引用本文： 胡凱, 龍莉莉, 馮麗, 解媛媛, 龍泓宇, 肖波. 神經生長分化相關miR-124a與miR-9在癲癇發生中表達動態改變的研究. 癲癇雜志, 2016, 2(3): 224-228. doi: 10.7507/2096-0247.20160042 復制
海馬神經再生是顳葉癲癇病理生理機制中的重要組成部分[1-3]。神經發生是神經干細胞(Neural stem cells, NSCs)分化形成新生神經元的過程，雖然大多數神經發生在初始階段就已完成，但大腦中部分區域終生存在神經發生過程，最重要的就包括海馬齒狀回(Dentate gyrus, DG)等[4, 5]。生理狀態下，海馬NSCs主要分布于齒狀回亞顆粒層(Sub-granular zone, SGZ)，并在此增殖和產生新生神經細胞，其中多數分化為DG顆粒細胞，并遷移至顆粒細胞層(Granule cell layer, GCL)，其樹突延伸至DG分子層，并向DG、CA3區透明層伸出軸突，通過建立特異性傳入和傳出突觸，與功能性海馬環路融合，參與空間記憶的形成[6, 7]。癲癇病理狀態下，海馬神經發生數量異常增加，相當數量的新生神經元異常遷移至齒狀回門區或分子層，參與了海馬異常神經環路形成，在癲癇發生機制中具有重要作用[2]。
MicroRNAs(miRNAs)是一大類長約20~24個核苷酸的小RNA基因，通過負性調控轉錄后的靶基因表達[8]，參與了生物發育、神經分化、細胞增殖、凋亡和脂肪代謝等過程，是與細胞增殖分化、生物發育相關的重要調控因子[9]。miRNAs與癲癇也緊密相關。例如，多項應用癲癇動物模型和芯片篩選技術的研究表明，在癲癇持續狀態(SE)后、顳葉癲癇狀態下的海馬miRNAs表達譜發生變化[10, 11]，而且一些有表達改變的miRNAs(如miR-146a)與臨床癲癇患者海馬組織中相應miRNAs的表達改變呈一致性[12]，提示這些miRNAs可能是SE后神經元凋亡、壞死或癲癇發生的重要調控因子；同時，miRNAs芯片篩選出的、具有差異表達的miRNAs，多與細胞凋亡壞死、炎癥或膠質增生有關，特異性針對上述miRNAs(如miR-132、miR-134、miR-34a)的功能學和機制研究表明，這些miRNAs在SE后神經元壞死、炎癥過程中發揮了重要作用[11, 13, 14]。但迄今為止，miRNAs調控癲癇的表觀遺傳學研究多集中在凋亡、壞死或炎癥相關miRNAs，而神經生長分化相關miRNAs在癲癇發生中表達變化和作用機制的報道甚少。
miR-124a和miR-9是神經生長與分化過程中最重要的miRNAs。miR-124a呈神經系統特異性、于腦組織中豐富表達，其核苷酸序列在物種間具高保守性。現有研究表明，miR-124a在發育中大腦或成人側腦室周圍區域中可調控NSCs和促進神經發生，可能與其下調轉錄因子Sox9活性、促進NSCs分化和成熟有關[15]。但目前國內外尚無報道，miR-124a在SE后海馬重構中是否也能夠調控和促進神經再生。與miR-124a有類似特點的還有miR-9，其不僅能調控神經分化，還具有促進NSCs增殖的重要作用。如已有研究提示，miR-9在胚胎期發育和成人海馬再生中具有調控NSCs增殖、分化、遷徙和促進神經再生的作用[16]。但迄今仍缺乏miR-9是否在SE后海馬中調控和促進神經再生和網絡重塑的研究。
因此，本研究擬以miRNAs可能參與了癲癇形成中海馬神經再生為出發點，通過建立大鼠癲癇模型、模擬癲癇的發生過程，獲取各相應時間點大鼠海馬標本，應用熒光定量qPCR檢測神經生長分化相關miR-124a和miR-9在癲癇發生中表達水平的動態改變，首次證實其在癲癇發生中海馬內的表達變化，為進一步研究和闡述上述miRNAs參與調控癲癇的表觀遺傳學機制奠定基礎。
材料與方法
1 材料
1.1 實驗動物與分組
6～8周健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(220±30) g，56只；由中南大學實驗動物學部提供。置于室溫18～25℃、相對濕度50%～60%、人工12 h晝/夜循環照明的環境中分籠飼養。大鼠可自由攝食和飲水。每日定時清洗籠舍。采用隨機數字表法，將大鼠隨機分到實驗組(n=50)與對照組(n=6)。實驗組又分為癲癇持續狀態(SE)后4個亞組：1、7、14、28 d組(慢性癲癇)。實驗組造模后，采用Racine’s評分標準，達到Ⅳ級或以上發作者，為致癇成功大鼠；未達該標準者舍棄；對成功存活至慢性期、并出現自發性癲癇發作為慢性癲癇大鼠。對實驗組中每個亞組，擬隨機選取6只大鼠入組，與對照組6只大鼠保持一致。
1.2 主要試劑和儀器
匹羅卡品(Pilocarpine)、氯化鋰(Lithium)購自美國Sigma公司；10%水合氯醛、生理鹽水購自中南大學湘雅醫院藥劑科；MiRNA primers購自廣州銳博生物科技有限公司(Ribo-Bio Co.Ltd)；miRNAs qPCR Quantitation Kit、逆轉錄酶(M-MLV RT)、RNase酶抑制劑購自美國Fermentas公司；RNA提取物Trizol、熒光染料Sybr Green I(Lot no. 30033W)購自美國Invitrogen公司。使用ABI Mx3000P QPCR儀產自美國Stratagene公司。
2 實驗方法
2.1 制備氯化鋰-匹羅卡品大鼠癲癇模型
實驗組大鼠腹腔注射氯化鋰(LiCl，125 mg/kg)，18~20 h后腹腔注射匹羅卡品(Pilo，20 mg/kg)，Pilo和LiCl均用無菌生理鹽水新鮮配制。注射Pilo后觀察大鼠的行為變化，癇性發作程度按Racine’s標準分級。達到RacineⅣ-Ⅴ級的SE大鼠，為致癇成功組；若無發作、或發作未達RacineⅣ-Ⅴ級，繼續注射Pilo 10 mg/(kg·次)，可重復6次，在此期間發作程度可達RacineⅣ-Ⅴ級者也歸為致癇成功組；未達標準者舍棄。SE需持續60 min，后予以10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射以終止發作。對照組大鼠給予等量生理鹽水，觀察行為學變化，每日觀察時間為晨8~20點。在慢性癲癇發作期間，觀察和視頻記錄大鼠自發性癲癇發作的情況。
2.2 標本采集
取各實驗組大鼠，10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉后，斷頭取腦。在生理鹽水冰面上，鈍性分離雙側海馬組織，存儲于進口Corning凍存管、并在液氮罐中以-180℃保存。對照組大鼠海馬組織標本同樣按照上述方法采集和保存。
2.3 RNA抽提和質量驗證
取大鼠腦組織，放入玻璃研磨器。加入液氮速凍后，研磨成粉狀。按照每100 mg加入1mL Trizol，在研磨器中混勻后，倒入EP管中，顛倒混勻10下，室溫下靜止放置5 min；每1mL Trizol中加入0.2 mL氯仿，在蓋緊好管蓋后，用力搖晃混勻，室溫下靜止放置5 min后，12 000 rpm離心15 min。RNA沉淀：將上層水相轉移至新1.5mL EP管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻后，室溫放置5 min，以12 000 rpm離心10 min。RNA洗脫：小心倒去上清，并留取沉淀。加1 mL 75%的乙醇(預冷)，振蕩洗滌RNA沉淀一次后，以7 500 rpm離心5 min。RNA再溶解：小心倒去上清后，取沉淀放置于超凈工作臺，開風機吹干(30 min，直至RNA沉淀透明)。然后在管中加入20μL DEPC水溶解，并在55~60℃下，孵育10 min助熔。加樣過程：PCR Marker：1μL Marker、1μL Loading Buffer、4μL TAE，混勻于塑料膜上，并加入孔中；PCR樣品：5μL樣品RNA、1μL Loading Buffer，混勻后依次加樣、電泳、紫外燈檢測。
2.4 cDNA第一鏈合成
合成cDNA第一鏈逆轉錄反應體系為25μL；首先在RNase free的離心管中加入2μg的總RNA和美國Fermentas公司提供的miR-RT primers 2μL，再加入DEPC水至總體積11μL；混勻，4℃短暫離心，70℃水浴10 min后，用冰浴冷卻2 min；短暫離心后，依次加入5×Buffer 5μL，10 mM dNTPs 0.5μL，RNaseA抑制劑1μL，M-MLV逆轉錄酶0.5μL，ddH2O 7μL，共25μL；混勻、短暫離心后，42℃反應60 min后，70℃水浴10 min使酶失活，即得cDNA第一鏈。
2.5 實時定量PCR(qPCR)
選定需驗證的miRNAs行熒光定量PCR檢測；內參miRNA選擇U6。所有引物均由廣州銳博生物科技有限公司設計合成。實時熒光定量PCR采用Hairpin-itTM miRNAs qPCR Quantitation Kit(Catalog No.QPM-010)，熒光染料為Sybr Green I (Invitrogen；Lot no. 30033W)，在Mx3000P qPCR System(Stratagene，US)儀器上完成。qPCR反應體系如下：其中1×Realtime PCR Buffer包含3 mM Mg2+、0.2 mM dNTP和SYBR Green，MiR Forward Primer與MiR Reverse Primer包括qPCR正反引物。反應體系：MiR Forward Primer(5μΜ)2μL；MiR Reverse Primer(5μΜ)2μL；Sybr Green I 9μL；MiRNA RT Product 2μL；ddH2O 5μL；加至總體積20μL。qPCR條件包括：①95℃20 s，②95℃10 s，③60℃20 s，④70℃1 s，重復步驟②、③、④總共40個循環(部分基因的延伸溫度和讀數溫度有所改變)，70℃時采集熒光數據。同時以U6基因作為內參基因。基因表達相對值的計算采用2-ΔΔct法。
3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行處理。實驗數據用均數±標準差表示，實驗組與對照組間比較用兩樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05，P值＜0.05為差異有統計學意義。
結果
1 氯化鋰-匹羅卡品處理對動物行為學的影響
本實驗中正常對照SD大鼠6只；LiCl-Pilo致癇SD大鼠50只，40只達RacineⅣ-Ⅴ級標準并成為SE；SE后10只因抽搐致死。SE后1 d 6只被處死，斷頭取腦、留取標本；余24只在終止SE發作1～3 d后進入靜止期；靜止期內，2只因不能進食于數天后衰竭死亡；SE后7 d時6只處死，斷頭取腦、留取標本；SE后14 d時6只處死，斷頭取腦、留取標本；存活到SE 28 d后有10只，6只出現自發性癲癇發作，發作呈前肢陣攣或四肢強直-陣攣，持續時間短暫，約數秒至數十秒，發作次數不等。本實驗共40只大鼠達RacineⅣ-Ⅴ級標準并成為SE，SE誘發成功率80%；在存活至SE 28 d后(慢性期)10只大鼠中，6只大鼠出現自發性癲癇發作，發生率為60%。
2 miR-124a在癲癇發生中表達水平的動態改變
取癲癇發生中，SE后1、7、14和28 d為主要時間點，觀察miR-124a在上述時間點中海馬組織內的表達改變：①在SE后1d，miR-124a的表達水平略微升高，但與正常對照組相比，無統計學差異(P＞0.05)；②SE后7、14、28d，miR-124a的表達水平出現明顯下降趨勢，且與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖 1。
圖1
癲癇發生中miR-124a表達水平的動態變化
注: Control：對照組；SE 1、7、14、28 d：SE后1、7、14、28 d各實驗組*：實驗組和對照組有統計學意義(
miR-9在癲癇發生中表達水平的動態改變
取癲癇發生中，SE后1、7、14和28 d為主要時間點，觀察miR-9在上述時間點中海馬組織內的表達改變：在SE后1、7、14和28 d各時間點上，miR-9的表達水平出現明顯上升趨勢，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖 2。
圖2
癲癇發生中miR-9表達水平的動態變化
注: Control：對照組；SE 1、7、14、28d：SE后1、7、14、28 d各實驗組*：示實驗組和對照組有統計學意義(
討論
包括人類在內所有哺乳類動物的海馬結構中都終生存在神經發生過程。在生理狀態下，它與生物個體的學習記憶密切相關。在疾病狀態下，海馬硬化與癲癇發生發展關系密切[17]，而其中海馬神經再生參與了癲癇異常神經網絡形成等疾病發生過程。海馬神經發生對病理性刺激較敏感，SE后可導致海馬神經發生出現質和量的改變，海馬神經發生增加，新生神經元遷移至異位區域，如門區和齒狀回分子層，通過軸突導向分子(如Robo家族)的引導作用[18]，在海馬異常環路形成、癲癇發生機制中具有重要作用；同時在慢性自發性癲癇形成后，海馬神經發生亦可減少，并伴隨學習記憶減退和抑郁癥狀。
目前學界已明確多種miRNAs參與了腦的正常發育過程，在神經發育和再生中發揮了重要的轉錄后負向調控作用，其中就包括兩種在腦內特異性表達的中樞神經系統miRNAs——miR-124a和miR-9。體外研究發現，miR-124a和miR-9的表達水平在從神經前體細胞向神經元分化進程中呈明顯上升趨勢，上調這兩種miRNAs表達可促進向神經元分化[19]。功能獲得性與缺失性研究結果也表明，miR-124a與miR-9可影響神經細胞系分化，其主要作用在于調控了轉錄STAT-3通路的信號轉導子與活化子[17]。miR-9作用于神經元限制性沉默因子RE-1沉默轉錄因子(NRSF/REST)，后者為一種能廣泛抑制轉錄的抑制子，在亨廷頓病(Huntington’s disease, HD)中miR-9表達下調、REST表達上調，神經元基因的正常表達下調，導致神經遺傳病的發生。miR-9還可以調控Tlx基因的表達水平，后者為一種調控NSCs增殖和更新的重要基因[20]，在神經再生中具有重要調控作用。miR-124a調控神經細胞分化、維持神經細胞特性，與3條神經細胞分化通路有關：①miR-124a有拮抗REST功能的作用，而后者為一種抑制神經元基因表達的因子；②miR-124a直接作用于多嘧啶結合蛋白(PTBP-1)mRNA，后者為一種具有選擇性剪切前體mRNA的廣泛性抑制子；③miR-124a的靶基因還包括一種轉錄調節子Sox-9，為一種與神經元分化密切相關的調節因子，受miR-124a負向調控，產生相應生物學效應[15]。上述機制為miR-124a依賴特定功能參與神經發育進程奠定了基礎。
在本研究中我們應用LiCl-Pilo致癇大鼠模型，初步探討了神經生長分化相關miR-124a和miR-9在SE后1、7、14和28 d各時間點上的表達情況，明確了其在海馬腦組織內癲癇發生中的表達動態改變。miR-9表達在癲癇發生中各時點上呈明顯增高趨勢，雖然在SE后7d的表達增高呈現波動，可能與本實驗中生物個體差異或樣本量有關，亦不排除miR-9表達水平確實在SE后7d較1d有所下降，但miR-9表達水平在SE后癲癇發生中的總體上調趨勢明顯，提示miR-9很可能參與了SE后海馬區域內活躍的NSCs增殖、分化和神經再生過程，其機制可能與癲癇病理狀態下REST、Tlx等基因的表達改變或失衡有關。miR-124a表達在癲癇發生中各時點上呈明顯下調改變，且這一趨勢隨研究時點延長而愈加顯著。目前尚不明確miR-124a的表達下調改變在癲癇發生中具有何種作用，國內外迄今也缺乏相關報道。我們推測miR-124a下調可能與SE后海馬內NSCs增殖異常活躍有關；如NSCs分化增強、則其增殖程度和能力下降，而SE后海馬內NSCs首先需要不斷增殖、遷徙，繼而再分化、形成異常神經元突觸聯系，構成慢性癲癇發生基礎；因此單一調控NSCs分化的表觀遺傳學因素如miR-124a等可能會出現下調變化，以適應癲癇發生機制中NSCs增殖的需要，而兼具調控NSCs增殖、分化的表觀遺傳學因子如miR-9等可能因其功能特點出現上調改變，并在疾病發病機制中發揮其相應作用。當然，眾多miRNAs共同參與了神經發育和癲癇疾病的發生，并以其功能為基礎，形成了龐大的基因調控網絡。目前仍不清楚是否一種miRNA即可產生如此強大的基因調控效應，還是需多種miRNAs共同參與發揮綜合生物學效應而達到目的。與神經生長分化相關miRNAs在癲癇發生中的具體調控和作用機制，有待今后進一步設計動物和細胞實驗深入闡明。同時隨著基因測序、蛋白組學技術和系統生物學的發展，有望為神經生長分化相關miRNAs參與癲癇發生的分子調控研究提供更好的策略和手段。
海馬神經再生是顳葉癲癇病理生理機制中的重要組成部分[1-3]。神經發生是神經干細胞(Neural stem cells, NSCs)分化形成新生神經元的過程，雖然大多數神經發生在初始階段就已完成，但大腦中部分區域終生存在神經發生過程，最重要的就包括海馬齒狀回(Dentate gyrus, DG)等[4, 5]。生理狀態下，海馬NSCs主要分布于齒狀回亞顆粒層(Sub-granular zone, SGZ)，并在此增殖和產生新生神經細胞，其中多數分化為DG顆粒細胞，并遷移至顆粒細胞層(Granule cell layer, GCL)，其樹突延伸至DG分子層，并向DG、CA3區透明層伸出軸突，通過建立特異性傳入和傳出突觸，與功能性海馬環路融合，參與空間記憶的形成[6, 7]。癲癇病理狀態下，海馬神經發生數量異常增加，相當數量的新生神經元異常遷移至齒狀回門區或分子層，參與了海馬異常神經環路形成，在癲癇發生機制中具有重要作用[2]。
MicroRNAs(miRNAs)是一大類長約20~24個核苷酸的小RNA基因，通過負性調控轉錄后的靶基因表達[8]，參與了生物發育、神經分化、細胞增殖、凋亡和脂肪代謝等過程，是與細胞增殖分化、生物發育相關的重要調控因子[9]。miRNAs與癲癇也緊密相關。例如，多項應用癲癇動物模型和芯片篩選技術的研究表明，在癲癇持續狀態(SE)后、顳葉癲癇狀態下的海馬miRNAs表達譜發生變化[10, 11]，而且一些有表達改變的miRNAs(如miR-146a)與臨床癲癇患者海馬組織中相應miRNAs的表達改變呈一致性[12]，提示這些miRNAs可能是SE后神經元凋亡、壞死或癲癇發生的重要調控因子；同時，miRNAs芯片篩選出的、具有差異表達的miRNAs，多與細胞凋亡壞死、炎癥或膠質增生有關，特異性針對上述miRNAs(如miR-132、miR-134、miR-34a)的功能學和機制研究表明，這些miRNAs在SE后神經元壞死、炎癥過程中發揮了重要作用[11, 13, 14]。但迄今為止，miRNAs調控癲癇的表觀遺傳學研究多集中在凋亡、壞死或炎癥相關miRNAs，而神經生長分化相關miRNAs在癲癇發生中表達變化和作用機制的報道甚少。
miR-124a和miR-9是神經生長與分化過程中最重要的miRNAs。miR-124a呈神經系統特異性、于腦組織中豐富表達，其核苷酸序列在物種間具高保守性。現有研究表明，miR-124a在發育中大腦或成人側腦室周圍區域中可調控NSCs和促進神經發生，可能與其下調轉錄因子Sox9活性、促進NSCs分化和成熟有關[15]。但目前國內外尚無報道，miR-124a在SE后海馬重構中是否也能夠調控和促進神經再生。與miR-124a有類似特點的還有miR-9，其不僅能調控神經分化，還具有促進NSCs增殖的重要作用。如已有研究提示，miR-9在胚胎期發育和成人海馬再生中具有調控NSCs增殖、分化、遷徙和促進神經再生的作用[16]。但迄今仍缺乏miR-9是否在SE后海馬中調控和促進神經再生和網絡重塑的研究。
因此，本研究擬以miRNAs可能參與了癲癇形成中海馬神經再生為出發點，通過建立大鼠癲癇模型、模擬癲癇的發生過程，獲取各相應時間點大鼠海馬標本，應用熒光定量qPCR檢測神經生長分化相關miR-124a和miR-9在癲癇發生中表達水平的動態改變，首次證實其在癲癇發生中海馬內的表達變化，為進一步研究和闡述上述miRNAs參與調控癲癇的表觀遺傳學機制奠定基礎。
材料與方法
1 材料
1.1 實驗動物與分組
6～8周健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(220±30) g，56只；由中南大學實驗動物學部提供。置于室溫18～25℃、相對濕度50%～60%、人工12 h晝/夜循環照明的環境中分籠飼養。大鼠可自由攝食和飲水。每日定時清洗籠舍。采用隨機數字表法，將大鼠隨機分到實驗組(n=50)與對照組(n=6)。實驗組又分為癲癇持續狀態(SE)后4個亞組：1、7、14、28 d組(慢性癲癇)。實驗組造模后，采用Racine’s評分標準，達到Ⅳ級或以上發作者，為致癇成功大鼠；未達該標準者舍棄；對成功存活至慢性期、并出現自發性癲癇發作為慢性癲癇大鼠。對實驗組中每個亞組，擬隨機選取6只大鼠入組，與對照組6只大鼠保持一致。
1.2 主要試劑和儀器
匹羅卡品(Pilocarpine)、氯化鋰(Lithium)購自美國Sigma公司；10%水合氯醛、生理鹽水購自中南大學湘雅醫院藥劑科；MiRNA primers購自廣州銳博生物科技有限公司(Ribo-Bio Co.Ltd)；miRNAs qPCR Quantitation Kit、逆轉錄酶(M-MLV RT)、RNase酶抑制劑購自美國Fermentas公司；RNA提取物Trizol、熒光染料Sybr Green I(Lot no. 30033W)購自美國Invitrogen公司。使用ABI Mx3000P QPCR儀產自美國Stratagene公司。
2 實驗方法
2.1 制備氯化鋰-匹羅卡品大鼠癲癇模型
實驗組大鼠腹腔注射氯化鋰(LiCl，125 mg/kg)，18~20 h后腹腔注射匹羅卡品(Pilo，20 mg/kg)，Pilo和LiCl均用無菌生理鹽水新鮮配制。注射Pilo后觀察大鼠的行為變化，癇性發作程度按Racine’s標準分級。達到RacineⅣ-Ⅴ級的SE大鼠，為致癇成功組；若無發作、或發作未達RacineⅣ-Ⅴ級，繼續注射Pilo 10 mg/(kg·次)，可重復6次，在此期間發作程度可達RacineⅣ-Ⅴ級者也歸為致癇成功組；未達標準者舍棄。SE需持續60 min，后予以10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射以終止發作。對照組大鼠給予等量生理鹽水，觀察行為學變化，每日觀察時間為晨8~20點。在慢性癲癇發作期間，觀察和視頻記錄大鼠自發性癲癇發作的情況。
2.2 標本采集
取各實驗組大鼠，10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉后，斷頭取腦。在生理鹽水冰面上，鈍性分離雙側海馬組織，存儲于進口Corning凍存管、并在液氮罐中以-180℃保存。對照組大鼠海馬組織標本同樣按照上述方法采集和保存。
2.3 RNA抽提和質量驗證
取大鼠腦組織，放入玻璃研磨器。加入液氮速凍后，研磨成粉狀。按照每100 mg加入1mL Trizol，在研磨器中混勻后，倒入EP管中，顛倒混勻10下，室溫下靜止放置5 min；每1mL Trizol中加入0.2 mL氯仿，在蓋緊好管蓋后，用力搖晃混勻，室溫下靜止放置5 min后，12 000 rpm離心15 min。RNA沉淀：將上層水相轉移至新1.5mL EP管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻后，室溫放置5 min，以12 000 rpm離心10 min。RNA洗脫：小心倒去上清，并留取沉淀。加1 mL 75%的乙醇(預冷)，振蕩洗滌RNA沉淀一次后，以7 500 rpm離心5 min。RNA再溶解：小心倒去上清后，取沉淀放置于超凈工作臺，開風機吹干(30 min，直至RNA沉淀透明)。然后在管中加入20μL DEPC水溶解，并在55~60℃下，孵育10 min助熔。加樣過程：PCR Marker：1μL Marker、1μL Loading Buffer、4μL TAE，混勻于塑料膜上，并加入孔中；PCR樣品：5μL樣品RNA、1μL Loading Buffer，混勻后依次加樣、電泳、紫外燈檢測。
2.4 cDNA第一鏈合成
合成cDNA第一鏈逆轉錄反應體系為25μL；首先在RNase free的離心管中加入2μg的總RNA和美國Fermentas公司提供的miR-RT primers 2μL，再加入DEPC水至總體積11μL；混勻，4℃短暫離心，70℃水浴10 min后，用冰浴冷卻2 min；短暫離心后，依次加入5×Buffer 5μL，10 mM dNTPs 0.5μL，RNaseA抑制劑1μL，M-MLV逆轉錄酶0.5μL，ddH2O 7μL，共25μL；混勻、短暫離心后，42℃反應60 min后，70℃水浴10 min使酶失活，即得cDNA第一鏈。
2.5 實時定量PCR(qPCR)
選定需驗證的miRNAs行熒光定量PCR檢測；內參miRNA選擇U6。所有引物均由廣州銳博生物科技有限公司設計合成。實時熒光定量PCR采用Hairpin-itTM miRNAs qPCR Quantitation Kit(Catalog No.QPM-010)，熒光染料為Sybr Green I (Invitrogen；Lot no. 30033W)，在Mx3000P qPCR System(Stratagene，US)儀器上完成。qPCR反應體系如下：其中1×Realtime PCR Buffer包含3 mM Mg2+、0.2 mM dNTP和SYBR Green，MiR Forward Primer與MiR Reverse Primer包括qPCR正反引物。反應體系：MiR Forward Primer(5μΜ)2μL；MiR Reverse Primer(5μΜ)2μL；Sybr Green I 9μL；MiRNA RT Product 2μL；ddH2O 5μL；加至總體積20μL。qPCR條件包括：①95℃20 s，②95℃10 s，③60℃20 s，④70℃1 s，重復步驟②、③、④總共40個循環(部分基因的延伸溫度和讀數溫度有所改變)，70℃時采集熒光數據。同時以U6基因作為內參基因。基因表達相對值的計算采用2-ΔΔct法。
3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行處理。實驗數據用均數±標準差表示，實驗組與對照組間比較用兩樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05，P值＜0.05為差異有統計學意義。
結果
1 氯化鋰-匹羅卡品處理對動物行為學的影響
本實驗中正常對照SD大鼠6只；LiCl-Pilo致癇SD大鼠50只，40只達RacineⅣ-Ⅴ級標準并成為SE；SE后10只因抽搐致死。SE后1 d 6只被處死，斷頭取腦、留取標本；余24只在終止SE發作1～3 d后進入靜止期；靜止期內，2只因不能進食于數天后衰竭死亡；SE后7 d時6只處死，斷頭取腦、留取標本；SE后14 d時6只處死，斷頭取腦、留取標本；存活到SE 28 d后有10只，6只出現自發性癲癇發作，發作呈前肢陣攣或四肢強直-陣攣，持續時間短暫，約數秒至數十秒，發作次數不等。本實驗共40只大鼠達RacineⅣ-Ⅴ級標準并成為SE，SE誘發成功率80%；在存活至SE 28 d后(慢性期)10只大鼠中，6只大鼠出現自發性癲癇發作，發生率為60%。
2 miR-124a在癲癇發生中表達水平的動態改變
取癲癇發生中，SE后1、7、14和28 d為主要時間點，觀察miR-124a在上述時間點中海馬組織內的表達改變：①在SE后1d，miR-124a的表達水平略微升高，但與正常對照組相比，無統計學差異(P＞0.05)；②SE后7、14、28d，miR-124a的表達水平出現明顯下降趨勢，且與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖 1。
圖1
癲癇發生中miR-124a表達水平的動態變化
注: Control：對照組；SE 1、7、14、28 d：SE后1、7、14、28 d各實驗組*：實驗組和對照組有統計學意義(
miR-9在癲癇發生中表達水平的動態改變
取癲癇發生中，SE后1、7、14和28 d為主要時間點，觀察miR-9在上述時間點中海馬組織內的表達改變：在SE后1、7、14和28 d各時間點上，miR-9的表達水平出現明顯上升趨勢，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖 2。
圖2
癲癇發生中miR-9表達水平的動態變化
注: Control：對照組；SE 1、7、14、28d：SE后1、7、14、28 d各實驗組*：示實驗組和對照組有統計學意義(
討論
包括人類在內所有哺乳類動物的海馬結構中都終生存在神經發生過程。在生理狀態下，它與生物個體的學習記憶密切相關。在疾病狀態下，海馬硬化與癲癇發生發展關系密切[17]，而其中海馬神經再生參與了癲癇異常神經網絡形成等疾病發生過程。海馬神經發生對病理性刺激較敏感，SE后可導致海馬神經發生出現質和量的改變，海馬神經發生增加，新生神經元遷移至異位區域，如門區和齒狀回分子層，通過軸突導向分子(如Robo家族)的引導作用[18]，在海馬異常環路形成、癲癇發生機制中具有重要作用；同時在慢性自發性癲癇形成后，海馬神經發生亦可減少，并伴隨學習記憶減退和抑郁癥狀。
目前學界已明確多種miRNAs參與了腦的正常發育過程，在神經發育和再生中發揮了重要的轉錄后負向調控作用，其中就包括兩種在腦內特異性表達的中樞神經系統miRNAs——miR-124a和miR-9。體外研究發現，miR-124a和miR-9的表達水平在從神經前體細胞向神經元分化進程中呈明顯上升趨勢，上調這兩種miRNAs表達可促進向神經元分化[19]。功能獲得性與缺失性研究結果也表明，miR-124a與miR-9可影響神經細胞系分化，其主要作用在于調控了轉錄STAT-3通路的信號轉導子與活化子[17]。miR-9作用于神經元限制性沉默因子RE-1沉默轉錄因子(NRSF/REST)，后者為一種能廣泛抑制轉錄的抑制子，在亨廷頓病(Huntington’s disease, HD)中miR-9表達下調、REST表達上調，神經元基因的正常表達下調，導致神經遺傳病的發生。miR-9還可以調控Tlx基因的表達水平，后者為一種調控NSCs增殖和更新的重要基因[20]，在神經再生中具有重要調控作用。miR-124a調控神經細胞分化、維持神經細胞特性，與3條神經細胞分化通路有關：①miR-124a有拮抗REST功能的作用，而后者為一種抑制神經元基因表達的因子；②miR-124a直接作用于多嘧啶結合蛋白(PTBP-1)mRNA，后者為一種具有選擇性剪切前體mRNA的廣泛性抑制子；③miR-124a的靶基因還包括一種轉錄調節子Sox-9，為一種與神經元分化密切相關的調節因子，受miR-124a負向調控，產生相應生物學效應[15]。上述機制為miR-124a依賴特定功能參與神經發育進程奠定了基礎。
在本研究中我們應用LiCl-Pilo致癇大鼠模型，初步探討了神經生長分化相關miR-124a和miR-9在SE后1、7、14和28 d各時間點上的表達情況，明確了其在海馬腦組織內癲癇發生中的表達動態改變。miR-9表達在癲癇發生中各時點上呈明顯增高趨勢，雖然在SE后7d的表達增高呈現波動，可能與本實驗中生物個體差異或樣本量有關，亦不排除miR-9表達水平確實在SE后7d較1d有所下降，但miR-9表達水平在SE后癲癇發生中的總體上調趨勢明顯，提示miR-9很可能參與了SE后海馬區域內活躍的NSCs增殖、分化和神經再生過程，其機制可能與癲癇病理狀態下REST、Tlx等基因的表達改變或失衡有關。miR-124a表達在癲癇發生中各時點上呈明顯下調改變，且這一趨勢隨研究時點延長而愈加顯著。目前尚不明確miR-124a的表達下調改變在癲癇發生中具有何種作用，國內外迄今也缺乏相關報道。我們推測miR-124a下調可能與SE后海馬內NSCs增殖異常活躍有關；如NSCs分化增強、則其增殖程度和能力下降，而SE后海馬內NSCs首先需要不斷增殖、遷徙，繼而再分化、形成異常神經元突觸聯系，構成慢性癲癇發生基礎；因此單一調控NSCs分化的表觀遺傳學因素如miR-124a等可能會出現下調變化，以適應癲癇發生機制中NSCs增殖的需要，而兼具調控NSCs增殖、分化的表觀遺傳學因子如miR-9等可能因其功能特點出現上調改變，并在疾病發病機制中發揮其相應作用。當然，眾多miRNAs共同參與了神經發育和癲癇疾病的發生，并以其功能為基礎，形成了龐大的基因調控網絡。目前仍不清楚是否一種miRNA即可產生如此強大的基因調控效應，還是需多種miRNAs共同參與發揮綜合生物學效應而達到目的。與神經生長分化相關miRNAs在癲癇發生中的具體調控和作用機制，有待今后進一步設計動物和細胞實驗深入闡明。同時隨著基因測序、蛋白組學技術和系統生物學的發展，有望為神經生長分化相關miRNAs參與癲癇發生的分子調控研究提供更好的策略和手段。
