引用本文： 周藝, 羅朝輝, 賀星惠, 肖波. Robo3在顳葉癲癇大鼠模型中的動態表達研究. 癲癇雜志, 2016, 2(1): 34-37. doi: 10.7507/2096-0247.20160007 復制
癲癇是一種以神經元異常放電為特征的神經系統慢性疾病，而其中顳葉癲癇(Temporal lobe epilepsy, TLE)是常見的發作類型之一，在難治性癲癇中也是最常見的類型。目前關于TLE發生發展機制仍不明確，而探究其發病機制對于治療是至關重要的[1]。病理學研究發現軸突出芽、突觸重建是TLE最主要的病理學特征，而軸突導向分子為軸突出芽和突觸重建提供了導向作用[2]。在突觸形成過程中，許多因子都參與了這一過程，而軸突導向分子在軸突生長，突觸形成等方面有著重要作用。目前發現的軸突導向因子有四大類：Ephrins、Slits、Netrins和Semaphorins。其中Slit主要通過Robo介導對軸突生長的排斥反應參與神經軸突遷移，并且這種相互作用具有高度的遺傳保守性。Fang等[3]對TLE患者腦組織和TLE大鼠進行的研究發現，在TLE患者中，Slit2呈現高表達，且主要表達于神經元和神經膠質細胞，而正常人組織中則主要表達于神經元；而在TLE大鼠模型中發現，Slit2在急性期和靜止期表達逐漸下降，在慢性期表達則明顯上升，故推測Slit2分子與TLE異常神經網絡的形成密切相關。Robo家族(Robo 1~4)為跨膜蛋白，其中Robo1、2、3主要表達于神經系統，由胞外區、跨膜區、胞內區組成，其中胞外區由Ig樣功能區和纖維連接蛋白組成。信號傳遞至神經細胞內之后, 需要激活下游的信號分子發揮調節作用，引起細胞骨架成分的重組和細胞粘連的改變，影響神經元的遷移和神經纖維的生長[4, 5]。相關研究表明，Slit-Robo結合后可以調節細胞內Rho家族鳥苷三磷酸酶(RhoGTPase)的活性，從而調整骨架蛋白和激動蛋白在細胞內的分布，進而引導軸突的生長和神經細胞的遷移[6]。
Robo3是Robo家族中的一員，在中樞神經系統中廣泛表達[7]。本研究通過檢測TLE大鼠模型中Robo3的動態表達及變化規律，以探討其在TLE的發生發展過程的作用。
材料與方法
1 實驗動物與分組
SPF級健康雄性SD大鼠36只，體重230～250 g；由中南大學實驗動物中心提供，并飼養于適宜的環境中，給予正常飼料和飲水。大鼠隨機分為6組(n=6)：1個對照組和5個實驗組，5個實驗組分別采用氯化鋰-匹羅卡品(LiCl-PILO)腹腔注射致癇后1 d(急性期)，7、14 d(靜止期)，30、60 d(慢性期)進行取材；對照組注射等量生理鹽水。所有實驗均嚴格遵照中南大學動物倫理委員會規定進行。
2 動物模型建立
癲癇組大鼠先予LiCl(Sigma，美國)125 mg/kg腹腔注射，18 h再給予匹羅卡品(Pilocarpine, PILO，Sigma，美國)20 mg/kg腹腔注射。按Racine分級，癲癇發作達到Ⅳ級或以上的大鼠視為合格實驗模型。如大鼠發作等級未達Ⅳ級，則每30 min重復腹腔注射PILO 10 mg/kg，總共注射6次之后發作仍未達Ⅳ級則為致癇不成功。當大鼠癲癇發作達Ⅴ級或Ⅳ級以上并持續40 min后，所有大鼠給予10%水合氯醛3 mg/kg腹腔注射終止發作。對照組大鼠注射等量生理鹽水。
3 標本處理
10%水合氯醛3 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，去顱骨，快速取整個腦組織于冰床上，再分離出海馬組織，放入凍存管中，最后放入液氮中速凍后置于-80℃冰箱保存備用。
4 Quantitative RT-PCR檢測mRNA表達水平
用TRIzol(Invitrogen，美國)提取海馬組織總RNA，分光光度計測定波長260、280 nm的吸收值，樣品A260/A280在1.8~2.1為合格。使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(Takara，大連)將RNA逆轉錄成cDNA，GAPDH為內參基因, 兩者的引物設計如下: Robo3上游：5′-TTGGATCGAGCAAGTGAGTG-3′, 下游:5′-GTGGGTT TCCTTTGGTCTCA-3′; GAPDH上游：5′-CTCATGACC ACAGTCCATGC-3′, 下游：5′-TTCAGCTCTGGGATG ACCTT-3′。PCR設定反應條件如下：95℃5min，95℃20 s, 60℃30 s(40個循環)。利用7500 PCR系統軟件對信號進行分析，觀察擴增曲線、溶解曲線，每個實驗樣本重復三次，使用2-ΔΔCt法計算樣本的相對表達值，觀察Robo3 mRNA的表達水平。
5 Western blot檢測蛋白表達水平
將海馬組織至于研缽中，加入RIPA裂解液(普利萊，北京)在冰上搗碎，用BCA法測定蛋白濃度。分別配制10%的分離膠和4%的濃縮膠，將各組變性后的蛋白樣品加至每孔中，開始電泳，濃縮膠電泳電壓為80V，分離膠電泳電壓為120V，待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳。選取β-actin為內參基因。電泳結束后，以300 mA恒流轉膜1.5 h，用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉1 h后加入一抗(Robo3: Proteintech, 美國, 1 :200；β-actin: Proteintech, 美國, 1:4 000)，4℃孵育過夜，孵育結束后用TBST洗3次，每次15 min，再加入HRP標記的二抗(Proteintech, 美國，1 :3 000)，孵育45 min，結束后用TBST洗3次，每次15 min。最后用ECL發光液進行顯色曝光，采用proteinsimple化學發光儀器掃描收集圖像。
6 統計學方法
采用SPSS 20.0軟件包進行統計分析。各實驗組與對照組間所測得數據采用獨立樣本t檢驗方法進行數據分析，組間比較采用One-way ANOVA分析方法進行數據分析，所得結果采用均值±標準差表示，P值< 0.05為差異有統計學意義。
結果
1 動物行為學觀察
對照組大鼠無抽搐等異常表現，實驗組大鼠在腹腔注射PILO后開始出現癲癇樣發作，造模成功的大鼠中有3只大鼠分別在造模后1 d和3 d死亡，死亡率為6.8%。有4只大鼠一直未出現Ⅳ級或Ⅳ級以上發作，造模成功率為86.7%(26/30)。在慢性期的觀察中，有3只大鼠沒有出現自發癇性發作，予以剔除。
2 Quantitative RT-PCR
在對照組中，Robo3-mRNA的表達量較低；與對照組相比，致癇后急性期大鼠海馬中Robo3-mRNA的水平無明顯變化(P > 0.05)，而在致癇后的靜止期和慢性期則逐漸降低，分別為對照組的0.67倍和0.53倍，至慢性期達最低值(P < 0.05)。實驗組各組間的表達量均無統計學差異(P > 0.05)。見圖 1。
圖1
對照組和不同時間點實驗組Robo3 mRNA相對表達量(* P < 0.05)
Figure1.
Relative expression of Robo3 mRNA in the control group and experimental groups (* P < 0.05)
3 Western blot
與PCR的結果相一致，在55kDa的位置上有陽性雜交帶。在對照組中，Robo3的表達量較低；與對照組相比，致癇后急性期大鼠海馬中Robo3的表達水平無明顯變化(P > 0.05)，而在致癇后的靜止期和慢性期則逐漸降低，分別為對照組的0.68倍和0.41倍，至慢性期達最低值(P < 0.05)。實驗組各組間的表達量均無明顯差異(P > 0.05)。見圖 2。
圖2
對照組和不同時間點實驗組Robo3蛋白的表達量(* P < 0.05)
Figure2.
Relative expression of Robo3 protein in the control group and experimental groups (* P < 0.05)
討論
癲癇的病因復雜，目前尚未有明確的定論，以往針對癲癇發病機制的研究發現，神經遞質異常、離子通道基因突變、神經膠質細胞功能異常、突觸聯系異常、遺傳因素等都與癲癇的發作密切相關[8]。而大量的研究發現，在基因或者其他不良環境的作用下，神經細胞會出現異常的電生理活動，進而導致神經細胞的異常生長，出現神經網絡的重組，這些異常的神經網絡又會導致神經細胞的興奮性增高，故癲癇與異常的突觸形成密切相關，這也是癲癇病因學假說的一種[9]。在TLE中，最主要的病理學特點就是在海馬的多個部位可見軸突出芽與突觸重建，所以在TLE發病機制的研究中，突觸機制開始受到越來越多的關注。
軸突導向因子參與軸突的形成過程，它們通過接觸吸引、接觸排斥、化學吸引、化學排斥參與軸突的生長調節。其在脊椎動物中樞神經正常發育過程中有著重要的作用，并且在成年的腦組織中仍然有著廣泛的表達，這就表明軸突導向分子可能參與了中樞神經系統興奮性網絡的調節。Robo家族是軸突導向因子Slits的配體，Robo3廣泛表達于中樞神經系統，1999年，Yuan等[10]首先克隆出Robo3基因，Chen等[11]在隨后的研究中發現，Robo3在脊髓的發育中的動態表達變化與Robo1、2不同，Robo1、2在沒有跨越中線以前為低表達，跨越中線后則出現高表達；而Robo3在跨越中線前后的表達變化剛好與Robo1、2相反。Rajagopalan等[12, 13]發現，如果Robo3發生突變，則軸突就會偏離原來的位置進行生長，從而影響神經發育。還有研究在小鼠的發育過程中發現，Robo3與Cajial-retzius(CR)細胞和中間神經元共表達于壁層和皮質邊緣，并且在Robo3基因突變的小鼠中，皮質的中間神經元的形態發生了變化，故推測Robo3可能參與了皮質發育過程中中間神經元的遷移和形態分化[14]。但關于Robo3是否參加了TLE海馬環路內的軸突出芽與突觸重建目前尚未有研究。而本實驗發現，在PILO致癇后的大鼠模型中，Robo3的表達量和對照組相比是有差異的：在靜止期和慢性期，Robo3的含量持續降低(P < 0.05)，并且在慢性期達到了最低值。如前述，Robo3需要與其下游信號分子結合后方可實現其生物學效應，以往的研究表明，Slit-Robo信號通路的下游分子為srGAP家族[15]，活化后的srGAP可以使Rho GTPases失活，而Rho GTPases在細胞骨架肌動蛋白的合成中有著重要的作用，并參與軸突的形成[16]。當Robo3的表達發生變化后，其下游被激活的srGAP家族也就會發生變化，從而引起軸突生長的異常。故猜測在正常的生理狀態下，軸突導向分子主要起到維持正常神經網絡的作用，而當神經元出現異常放電后，軸突導向分子及其受體的表達開始下調，軸突開始異位生長，建立起異常的神經網絡，導致了神經元的異常放電，從而誘發癲癇。且本實驗發現Robo3的含量在慢性期達到了最低值，而在慢性期模型中，大鼠出現癇性自發發作，也進一步證實Robo3表達量的降低與癲癇發作密切相關。
綜上所述，本實驗的研究發現，在LiCl-PILO的TLE大鼠模型中，Robo3在靜止期和慢性期的大鼠海馬中的表達隨著時間的推移逐漸降低，并且在慢性期達到了最低值，表明Robo3可能參與了TLE的病理生理過程，推測其可能通過軸突導向作用參與TLE海馬環路內的軸突出芽及突觸重建，從而促進了TLE的形成與發展。但其在疾病中扮演的具體角色還不清楚，需要進一步深入研究，從而為其成為高特異性、敏感性的生物標記物提供依據，為抗癲癇藥物的新的靶點提供方向。
癲癇是一種以神經元異常放電為特征的神經系統慢性疾病，而其中顳葉癲癇(Temporal lobe epilepsy, TLE)是常見的發作類型之一，在難治性癲癇中也是最常見的類型。目前關于TLE發生發展機制仍不明確，而探究其發病機制對于治療是至關重要的[1]。病理學研究發現軸突出芽、突觸重建是TLE最主要的病理學特征，而軸突導向分子為軸突出芽和突觸重建提供了導向作用[2]。在突觸形成過程中，許多因子都參與了這一過程，而軸突導向分子在軸突生長，突觸形成等方面有著重要作用。目前發現的軸突導向因子有四大類：Ephrins、Slits、Netrins和Semaphorins。其中Slit主要通過Robo介導對軸突生長的排斥反應參與神經軸突遷移，并且這種相互作用具有高度的遺傳保守性。Fang等[3]對TLE患者腦組織和TLE大鼠進行的研究發現，在TLE患者中，Slit2呈現高表達，且主要表達于神經元和神經膠質細胞，而正常人組織中則主要表達于神經元；而在TLE大鼠模型中發現，Slit2在急性期和靜止期表達逐漸下降，在慢性期表達則明顯上升，故推測Slit2分子與TLE異常神經網絡的形成密切相關。Robo家族(Robo 1~4)為跨膜蛋白，其中Robo1、2、3主要表達于神經系統，由胞外區、跨膜區、胞內區組成，其中胞外區由Ig樣功能區和纖維連接蛋白組成。信號傳遞至神經細胞內之后, 需要激活下游的信號分子發揮調節作用，引起細胞骨架成分的重組和細胞粘連的改變，影響神經元的遷移和神經纖維的生長[4, 5]。相關研究表明，Slit-Robo結合后可以調節細胞內Rho家族鳥苷三磷酸酶(RhoGTPase)的活性，從而調整骨架蛋白和激動蛋白在細胞內的分布，進而引導軸突的生長和神經細胞的遷移[6]。
Robo3是Robo家族中的一員，在中樞神經系統中廣泛表達[7]。本研究通過檢測TLE大鼠模型中Robo3的動態表達及變化規律，以探討其在TLE的發生發展過程的作用。
材料與方法
1 實驗動物與分組
SPF級健康雄性SD大鼠36只，體重230～250 g；由中南大學實驗動物中心提供，并飼養于適宜的環境中，給予正常飼料和飲水。大鼠隨機分為6組(n=6)：1個對照組和5個實驗組，5個實驗組分別采用氯化鋰-匹羅卡品(LiCl-PILO)腹腔注射致癇后1 d(急性期)，7、14 d(靜止期)，30、60 d(慢性期)進行取材；對照組注射等量生理鹽水。所有實驗均嚴格遵照中南大學動物倫理委員會規定進行。
2 動物模型建立
癲癇組大鼠先予LiCl(Sigma，美國)125 mg/kg腹腔注射，18 h再給予匹羅卡品(Pilocarpine, PILO，Sigma，美國)20 mg/kg腹腔注射。按Racine分級，癲癇發作達到Ⅳ級或以上的大鼠視為合格實驗模型。如大鼠發作等級未達Ⅳ級，則每30 min重復腹腔注射PILO 10 mg/kg，總共注射6次之后發作仍未達Ⅳ級則為致癇不成功。當大鼠癲癇發作達Ⅴ級或Ⅳ級以上并持續40 min后，所有大鼠給予10%水合氯醛3 mg/kg腹腔注射終止發作。對照組大鼠注射等量生理鹽水。
3 標本處理
10%水合氯醛3 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，去顱骨，快速取整個腦組織于冰床上，再分離出海馬組織，放入凍存管中，最后放入液氮中速凍后置于-80℃冰箱保存備用。
4 Quantitative RT-PCR檢測mRNA表達水平
用TRIzol(Invitrogen，美國)提取海馬組織總RNA，分光光度計測定波長260、280 nm的吸收值，樣品A260/A280在1.8~2.1為合格。使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(Takara，大連)將RNA逆轉錄成cDNA，GAPDH為內參基因, 兩者的引物設計如下: Robo3上游：5′-TTGGATCGAGCAAGTGAGTG-3′, 下游:5′-GTGGGTT TCCTTTGGTCTCA-3′; GAPDH上游：5′-CTCATGACC ACAGTCCATGC-3′, 下游：5′-TTCAGCTCTGGGATG ACCTT-3′。PCR設定反應條件如下：95℃5min，95℃20 s, 60℃30 s(40個循環)。利用7500 PCR系統軟件對信號進行分析，觀察擴增曲線、溶解曲線，每個實驗樣本重復三次，使用2-ΔΔCt法計算樣本的相對表達值，觀察Robo3 mRNA的表達水平。
5 Western blot檢測蛋白表達水平
將海馬組織至于研缽中，加入RIPA裂解液(普利萊，北京)在冰上搗碎，用BCA法測定蛋白濃度。分別配制10%的分離膠和4%的濃縮膠，將各組變性后的蛋白樣品加至每孔中，開始電泳，濃縮膠電泳電壓為80V，分離膠電泳電壓為120V，待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳。選取β-actin為內參基因。電泳結束后，以300 mA恒流轉膜1.5 h，用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉1 h后加入一抗(Robo3: Proteintech, 美國, 1 :200；β-actin: Proteintech, 美國, 1:4 000)，4℃孵育過夜，孵育結束后用TBST洗3次，每次15 min，再加入HRP標記的二抗(Proteintech, 美國，1 :3 000)，孵育45 min，結束后用TBST洗3次，每次15 min。最后用ECL發光液進行顯色曝光，采用proteinsimple化學發光儀器掃描收集圖像。
6 統計學方法
采用SPSS 20.0軟件包進行統計分析。各實驗組與對照組間所測得數據采用獨立樣本t檢驗方法進行數據分析，組間比較采用One-way ANOVA分析方法進行數據分析，所得結果采用均值±標準差表示，P值< 0.05為差異有統計學意義。
結果
1 動物行為學觀察
對照組大鼠無抽搐等異常表現，實驗組大鼠在腹腔注射PILO后開始出現癲癇樣發作，造模成功的大鼠中有3只大鼠分別在造模后1 d和3 d死亡，死亡率為6.8%。有4只大鼠一直未出現Ⅳ級或Ⅳ級以上發作，造模成功率為86.7%(26/30)。在慢性期的觀察中，有3只大鼠沒有出現自發癇性發作，予以剔除。
2 Quantitative RT-PCR
在對照組中，Robo3-mRNA的表達量較低；與對照組相比，致癇后急性期大鼠海馬中Robo3-mRNA的水平無明顯變化(P > 0.05)，而在致癇后的靜止期和慢性期則逐漸降低，分別為對照組的0.67倍和0.53倍，至慢性期達最低值(P < 0.05)。實驗組各組間的表達量均無統計學差異(P > 0.05)。見圖 1。
圖1
對照組和不同時間點實驗組Robo3 mRNA相對表達量(* P < 0.05)
Figure1.
Relative expression of Robo3 mRNA in the control group and experimental groups (* P < 0.05)
3 Western blot
與PCR的結果相一致，在55kDa的位置上有陽性雜交帶。在對照組中，Robo3的表達量較低；與對照組相比，致癇后急性期大鼠海馬中Robo3的表達水平無明顯變化(P > 0.05)，而在致癇后的靜止期和慢性期則逐漸降低，分別為對照組的0.68倍和0.41倍，至慢性期達最低值(P < 0.05)。實驗組各組間的表達量均無明顯差異(P > 0.05)。見圖 2。
圖2
對照組和不同時間點實驗組Robo3蛋白的表達量(* P < 0.05)
Figure2.
Relative expression of Robo3 protein in the control group and experimental groups (* P < 0.05)
討論
癲癇的病因復雜，目前尚未有明確的定論，以往針對癲癇發病機制的研究發現，神經遞質異常、離子通道基因突變、神經膠質細胞功能異常、突觸聯系異常、遺傳因素等都與癲癇的發作密切相關[8]。而大量的研究發現，在基因或者其他不良環境的作用下，神經細胞會出現異常的電生理活動，進而導致神經細胞的異常生長，出現神經網絡的重組，這些異常的神經網絡又會導致神經細胞的興奮性增高，故癲癇與異常的突觸形成密切相關，這也是癲癇病因學假說的一種[9]。在TLE中，最主要的病理學特點就是在海馬的多個部位可見軸突出芽與突觸重建，所以在TLE發病機制的研究中，突觸機制開始受到越來越多的關注。
軸突導向因子參與軸突的形成過程，它們通過接觸吸引、接觸排斥、化學吸引、化學排斥參與軸突的生長調節。其在脊椎動物中樞神經正常發育過程中有著重要的作用，并且在成年的腦組織中仍然有著廣泛的表達，這就表明軸突導向分子可能參與了中樞神經系統興奮性網絡的調節。Robo家族是軸突導向因子Slits的配體，Robo3廣泛表達于中樞神經系統，1999年，Yuan等[10]首先克隆出Robo3基因，Chen等[11]在隨后的研究中發現，Robo3在脊髓的發育中的動態表達變化與Robo1、2不同，Robo1、2在沒有跨越中線以前為低表達，跨越中線后則出現高表達；而Robo3在跨越中線前后的表達變化剛好與Robo1、2相反。Rajagopalan等[12, 13]發現，如果Robo3發生突變，則軸突就會偏離原來的位置進行生長，從而影響神經發育。還有研究在小鼠的發育過程中發現，Robo3與Cajial-retzius(CR)細胞和中間神經元共表達于壁層和皮質邊緣，并且在Robo3基因突變的小鼠中，皮質的中間神經元的形態發生了變化，故推測Robo3可能參與了皮質發育過程中中間神經元的遷移和形態分化[14]。但關于Robo3是否參加了TLE海馬環路內的軸突出芽與突觸重建目前尚未有研究。而本實驗發現，在PILO致癇后的大鼠模型中，Robo3的表達量和對照組相比是有差異的：在靜止期和慢性期，Robo3的含量持續降低(P < 0.05)，并且在慢性期達到了最低值。如前述，Robo3需要與其下游信號分子結合后方可實現其生物學效應，以往的研究表明，Slit-Robo信號通路的下游分子為srGAP家族[15]，活化后的srGAP可以使Rho GTPases失活，而Rho GTPases在細胞骨架肌動蛋白的合成中有著重要的作用，并參與軸突的形成[16]。當Robo3的表達發生變化后，其下游被激活的srGAP家族也就會發生變化，從而引起軸突生長的異常。故猜測在正常的生理狀態下，軸突導向分子主要起到維持正常神經網絡的作用，而當神經元出現異常放電后，軸突導向分子及其受體的表達開始下調，軸突開始異位生長，建立起異常的神經網絡，導致了神經元的異常放電，從而誘發癲癇。且本實驗發現Robo3的含量在慢性期達到了最低值，而在慢性期模型中，大鼠出現癇性自發發作，也進一步證實Robo3表達量的降低與癲癇發作密切相關。
綜上所述，本實驗的研究發現，在LiCl-PILO的TLE大鼠模型中，Robo3在靜止期和慢性期的大鼠海馬中的表達隨著時間的推移逐漸降低，并且在慢性期達到了最低值，表明Robo3可能參與了TLE的病理生理過程，推測其可能通過軸突導向作用參與TLE海馬環路內的軸突出芽及突觸重建，從而促進了TLE的形成與發展。但其在疾病中扮演的具體角色還不清楚，需要進一步深入研究，從而為其成為高特異性、敏感性的生物標記物提供依據，為抗癲癇藥物的新的靶點提供方向。
