；針形電極(成都儀器廠)；振動切片機(ZQP-86型，上海之信儀器有限公司)；微電極操縱儀(MX160L，成都儀器廠)；微電極放大器(SWF-2W，成都儀器廠)；Hum Bug電噪音消除儀(Manufactured in Canada)。
2 實驗方法
2.1 實驗大鼠分組方法及評估
22只新生SD大鼠隨機分為氯化鋰-匹羅卡品(Li-pilo)模型組、生理鹽水(對照)組，出生后第21天(P21)，模型組大鼠首先經腹腔注射氯化鋰(3 mg Eq/kg)，20 h后注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，30 min后再注射匹羅卡品(25 mg/kg)，對照組腹腔注射等量生理鹽水。抽搐行為評價采用經Becker等修改后的Racine分級標準[10]：①0級：無反應；②Ⅰ級：耳面部抽搐；③Ⅱ級：肌陣攣，但無直立位；④Ⅲ級：肌陣攣，伴直立位；⑤Ⅳ級：全身強直陣攣發作；⑥Ⅴ級：全身強直陣攣發作，并失去體位控制。制備癲癇模型時，出現反復強直－陣攣發作，即癲癇持續狀態(Status epilepsy, SE)，SE 1h后，給予10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射解除抽搐。選擇點燃出現RacineⅣ級以上并存活的大鼠進行實驗。
2.2 癲癇大鼠認知功能評估
2.2.1 Morris水迷宮實驗
實驗共歷時5 d，每天定于固定時間段，每個時間段訓練4次。每日以大鼠4次訓練潛伏期的平均值做為大鼠當日的學習成績。Li-pilo模型組和對照組大鼠，于P61-66進行Morris水迷宮實驗，比較大鼠平均潛伏期、運動總路程來評估癲癇大鼠的認知功能，明確癲癇大鼠是否會出現認知功能障礙。
2.2.2 曠場實驗
實驗在安靜環境下進行, 每次實驗時捏住大鼠尾巴距根部2/3處輕放入方箱底面中心，同時進行攝像和計時，顯示器中觀察其3 min內活動情況，5 min后停止攝像。每次測定結束將動物排泄物清除干凈，每只僅測定1次。實驗時間結束錄像分析，軟件統計。
2.3 離體腦片海馬場電位的記錄方法
2.3.1 離體海馬腦片的制備
兩組大鼠用水合氯醛麻醉后斷頭，迅速取出大腦，放置在＜4℃的冰人工腦脊液(ACSF)中并進行修塊。用502膠將組織塊固定在振動切片機的切片槽里，倒入適當的冰ACSF，用振動切片機把含有海馬的大腦部分切成腦片(橫切面)，厚度500μm。腦片實驗記錄前在持續充有95%O2和5%CO2混合氣體的常溫ACSF中孵育至少1.5 h。
2.3.2 離體腦片海馬CA1區場電位記錄
將腦片移至界面型記錄槽，通過尼龍網與槽內ACSF接觸，以1~2 mL/min持續灌流腦片，腦脊液溫度控制在(30±1)℃，持續充有95%O2和5%CO2混合氣體。在解剖顯微鏡下將雙極不銹鋼刺激電極置于海馬CA1的Schaffer側支通路上，記錄微電極置于海馬的CA1區，其尖端置于腦片表面下約200μm處。微電極內充灌3 mol/L NaCl溶液，阻抗為2~5 MΩ。場電位經微電極放大器放大后，輸出信號用數據采集系統RM6240進行信號的記錄、分析和處理。刺激方波的波寬為0.1 ms，頻率為0.1 Hz，并調整刺激強度使突觸反應等于最大突觸電位的一半。應用兩串頻率為100 Hz的高頻刺激(每串持續1 s，串間隔為10 s)引導LTP。
3 統計學方法
采用SPSS 16.0統計學軟件進行統計分析，實驗數據計算均以均數±標準誤表示。水迷宮及曠場實驗數據采用單因素方差分析分析。離體腦片海馬場電位實驗結果數據處理：以高頻刺激前場電位的波幅或斜率的均值作為基礎值，每一片離體腦片的數據以高頻刺激前后的波幅或斜率與該腦片基礎值的百分比表示，再每隔12個連續刺激提取一個數據做場電位時程圖；以高頻刺激后的波幅或斜率的均值與該腦片基礎值的百分比表示LTP，來做統計分析圖。海馬場電位LTP的結果采用單因素方差分析比較。P值＜0.05為差異具有統計學意義。
結果
1 兩組大鼠在學習記憶功能、自主探索行為的比較
通過Morris水迷宮觀察比較模型組與對照組大鼠的平均潛伏期及運動總路程，評估幼年癲癇大鼠成年后學習記憶功能；通過曠場實驗檢測5 min內大鼠運動總路程，評估幼年癲癇大鼠成年后自主探索能力。結果顯示：①水迷宮實驗第1～4天模型組大鼠平均潛伏期及運動總路程與對照組大鼠相比無明顯改變，第5天模型組大鼠平均潛伏期及運動總路程顯著高于對照組大鼠(n=8，t=10.86, P＜0.05；n=8，t=9.98, P＜0.05)，見圖 1a、b、表 1、2。②曠場實驗中，模型組大鼠5 min內探索的總路程顯著低于對照組大鼠(n=8，t=12.89, P＜0.05)，見圖 1c。
圖1
兩組大鼠成年后認知功能比較水迷宮實驗第1~5天大鼠平均潛伏期(a)；探索總路程(b)及5 min內總路程比較(c)
Figure1.
Comparison of cognitive function in adulthood between epilepsy rats and the controls Morris experiment showed the average incubation period (a), total distance (b) and total distance in 5 min (c) between the two groups after SE in 1 to 5 days
表1
兩組大鼠平均潛伏期比較(
表2
表 2兩組大鼠運動總路程比較(2 兩組大鼠海馬長時程增強的比較
離體腦片場電位記錄的方法顯示：①模型組與對照組相比，海馬基礎場電位斜率與幅值無顯著變化(斜率：n=8，t=1.59, P＞0.05；幅值：n=8，t=0.49，P＞0.05)，見圖 2。②高頻刺激后，模型組大鼠海馬場電位斜率與幅值變化率(LTP)顯著低于對照組大鼠(斜率：n=8，t=13.32, P＜0.05；幅值：n=8，t=20.02, P＜0.05)，見圖 2。
圖2
癲癇大鼠與對照大鼠海馬腦片場電位兩組大鼠海馬基礎場電位斜率(a)、幅值(b)及高頻刺激40 min后長時程增強(c)的比較
Figure2.
Comparison of field potential in hippocampus between epilepsy rats and the controls a.The fEPSP slope between the two groups; b. The fEPSE amplitucle between the two groups; c.The LTP after 40 min post-HFS between the two groups
討論
通過水迷宮及曠場實驗提示幼年癲癇大鼠成年后出現學習記憶功能減退，自主探索能力受損等認知功能障礙，同時離體場電位方法也顯示癲癇大鼠海馬LTP與對照組大鼠比較顯著抑制，結果顯示海馬LTP抑制可能參與癲癇大鼠認知功能障礙的形成。
近期研究發現發育期癲癇患者遠期會出現認知功能障礙、抑郁或焦慮等神經精神并發癥，且這些癥狀并不會隨著癲癇發作的控制而得到明顯改善[4, 5]。我們實驗中幼年癲癇大鼠成年后出現認知功能障礙共患病，與上述報道相一致。近來研究發現突觸可塑性在癲癇患者認知功能障礙中發揮主要作用，突觸可塑性包括結構與功能兩方面，前者主要包括神經元樹突分支的減少、樹突脊的丟失等[4-6]。LTP是突觸可塑性功能指標主要表現形式之一。動物體內(包括人在內)突觸可塑性的增強或減弱與外周信息的傳入、新信息的學習、重要信息的中樞儲存相適應[7-9]。我們實驗中，模型組大鼠海馬LTP顯著抑制，從功能上影響突觸可塑性，繼而可能導致模型組大鼠成年后出現認知功能障礙。LTP可分為誘導期及維持期，實驗中模型組大鼠海馬LTP誘導與對照大鼠相比無明顯改變，但維持期顯著抑制，表明模型組大鼠海馬LTP維持期與認知功能關系更為密切。越來越多證據表明蛋白激酶有誘導LTP形成和整合信息的作用[11]，那么是哪類或哪些蛋白激酶引起突觸可塑性改變，需要進一步實驗。
有報道稱癲癇患者神經精神并發癥對抗癲癇藥物的選擇及預后有較大影響，大大增加癲癇患者的疾病負擔，已成為癲癇死亡率增加的主要原因[4, 6]。因此，對于癲癇患兒治療來說，我們不僅要關注癲癇發作的控制，還需密切關注癲癇患者遠期合并的精神神經癥狀。
