引用本文： 張紹輝, 梁樹立, 于曉曼, 柴旭斌, 張麗敏, 梁爽爽. 電引導治療新皮層癲癇大鼠的有效性研究. 癲癇雜志, 2016, 2(1): 38-42. doi: 10.7507/2096-0247.20160008 復制
盡管新型抗癲癇藥物不斷出現，30%左右的癲癇仍難以控制[1, 2]。其中一些新皮層癲癇患者可以采用手術切除或神經調控的方法控制癲癇發作[3, 4]。當前癲癇的治療方法包括藥物、手術和神經調控治療等，其治療原理主要為三個方面[5-8]：①去除癲癇病灶，包括切除性手術、立體定向射頻毀損治療、立體定向放射治療等；②阻斷癲癇的放電傳導通路，包括多軟膜下橫切術和胼胝體切開術等；③降低大腦興奮性，包括藥物和神經調控治療等。現有治療的基本觀念是去除或抑制癲癇灶，但仍有眾多的新皮層癲癇患者不適合當前的手術治療或者通過手術后仍有頻繁的癲癇發作[9, 10]，因此，需要新的有效治療方法。我們試圖采用顱內-顱外電分流，而不是抑制放電的方法治療癲癇，我們自2008年開始進行電引導治療新皮層部分性癲癇大鼠的實驗研究，取得了初步的結果，并獲得專利[11]。現報道如下。
材料與方法
1 實驗動物及分組
清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重230~260g；從解放軍總醫院第一附屬醫院動物實驗室購置。將大鼠分為空白對照組和模型組；模型組大鼠再分為：引導組，假引導組，模型對照組；共4組，每組15只。
2 各種電極制備
共三種電極。記錄電極頭端為直徑0.5 mm的銀針，尾端為直徑1.5 mm的手柄，除頭端1 mm和尾端4 mm外，中間加涂聚丙烯絕緣層并用硅膠管包裹。引導電極[11]為頭端直徑4 mm的圓片狀銀合金電極，一面裸露，另一面包裹于硅膠片內，尾端為直徑4 mm的圓片狀銀合金電極，雙面裸露，中間有長15 mm，直徑0.5 mm的銀合金連接線，外涂聚丙烯絕緣層并被包裹于硅膠管中(圖 1)。假引導電極為頭端、連續線與引導電極相同，尾端為直徑4 mm的圓片狀銀合金電極，雙面涂聚丙烯絕緣并包裹于硅膠片中。
圖1
引導電極示意圖
Figure1.
Schematic view of electrode
3 大鼠新皮層癲癇模型的制備
應用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉大鼠。置于腦立體定位儀(David Kopf Instruments, 美國)上，定位暴露皮層位置：前囟后1~6 mm，矢狀縫右側1~6 mm，用牙科鉆顱骨打孔，顯微鏡下切開硬腦膜，去除蛛網膜結構。將青霉素粉用生理鹽水稀釋為200 U/μL，微量注射器吸取青霉素液1μL，緩慢(0.01μL/s)注入中央區皮層組織(前囪后2 mm，矢狀縫右側2 mm區域，顱骨下2.2 mm)。立即開始腦電圖(EEG)記錄(方法見EEG記錄部分)，20 min內記錄到明確癲癇波確定為成功癲癇模型。空白對照組方法與模型建立相同，僅用同體積量生理鹽水替代青霉素液進行模型建立。
4 腦電圖記錄
利用立體定向儀將記錄電極T4垂直置入新皮層區域(前囟后3 mm，矢狀縫右側1.5 mm，皮層表面垂直下1.5 mm)，同時將記錄電極T6置于右側海馬CA1區(前囟后5.6 mm，矢狀縫右4.5 mm，皮層表面垂直3 mm)。將T4和T6電極用牙托水泥固定于顱骨表面。參考電極置于右側耳后皮下。通過電極線連接于Nicolet腦電圖記錄儀。各組在動物處理完成后，在麻醉狀態下連續記錄EEG 2 h。癲癇放電定義為：明顯突出于背景的EEG活動，波幅在背景EEG 3倍以上、≥5 Hz尖波發放持續2 s以上[12]。如果癲癇放電局限于F4，定義為局灶性放電；如果癲癇放電累及T4和T6，定義為擴散的癲癇放電。
5 引導電極的植入
選擇癲癇模型建立成功大鼠，按照引導組、假引導組將相應電極頭端置于注射點為中心的皮層區域，應確保引導組電極頭端裸露面與皮層良好接觸，用牙托水泥固定于顱骨表面，電極末端金屬片置于項部皮下，縫合頭皮。
6 行為學觀察
每只大鼠復蘇后置于一個籠內單獨飼養，飼養環境為：溫度20~23℃，12 h白天/12 h黑暗，濕度50%。進行錄像監測，連續觀察大鼠2 d內癲癇發作情況。癲癇發作的判定依據Racine分級：0.5下頜陣攣；1對側前肢的肌痙攣；2雙側前肢的輕度陣攣；3雙側前肢的明顯陣攣；4伴有后肢站立的雙側前肢明顯陣攣；5全身抽搐并摔倒。為保證癲癇發作統計的準確性，錄像中大鼠癲癇發作由2名經過培訓的人員共同認定。由于Racine 0.5~2級發作在青霉素模型大鼠早期非常頻繁，計數困難，同時不同人員認定差異較大，故將癲癇發作定義在Racine 3~5級發作進行計數。
7 流式細胞術檢測細胞凋亡率
完成行為學觀察后，SD大鼠快速斷頭取腦，分離新鮮腦組織，取右側前囪后1~3 mm，矢狀縫右側1~3 mm區域皮層灰質結構于盛有5 mL培養基(加入5%胎牛血清)15 mL離心管中；處理并采用細胞計數板于光學顯微鏡下觀察細胞形態及計數，將細胞懸液配成1×106個/mL。各組細胞采用Annexin V-FITC/PI雙標記染色，每份取100 mL單細胞懸液，每組做成3份復管，然后各加入490 mL工作濃度的結合緩沖液、5mL Annexin V-FITC和5mL PI染料輕輕振蕩、混勻。置4℃冷藏室中染色10 min。將Annexin V-FITC/PI熒光標記染色成功的細胞樣品，取100μL細胞懸液，利用流式細胞儀(BD公司，USA)進行雙參數分析，經488 nm的激發光激發，衩激發的細胞發射525 nm綠色熒光和610 nm的紅色熒光。分別用不同的熒光通道接收，然后用LMD軟件進行分析，測定凋亡細胞百分率。
8 統計學方法
采用SPSS 18.0統計軟件包進行分析。計數資料采用均數±標準差表示，多組之間計數資料均采用F檢查。P值< 0.05為差異有統計學意義。
結果
1 實驗模型建立
模型組45只大鼠共成功建立癲癇模型41只，成功率為91.1%；引導組和假引導組各14只，模型對組13只。
2 腦電圖監測
空白對照組僅記錄到2只大鼠散在癲癇樣波，但未監測到癲癇放電。模型組EEG監測到癲癇放電次數見表 1、圖 2。癲癇放電次數假引導組和模型對照組最多，以F4為主，并明顯向T6擴散。癲癇放電次數和擴散癲癇放電次數三組比較有統計學差異，引導組癲癇放電次數明顯低于假引導組(P < 0.01)和模型對照組(P < 0.01)，局灶性放電三組比較無統計學差異(P=0.1344)。
表1
各組腦電圖癲癇放電及行為學癲癇發作平均次數(
圖2
實驗大鼠EEG
a空白對照組，無明顯癲癇波出現；b監測到皮層散在高幅癲癇波，并向CA1區擴散，向新皮層擴散但未形成連續性癲癇放電；c 8Hz連續癲癇放電；d引導組散在中幅皮層癲癇波，未形成擴散及連續性癲癇放電，T4為右側中央區新皮層腦電圖，T6為右側CA1區
Figure2. EEG of experimental rats.a. Control group, no obvious seizure waves; b. High amplitude wave in cortial, spread to CA1 area, but not continuous seizure discharge; c. 8 Hz continuous seizure dischange; d. Conductin group, medium amplitude wave in cortical, undiffeused and un-continuous seizure discharge, T4 is the new cortical EEG in right central area, T6 is the right CA1 area.
3 行為學觀察
視頻監測未記錄到空白對照組癲癇發作，其余模型組均記錄到癲癇發作，行為學癲癇發作次數見表 1。第1天(P=0.000 4)和第2天(P=0.000 9)三組癲癇發作次數比較有統計學意義。模型對照組與假引導組比較無統計學意義，引導組均明顯低于模型對照組和假引導組(P < 0.01)，見表 1。
4 細胞凋亡率
空白對照組細胞凋亡率最低，為1.23%±0.93%；模型對照組最高，為9.12%±2.62%，而假引導組為9.56%±3.19%，引導組為3.51%±1.43%。模型對照組、假引導組和引導組與空白對照組比較有統計學意義(P < 0.001)。引導組細胞凋亡率顯著低于模型對照組和假引導組(P < 0.001)。
討論
現有癲癇治療的基本理念均是“抑制”，而本研究的出發點是將癲癇發作起始時的瞬間爆發性高電壓放電引導到顱外低電壓區域，從而避免更多超同步化放電的募集效應，也就防止癲癇的產生和擴散。盡管在Pubmed(1960-2013)上未檢查到前期相關研究，但從臨床工作中我們仍然可以發現相關的理論支持：①EEG屬于微弱的生物電，但無論是頭皮EEG還是腦深部電刺激術中的微電極記錄儀均可記錄到局部神經元或單個神經元的電信號[8, 13]，從側面也說明了電信號通過相關設備可以引導到顱外區域，這是電引導治療的基礎；②顱內電極EEG的記錄中可以發現癲癇灶有固定的起源、相對固定的傳導通路和通常有數秒的傳導時間[14]，這與生理性電信號毫秒級的傳導時間不同，可能與癲癇發作時的抑制性因素激活有關[15]，這些為顱內-顱外引導電活動提供了可能；③癲癇發作時顱內電極記錄到1 000~3 000μV的電活動，是頭皮EEG背景活動(25 ~ 75μV)的40倍左右[14]，而且在時間上早于頭皮EEG電位的增高，這為電引層治療提高了保障。
本研究表明顱內-顱外電引導治療癲癇的有效性。引導組EEG監測到的癲癇放電次數由模型組的10.08次，減少到4.21次，減少了58%，特別是擴散性癲癇放電次數較模型組減少達到71%。然而需要注意的引導組的局灶性癲癇放電與模型對照組及假引導組并沒有統計學差異，分析原因可能是一些擴散性癲癇放電經過電引導治療后變成了局限性放電，所以出現局灶性放電減少不明顯，而擴散性放電減少更為突出的現象。EEG的結果在行為學中也得到了同樣的驗證，第1天癲癇發作減少54%，第2天達到70%。癲癇發作對神經元的損害是癲癇的主要危害之一，本研究中顯示電引導治療后細胞凋亡率由假引導組的9.56%，下降到3.51%，減少了63%，也說明了電引導治療對癲癇發作繼發神經元損害的保護作用。
青霉素誘發的新皮層癲癇大鼠是一種成熟癲癇模型，其作用機制可能與阻斷γ-氨基丁酸介導的抑制性突觸后電位有關，模型致癇區域明確局限，便于開展相關研究，本組模型成功率達到91%，證實了青霉素誘發癲癇模型的穩定性。但青霉素模型是一種急性癲癇模型，可見各實驗組的癲癇發作均為第1天最高，第2天下降超過80%，所以我們的實驗僅觀察大鼠2 d的癲癇發作情況。
本研究表明電引導治療SD大鼠新皮層癲癇是有效性的，可以明顯減少癲癇放電和行為學癲癇發作，并降低細胞凋亡率。但有關顱內-顱外電引導治療癲癇的機制和氨基酸遞質變化等相關指標有待更深入研究。
盡管新型抗癲癇藥物不斷出現，30%左右的癲癇仍難以控制[1, 2]。其中一些新皮層癲癇患者可以采用手術切除或神經調控的方法控制癲癇發作[3, 4]。當前癲癇的治療方法包括藥物、手術和神經調控治療等，其治療原理主要為三個方面[5-8]：①去除癲癇病灶，包括切除性手術、立體定向射頻毀損治療、立體定向放射治療等；②阻斷癲癇的放電傳導通路，包括多軟膜下橫切術和胼胝體切開術等；③降低大腦興奮性，包括藥物和神經調控治療等。現有治療的基本觀念是去除或抑制癲癇灶，但仍有眾多的新皮層癲癇患者不適合當前的手術治療或者通過手術后仍有頻繁的癲癇發作[9, 10]，因此，需要新的有效治療方法。我們試圖采用顱內-顱外電分流，而不是抑制放電的方法治療癲癇，我們自2008年開始進行電引導治療新皮層部分性癲癇大鼠的實驗研究，取得了初步的結果，并獲得專利[11]。現報道如下。
材料與方法
1 實驗動物及分組
清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重230~260g；從解放軍總醫院第一附屬醫院動物實驗室購置。將大鼠分為空白對照組和模型組；模型組大鼠再分為：引導組，假引導組，模型對照組；共4組，每組15只。
2 各種電極制備
共三種電極。記錄電極頭端為直徑0.5 mm的銀針，尾端為直徑1.5 mm的手柄，除頭端1 mm和尾端4 mm外，中間加涂聚丙烯絕緣層并用硅膠管包裹。引導電極[11]為頭端直徑4 mm的圓片狀銀合金電極，一面裸露，另一面包裹于硅膠片內，尾端為直徑4 mm的圓片狀銀合金電極，雙面裸露，中間有長15 mm，直徑0.5 mm的銀合金連接線，外涂聚丙烯絕緣層并被包裹于硅膠管中(圖 1)。假引導電極為頭端、連續線與引導電極相同，尾端為直徑4 mm的圓片狀銀合金電極，雙面涂聚丙烯絕緣并包裹于硅膠片中。
圖1
引導電極示意圖
Figure1.
Schematic view of electrode
3 大鼠新皮層癲癇模型的制備
應用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉大鼠。置于腦立體定位儀(David Kopf Instruments, 美國)上，定位暴露皮層位置：前囟后1~6 mm，矢狀縫右側1~6 mm，用牙科鉆顱骨打孔，顯微鏡下切開硬腦膜，去除蛛網膜結構。將青霉素粉用生理鹽水稀釋為200 U/μL，微量注射器吸取青霉素液1μL，緩慢(0.01μL/s)注入中央區皮層組織(前囪后2 mm，矢狀縫右側2 mm區域，顱骨下2.2 mm)。立即開始腦電圖(EEG)記錄(方法見EEG記錄部分)，20 min內記錄到明確癲癇波確定為成功癲癇模型。空白對照組方法與模型建立相同，僅用同體積量生理鹽水替代青霉素液進行模型建立。
4 腦電圖記錄
利用立體定向儀將記錄電極T4垂直置入新皮層區域(前囟后3 mm，矢狀縫右側1.5 mm，皮層表面垂直下1.5 mm)，同時將記錄電極T6置于右側海馬CA1區(前囟后5.6 mm，矢狀縫右4.5 mm，皮層表面垂直3 mm)。將T4和T6電極用牙托水泥固定于顱骨表面。參考電極置于右側耳后皮下。通過電極線連接于Nicolet腦電圖記錄儀。各組在動物處理完成后，在麻醉狀態下連續記錄EEG 2 h。癲癇放電定義為：明顯突出于背景的EEG活動，波幅在背景EEG 3倍以上、≥5 Hz尖波發放持續2 s以上[12]。如果癲癇放電局限于F4，定義為局灶性放電；如果癲癇放電累及T4和T6，定義為擴散的癲癇放電。
5 引導電極的植入
選擇癲癇模型建立成功大鼠，按照引導組、假引導組將相應電極頭端置于注射點為中心的皮層區域，應確保引導組電極頭端裸露面與皮層良好接觸，用牙托水泥固定于顱骨表面，電極末端金屬片置于項部皮下，縫合頭皮。
6 行為學觀察
每只大鼠復蘇后置于一個籠內單獨飼養，飼養環境為：溫度20~23℃，12 h白天/12 h黑暗，濕度50%。進行錄像監測，連續觀察大鼠2 d內癲癇發作情況。癲癇發作的判定依據Racine分級：0.5下頜陣攣；1對側前肢的肌痙攣；2雙側前肢的輕度陣攣；3雙側前肢的明顯陣攣；4伴有后肢站立的雙側前肢明顯陣攣；5全身抽搐并摔倒。為保證癲癇發作統計的準確性，錄像中大鼠癲癇發作由2名經過培訓的人員共同認定。由于Racine 0.5~2級發作在青霉素模型大鼠早期非常頻繁，計數困難，同時不同人員認定差異較大，故將癲癇發作定義在Racine 3~5級發作進行計數。
7 流式細胞術檢測細胞凋亡率
完成行為學觀察后，SD大鼠快速斷頭取腦，分離新鮮腦組織，取右側前囪后1~3 mm，矢狀縫右側1~3 mm區域皮層灰質結構于盛有5 mL培養基(加入5%胎牛血清)15 mL離心管中；處理并采用細胞計數板于光學顯微鏡下觀察細胞形態及計數，將細胞懸液配成1×106個/mL。各組細胞采用Annexin V-FITC/PI雙標記染色，每份取100 mL單細胞懸液，每組做成3份復管，然后各加入490 mL工作濃度的結合緩沖液、5mL Annexin V-FITC和5mL PI染料輕輕振蕩、混勻。置4℃冷藏室中染色10 min。將Annexin V-FITC/PI熒光標記染色成功的細胞樣品，取100μL細胞懸液，利用流式細胞儀(BD公司，USA)進行雙參數分析，經488 nm的激發光激發，衩激發的細胞發射525 nm綠色熒光和610 nm的紅色熒光。分別用不同的熒光通道接收，然后用LMD軟件進行分析，測定凋亡細胞百分率。
8 統計學方法
采用SPSS 18.0統計軟件包進行分析。計數資料采用均數±標準差表示，多組之間計數資料均采用F檢查。P值< 0.05為差異有統計學意義。
結果
1 實驗模型建立
模型組45只大鼠共成功建立癲癇模型41只，成功率為91.1%；引導組和假引導組各14只，模型對組13只。
2 腦電圖監測
空白對照組僅記錄到2只大鼠散在癲癇樣波，但未監測到癲癇放電。模型組EEG監測到癲癇放電次數見表 1、圖 2。癲癇放電次數假引導組和模型對照組最多，以F4為主，并明顯向T6擴散。癲癇放電次數和擴散癲癇放電次數三組比較有統計學差異，引導組癲癇放電次數明顯低于假引導組(P < 0.01)和模型對照組(P < 0.01)，局灶性放電三組比較無統計學差異(P=0.1344)。
表1
各組腦電圖癲癇放電及行為學癲癇發作平均次數(
圖2
實驗大鼠EEG
a空白對照組，無明顯癲癇波出現；b監測到皮層散在高幅癲癇波，并向CA1區擴散，向新皮層擴散但未形成連續性癲癇放電；c 8Hz連續癲癇放電；d引導組散在中幅皮層癲癇波，未形成擴散及連續性癲癇放電，T4為右側中央區新皮層腦電圖，T6為右側CA1區
Figure2. EEG of experimental rats.a. Control group, no obvious seizure waves; b. High amplitude wave in cortial, spread to CA1 area, but not continuous seizure discharge; c. 8 Hz continuous seizure dischange; d. Conductin group, medium amplitude wave in cortical, undiffeused and un-continuous seizure discharge, T4 is the new cortical EEG in right central area, T6 is the right CA1 area.
3 行為學觀察
視頻監測未記錄到空白對照組癲癇發作，其余模型組均記錄到癲癇發作，行為學癲癇發作次數見表 1。第1天(P=0.000 4)和第2天(P=0.000 9)三組癲癇發作次數比較有統計學意義。模型對照組與假引導組比較無統計學意義，引導組均明顯低于模型對照組和假引導組(P < 0.01)，見表 1。
4 細胞凋亡率
空白對照組細胞凋亡率最低，為1.23%±0.93%；模型對照組最高，為9.12%±2.62%，而假引導組為9.56%±3.19%，引導組為3.51%±1.43%。模型對照組、假引導組和引導組與空白對照組比較有統計學意義(P < 0.001)。引導組細胞凋亡率顯著低于模型對照組和假引導組(P < 0.001)。
討論
現有癲癇治療的基本理念均是“抑制”，而本研究的出發點是將癲癇發作起始時的瞬間爆發性高電壓放電引導到顱外低電壓區域，從而避免更多超同步化放電的募集效應，也就防止癲癇的產生和擴散。盡管在Pubmed(1960-2013)上未檢查到前期相關研究，但從臨床工作中我們仍然可以發現相關的理論支持：①EEG屬于微弱的生物電，但無論是頭皮EEG還是腦深部電刺激術中的微電極記錄儀均可記錄到局部神經元或單個神經元的電信號[8, 13]，從側面也說明了電信號通過相關設備可以引導到顱外區域，這是電引導治療的基礎；②顱內電極EEG的記錄中可以發現癲癇灶有固定的起源、相對固定的傳導通路和通常有數秒的傳導時間[14]，這與生理性電信號毫秒級的傳導時間不同，可能與癲癇發作時的抑制性因素激活有關[15]，這些為顱內-顱外引導電活動提供了可能；③癲癇發作時顱內電極記錄到1 000~3 000μV的電活動，是頭皮EEG背景活動(25 ~ 75μV)的40倍左右[14]，而且在時間上早于頭皮EEG電位的增高，這為電引層治療提高了保障。
本研究表明顱內-顱外電引導治療癲癇的有效性。引導組EEG監測到的癲癇放電次數由模型組的10.08次，減少到4.21次，減少了58%，特別是擴散性癲癇放電次數較模型組減少達到71%。然而需要注意的引導組的局灶性癲癇放電與模型對照組及假引導組并沒有統計學差異，分析原因可能是一些擴散性癲癇放電經過電引導治療后變成了局限性放電，所以出現局灶性放電減少不明顯，而擴散性放電減少更為突出的現象。EEG的結果在行為學中也得到了同樣的驗證，第1天癲癇發作減少54%，第2天達到70%。癲癇發作對神經元的損害是癲癇的主要危害之一，本研究中顯示電引導治療后細胞凋亡率由假引導組的9.56%，下降到3.51%，減少了63%，也說明了電引導治療對癲癇發作繼發神經元損害的保護作用。
青霉素誘發的新皮層癲癇大鼠是一種成熟癲癇模型，其作用機制可能與阻斷γ-氨基丁酸介導的抑制性突觸后電位有關，模型致癇區域明確局限，便于開展相關研究，本組模型成功率達到91%，證實了青霉素誘發癲癇模型的穩定性。但青霉素模型是一種急性癲癇模型，可見各實驗組的癲癇發作均為第1天最高，第2天下降超過80%，所以我們的實驗僅觀察大鼠2 d的癲癇發作情況。
本研究表明電引導治療SD大鼠新皮層癲癇是有效性的，可以明顯減少癲癇放電和行為學癲癇發作，并降低細胞凋亡率。但有關顱內-顱外電引導治療癲癇的機制和氨基酸遞質變化等相關指標有待更深入研究。
