引用本文： 蘇彧, 郝衛成, 劉聰喜, 趙永雄, 劉玉璽. 不同劑量不同來源拉莫三嗪對電刺激大鼠皮層驚厥閾值模型藥效與時效的比較研究. 癲癇雜志, 2016, 2(2): 118-122. doi: 10.7507/2096-0247.20160022 復制
癲癇是神經系統常見的疾病之一，是由于腦內神經元過度同步異常放電所致，其特點是反復發作性的中樞神經系統功能失調。我國目前有癲癇患者600～900萬，大部分癲癇患者目前主要的治療方法為藥物控制發作，包括傳統抗癲癇藥物和新型抗癲癇藥物。 拉莫三嗪(Lamotrigine，LTG)是一種新型抗癲癇藥物，1992年被美國批準用于治療癲癇部分性發作，1998年進入國內醫療市場。2006年國內研制合成了國產的LTG，目前已用于臨床。本研究的目的在于：利用電刺激大鼠皮層驚厥閾值模型，比較國產與進口的LTG在對抗電刺激皮層驚厥閾值的藥效與時效方面有無差異。現將實驗資料總結如下。
材料與方法
1 材料
1.1 實驗動物
選用健康雌性SD大鼠40只,體重200～220 g；單籠喂養,自由攝食與飲水。大鼠由山西醫科大學實驗動物中心提供。
1.2 主要藥品與試劑
國產LTG(由三金集團湖南制藥股份有限公司生產)，每片25 mg；進口LTG(由葛蘭素史克公司生產)，每片50 mg；卡馬西平片(上海辛帕斯制藥公司生產，每片100 mg)。
1.3 主要儀器
驚厥閾值測定儀(太原理工大學與山西醫科大學共同研制)，刺激參數[1, 2]:強度在15 s內從0增大至2 000 μA的電流，波寬2 ms,波形為單相斜坡梯形雙極脈沖。見圖 1、2。雙極不銹鋼皮層電極，電極連接器(太原理工大學制造)。
圖1
驚厥閾值測定儀。大鼠在沒有電刺激時其顯示屏的數值為0 μA
Figure1.
Convulsive threshold detector: the value of its display was 0μA when there’s no electrical stimulation in rats
圖2
電刺激大鼠出現全面性發作時其顯示屏出現614 μA，此數值即為該大鼠本次測定的驚厥閾值
Figure2.
Generalized seizure appeared in rat after electrical stimulation and the detector display the convulsive threshold value 614 μA
2 實驗方法
2.1 電刺激大鼠皮層驚厥閾值模型制作與測定
將動物用20%烏拉坦900 mg/kg腹腔給藥麻醉后固定于立體定向儀上。按Voskuy[3, 4]的方法,在額頂部皮層運動區上方的頭骨鉆孔,安放不銹鋼電極,用牙科水泥封固,術畢保溫。恢復1周后用驚厥閾值測定儀給予刺激。在不給予任何電刺激時，驚厥閾值測定儀顯示數值為0 μA，見圖 1。當大鼠產生前肢和/或面部肌肉痙攣時的電流強度為局限性發作的驚厥閾值(Threshold of localized seizure,TLS)，本實驗的所有數據以大鼠出現TLS作為指標；出現TLS后繼續電刺激，大鼠會產生更明顯的前肢、頭部及軀體的陣攣抽搐，當陣攣活動更加劇烈，可出現全身突然翻倒時的電流強度為全面性發作的驚厥閾值(Threshold of generalized seizure,TGS)，見圖 2。每天刺激兩次，均刺激出現TGS,連續8周,大鼠病理性驚厥閾值模型穩定[1]，即可用于本次藥物實驗。
2.2 實驗動物分組
將已穩定電刺激皮層驚厥閾值模型的40只大鼠隨機分為A、B、C、D 4個實驗組，A、B實驗組按照給藥劑量又分為3個不同劑量組。即：① 國產LTG組(A實驗組)，分別為12.5、25、37.5 mg/(kg·d)劑量組，每組5只； ② 進口LTG組(B實驗組，劑量同A實驗組)，每組5只；③ 中劑量卡馬西平組(C實驗組)為72 mg/(kg·d)，共5只；④ 生理鹽水對照組(D對照組)，共5只，實驗時僅給予生理鹽水2 mL灌胃。各組動物的給藥劑量參考已有文獻[1, 2, 5-7]。
2.3 給藥方法
2.3.1 單次給藥測定
實驗前夜大鼠空腹,給藥前測定3次基礎TLS驚厥閾值，取其均值為藥前驚厥閾值的參考值；給藥后30 min，1、2、3、5、7、9、11和12 h分別測其驚厥閾值,每個時間點測兩次,每間隔5 min刺激1次,取其平均閾值作為用藥后閾值。
2.3.2 重復給藥測定
單次給藥測定后動物休息1周，然后將各實驗藥的中劑量進行重復給藥實驗。原單次給藥的動物仍服用原來的藥物,早晚各1次灌胃(8:00與20:00),連續8次,共4 d，第5天晨開始實驗，取其平均閾值作為用藥后閾值。
3 統計學方法
3.1 數據收集
電刺激時動物的驚厥表現與刺激儀刺激時顯示的驚厥閾值通過兩臺攝像機監控記錄，記錄的實驗內容與電腦連接，實驗時動物被刺激時的表現與其顯示的驚厥閾值可做重復分析，能準確地記錄并解讀其驚厥閾值。每次電刺激所獲得的驚厥閾值均可以由電腦視頻回放其驚厥表現及閾值的數字，供實驗人員反復確認其結果，根據所獲得的驚厥閾值差(給藥后閾值-基礎閾值)比較各組間的藥效。
3.2 統計分析
本實驗所有數據，均將大鼠出現TLS發作時的驚厥閾值作為采集指標，以給藥后的驚厥閾值與基礎閾值的差值作為藥物間的比較指標。利用 SPSS統計學軟件17.0進行統計處理，實驗數據以均值±標準差描述，采用重復測量方差分析，參數間相互關系采用相關分析方法；P值＜0.05為差異有統計學意義。
結 果
1 A、B組與D組給藥后的藥效與時效
單次灌胃給藥的A、B實驗組的動物，3個劑量組給藥后的整個過程全部存活，給藥后動物行為安靜，對疼痛刺激(夾尾巴)仍敏感，未見行走不穩、嘔吐等癥狀。A、B兩實驗組相同劑量之間藥效統計分析比較，t值范圍0.09～0.512，P＞0.05,無統計學差異；兩實驗組不同劑量組之間比較，并分別與D組比較t值范圍9.738～11.976，P＜0.05，有統計學差異。A組和B組的LTG，其低、中、高3個劑量組給藥后均提高了電刺激皮層驚厥閾值；3個劑量組有3種不同的效果，存在劑量依賴關系；給藥后的起效時間約為1 h，達峰時間為3 h，維持時間約10 h；D組的閾值隨時間的波動在25 μA以內。見表 1和圖 3、4。
表1
A、B、D組在單次給藥后不同時段驚厥閾值的變化(
圖3
A組不同劑量單次給藥后與D組不同時間點TLS差值變化
Figure3.
TLS changes in different times after administration by different doses of domestic LTG
圖4
B組不同劑量單次給藥后與D組不同時間點TLS差值變化
Figure4.
TLS changes in different times after administration by different doses of imported LTG
2 各實驗組與對照組重復4 d給藥后的藥效與時效
A實驗組中劑量[25 mg/(kg·d)]、B實驗組中劑量[25 mg/(kg·d)]與C實驗組中劑量[72 mg/(kg·d)]及D組(2 mL/次)重復給藥4 d，動物全部存活，未觀察到明顯不思飲食、行走不穩、嘔吐等明顯不良反應。3組藥效統計分析結果分析，t值范圍0.11～0.531，P＞0.05，抗驚厥效果均無統計學差異；與D組比較t值范圍9.534～10.625，P＜0.05，有統計學差異。重復給藥后曲線相對平穩，說明藥物在4 d后達到了穩態的血藥濃度。見表 2和圖 5。
表2
中劑量A、B、C組與D組重復給藥后不同時點局灶性發作閾值(
圖5
各組重復給藥后其TLS的差值變化
Figure5.
TSL changes after repeated administration by domestic LTG, imported LTG, Cabamazepine and normal saline
討 論
LTG為苯基三嗪類，化學名為6-(2，3-二氯苯基)-1，2，4-三嗪-3，5-二 胺,由英國GlaxoSmithKline公司研制，1994年首次在澳大利亞上市。10多年來，該藥已廣泛應用于眾多的癲癇患者，其高效、廣譜和低毒副反應已有大量的文獻報道[8-10]。LTG 具有廣譜的抗癲癇作用，與其他藥物之間相互作用少，有良好藥代動力學特征，蛋白結合率不高，生物利用度高，有良好的耐受性與安全性，且不會產生明顯的酶誘導和抑制作用，已廣泛應用于臨床治療多種類型癲癇發作[11-13]。
目前已確診的癲癇患者需要長期服藥維持治療，控制發作，但受多方面因素的影響，我國仍有部分癲癇患者在服用第一代抗癲癇藥物。LTG屬于進口類新型抗癲癇藥物，由于價格相對昂貴，在一定程度制約了其在我國一些資源欠發達地區癲癇患者的應用。2006年，我國已能自主研發并合成LTG[9]，該藥已被國家食品藥品管理局批準，成功向全國推廣應用。為了明確不同來源的LTG在藥效與時效方面是否有差異，我們設計了此次試驗。
本實驗所用的電刺激大鼠驚厥模型，是將雙極電極埋置于大鼠運動皮層，大鼠在電刺激時出現抽搐等一系列類似人類癲癇的表現[14]，而這一表現會被視頻同步記錄。實驗人員通過視頻采集可以反復觀看動物被電刺激后的驚厥表現，也可以通過驚厥刺激儀顯示屏的數值表，來記錄能引起大鼠驚厥動作時的具體電流值。AED對這種驚厥模型是否有效，效果有多少，不僅可以從定性方面評判，也可以通過升高動物驚厥閾值的具體數值來進行解讀，并能準確測定抗癲癇效果的強弱與維持時間，故該實驗儀器和方法是測定藥物效果與時間的可靠方法[2, 14]。該模型是用弱電流刺激大鼠一側的運動皮層，引起大鼠出現部分運動性驚厥發作，類似臨床的局灶型或簡單部分運動性癲癇發作，治療此類發作最經典的藥物為卡馬西平，所以本實驗用其作為陽性對照[2]，比較LTG的藥效是合理的。
單次給藥后，A、B組在給藥后1～2 h其藥效上升，在3 h達到高峰，之后逐漸下降，但在高劑量組12 h仍有藥效；兩組LTG存在劑量依賴，隨著劑量的增大，藥效也加強。在重復給藥后，藥效比較平穩，波動相對緩和；A、B兩實驗組中等劑量與C組在藥效方面比較無統計學差異(P＞0.05)。提示不同來源的LTG的藥效與時效相同，其抗驚厥值與傳統的卡馬西平亦無差異。
本實驗不能觀察到動物LTG用藥后的副反應，實驗所給動物的藥物劑量是按照人與大鼠的體表面積換算而來，不能從實驗角度明確AED對于動物在不出現明顯不良反應的情況下，更加準確的安全劑量。尤其是LTG皮疹，臨床常見發生，該實驗無法觀察，這些將有待在今后的研究中予以解決。
癲癇是神經系統常見的疾病之一，是由于腦內神經元過度同步異常放電所致，其特點是反復發作性的中樞神經系統功能失調。我國目前有癲癇患者600～900萬，大部分癲癇患者目前主要的治療方法為藥物控制發作，包括傳統抗癲癇藥物和新型抗癲癇藥物。 拉莫三嗪(Lamotrigine，LTG)是一種新型抗癲癇藥物，1992年被美國批準用于治療癲癇部分性發作，1998年進入國內醫療市場。2006年國內研制合成了國產的LTG，目前已用于臨床。本研究的目的在于：利用電刺激大鼠皮層驚厥閾值模型，比較國產與進口的LTG在對抗電刺激皮層驚厥閾值的藥效與時效方面有無差異。現將實驗資料總結如下。
材料與方法
1 材料
1.1 實驗動物
選用健康雌性SD大鼠40只,體重200～220 g；單籠喂養,自由攝食與飲水。大鼠由山西醫科大學實驗動物中心提供。
1.2 主要藥品與試劑
國產LTG(由三金集團湖南制藥股份有限公司生產)，每片25 mg；進口LTG(由葛蘭素史克公司生產)，每片50 mg；卡馬西平片(上海辛帕斯制藥公司生產，每片100 mg)。
1.3 主要儀器
驚厥閾值測定儀(太原理工大學與山西醫科大學共同研制)，刺激參數[1, 2]:強度在15 s內從0增大至2 000 μA的電流，波寬2 ms,波形為單相斜坡梯形雙極脈沖。見圖 1、2。雙極不銹鋼皮層電極，電極連接器(太原理工大學制造)。
圖1
驚厥閾值測定儀。大鼠在沒有電刺激時其顯示屏的數值為0 μA
Figure1.
Convulsive threshold detector: the value of its display was 0μA when there’s no electrical stimulation in rats
圖2
電刺激大鼠出現全面性發作時其顯示屏出現614 μA，此數值即為該大鼠本次測定的驚厥閾值
Figure2.
Generalized seizure appeared in rat after electrical stimulation and the detector display the convulsive threshold value 614 μA
2 實驗方法
2.1 電刺激大鼠皮層驚厥閾值模型制作與測定
將動物用20%烏拉坦900 mg/kg腹腔給藥麻醉后固定于立體定向儀上。按Voskuy[3, 4]的方法,在額頂部皮層運動區上方的頭骨鉆孔,安放不銹鋼電極,用牙科水泥封固,術畢保溫。恢復1周后用驚厥閾值測定儀給予刺激。在不給予任何電刺激時，驚厥閾值測定儀顯示數值為0 μA，見圖 1。當大鼠產生前肢和/或面部肌肉痙攣時的電流強度為局限性發作的驚厥閾值(Threshold of localized seizure,TLS)，本實驗的所有數據以大鼠出現TLS作為指標；出現TLS后繼續電刺激，大鼠會產生更明顯的前肢、頭部及軀體的陣攣抽搐，當陣攣活動更加劇烈，可出現全身突然翻倒時的電流強度為全面性發作的驚厥閾值(Threshold of generalized seizure,TGS)，見圖 2。每天刺激兩次，均刺激出現TGS,連續8周,大鼠病理性驚厥閾值模型穩定[1]，即可用于本次藥物實驗。
2.2 實驗動物分組
將已穩定電刺激皮層驚厥閾值模型的40只大鼠隨機分為A、B、C、D 4個實驗組，A、B實驗組按照給藥劑量又分為3個不同劑量組。即：① 國產LTG組(A實驗組)，分別為12.5、25、37.5 mg/(kg·d)劑量組，每組5只； ② 進口LTG組(B實驗組，劑量同A實驗組)，每組5只；③ 中劑量卡馬西平組(C實驗組)為72 mg/(kg·d)，共5只；④ 生理鹽水對照組(D對照組)，共5只，實驗時僅給予生理鹽水2 mL灌胃。各組動物的給藥劑量參考已有文獻[1, 2, 5-7]。
2.3 給藥方法
2.3.1 單次給藥測定
實驗前夜大鼠空腹,給藥前測定3次基礎TLS驚厥閾值，取其均值為藥前驚厥閾值的參考值；給藥后30 min，1、2、3、5、7、9、11和12 h分別測其驚厥閾值,每個時間點測兩次,每間隔5 min刺激1次,取其平均閾值作為用藥后閾值。
2.3.2 重復給藥測定
單次給藥測定后動物休息1周，然后將各實驗藥的中劑量進行重復給藥實驗。原單次給藥的動物仍服用原來的藥物,早晚各1次灌胃(8:00與20:00),連續8次,共4 d，第5天晨開始實驗，取其平均閾值作為用藥后閾值。
3 統計學方法
3.1 數據收集
電刺激時動物的驚厥表現與刺激儀刺激時顯示的驚厥閾值通過兩臺攝像機監控記錄，記錄的實驗內容與電腦連接，實驗時動物被刺激時的表現與其顯示的驚厥閾值可做重復分析，能準確地記錄并解讀其驚厥閾值。每次電刺激所獲得的驚厥閾值均可以由電腦視頻回放其驚厥表現及閾值的數字，供實驗人員反復確認其結果，根據所獲得的驚厥閾值差(給藥后閾值-基礎閾值)比較各組間的藥效。
3.2 統計分析
本實驗所有數據，均將大鼠出現TLS發作時的驚厥閾值作為采集指標，以給藥后的驚厥閾值與基礎閾值的差值作為藥物間的比較指標。利用 SPSS統計學軟件17.0進行統計處理，實驗數據以均值±標準差描述，采用重復測量方差分析，參數間相互關系采用相關分析方法；P值＜0.05為差異有統計學意義。
結 果
1 A、B組與D組給藥后的藥效與時效
單次灌胃給藥的A、B實驗組的動物，3個劑量組給藥后的整個過程全部存活，給藥后動物行為安靜，對疼痛刺激(夾尾巴)仍敏感，未見行走不穩、嘔吐等癥狀。A、B兩實驗組相同劑量之間藥效統計分析比較，t值范圍0.09～0.512，P＞0.05,無統計學差異；兩實驗組不同劑量組之間比較，并分別與D組比較t值范圍9.738～11.976，P＜0.05，有統計學差異。A組和B組的LTG，其低、中、高3個劑量組給藥后均提高了電刺激皮層驚厥閾值；3個劑量組有3種不同的效果，存在劑量依賴關系；給藥后的起效時間約為1 h，達峰時間為3 h，維持時間約10 h；D組的閾值隨時間的波動在25 μA以內。見表 1和圖 3、4。
表1
A、B、D組在單次給藥后不同時段驚厥閾值的變化(
圖3
A組不同劑量單次給藥后與D組不同時間點TLS差值變化
Figure3.
TLS changes in different times after administration by different doses of domestic LTG
圖4
B組不同劑量單次給藥后與D組不同時間點TLS差值變化
Figure4.
TLS changes in different times after administration by different doses of imported LTG
2 各實驗組與對照組重復4 d給藥后的藥效與時效
A實驗組中劑量[25 mg/(kg·d)]、B實驗組中劑量[25 mg/(kg·d)]與C實驗組中劑量[72 mg/(kg·d)]及D組(2 mL/次)重復給藥4 d，動物全部存活，未觀察到明顯不思飲食、行走不穩、嘔吐等明顯不良反應。3組藥效統計分析結果分析，t值范圍0.11～0.531，P＞0.05，抗驚厥效果均無統計學差異；與D組比較t值范圍9.534～10.625，P＜0.05，有統計學差異。重復給藥后曲線相對平穩，說明藥物在4 d后達到了穩態的血藥濃度。見表 2和圖 5。
表2
中劑量A、B、C組與D組重復給藥后不同時點局灶性發作閾值(
圖5
各組重復給藥后其TLS的差值變化
Figure5.
TSL changes after repeated administration by domestic LTG, imported LTG, Cabamazepine and normal saline
討 論
LTG為苯基三嗪類，化學名為6-(2，3-二氯苯基)-1，2，4-三嗪-3，5-二 胺,由英國GlaxoSmithKline公司研制，1994年首次在澳大利亞上市。10多年來，該藥已廣泛應用于眾多的癲癇患者，其高效、廣譜和低毒副反應已有大量的文獻報道[8-10]。LTG 具有廣譜的抗癲癇作用，與其他藥物之間相互作用少，有良好藥代動力學特征，蛋白結合率不高，生物利用度高，有良好的耐受性與安全性，且不會產生明顯的酶誘導和抑制作用，已廣泛應用于臨床治療多種類型癲癇發作[11-13]。
目前已確診的癲癇患者需要長期服藥維持治療，控制發作，但受多方面因素的影響，我國仍有部分癲癇患者在服用第一代抗癲癇藥物。LTG屬于進口類新型抗癲癇藥物，由于價格相對昂貴，在一定程度制約了其在我國一些資源欠發達地區癲癇患者的應用。2006年，我國已能自主研發并合成LTG[9]，該藥已被國家食品藥品管理局批準，成功向全國推廣應用。為了明確不同來源的LTG在藥效與時效方面是否有差異，我們設計了此次試驗。
本實驗所用的電刺激大鼠驚厥模型，是將雙極電極埋置于大鼠運動皮層，大鼠在電刺激時出現抽搐等一系列類似人類癲癇的表現[14]，而這一表現會被視頻同步記錄。實驗人員通過視頻采集可以反復觀看動物被電刺激后的驚厥表現，也可以通過驚厥刺激儀顯示屏的數值表，來記錄能引起大鼠驚厥動作時的具體電流值。AED對這種驚厥模型是否有效，效果有多少，不僅可以從定性方面評判，也可以通過升高動物驚厥閾值的具體數值來進行解讀，并能準確測定抗癲癇效果的強弱與維持時間，故該實驗儀器和方法是測定藥物效果與時間的可靠方法[2, 14]。該模型是用弱電流刺激大鼠一側的運動皮層，引起大鼠出現部分運動性驚厥發作，類似臨床的局灶型或簡單部分運動性癲癇發作，治療此類發作最經典的藥物為卡馬西平，所以本實驗用其作為陽性對照[2]，比較LTG的藥效是合理的。
單次給藥后，A、B組在給藥后1～2 h其藥效上升，在3 h達到高峰，之后逐漸下降，但在高劑量組12 h仍有藥效；兩組LTG存在劑量依賴，隨著劑量的增大，藥效也加強。在重復給藥后，藥效比較平穩，波動相對緩和；A、B兩實驗組中等劑量與C組在藥效方面比較無統計學差異(P＞0.05)。提示不同來源的LTG的藥效與時效相同，其抗驚厥值與傳統的卡馬西平亦無差異。
本實驗不能觀察到動物LTG用藥后的副反應，實驗所給動物的藥物劑量是按照人與大鼠的體表面積換算而來，不能從實驗角度明確AED對于動物在不出現明顯不良反應的情況下，更加準確的安全劑量。尤其是LTG皮疹，臨床常見發生，該實驗無法觀察，這些將有待在今后的研究中予以解決。
